全 文 ：第40卷 第1期 林 业 科 技 Vol. 40 No. 1
2 0 1 5 年 1 月 FOＲESTＲY SCIENCE ＆ TECHNOLOGY Jan． 2 0 1 5
文章编号:1001 － 9499 (2015)01 － 0006 － 05
胁迫下欧李 AOX及 UCP基因家族表达分析
*
胡银松 高文蕊 王瑞芳 张宜欣 宋兴舜＊＊
(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要:在干旱和水杨酸(salicylic acid，SA)胁迫下，检测欧李叶片中交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)及解偶
联蛋白(uncoupling protein，UCP)基因家族的表达情况，以期为两基因家族在胁迫下的作用提供基础研究的依据。
通过使用特异性引物和 SYBＲ GreenⅠ，结合染料实时荧光定量 ＲT-PCＲ 技术，以管家基因 actin 基因为参照基
因，采用相对定量的方法，对欧李叶片 AOX家族及 UCP家族进行差异表达分析。研究结果表明，干旱胁迫时，
AOX4、UCP3、UCP4 和 UCP5 在 8 天时表达量最大，之后有所下降;AOX1b、UCP1 和 UCP2 表达量不断升高直
到 12 天达到峰值，而 AOX1a 和 AOX2 的变化并不明显。SA 处理 3 天时，仅 UCP2 的表达量有所上升，其他
AOX家族和 UCP家族成员的表达量都不同程度下降。
关键词:欧李;交替氧化酶(AOX);解偶联蛋白(UCP);ＲT-PCＲ;水杨酸
中图分类号:S 662. 3，S 601 文献标识码:A
欧李(Prunus humilis)，蔷薇科樱桃属矮生灌
木果树，经济价值极高。其果肉可食，仁可入药，
茎可作为饲料和编织材料，开发利用前景非常广
阔。同时，欧李在绿化美化环境、治理荒山沙漠、
防治水土流失等方面具有特殊效用，是干旱地区
生态环境建设的先锋树种［1 － 2］。
交替氧化酶(AOX)为线粒体内膜上呼吸链中
抗氰呼吸途径末端的氧化酶，广泛存在于高等植
物、真菌、藻类、部分寄生虫及原核生物中，它
能够催化辅酶 Q 氧化、氧分子还原产生 H2O
［3］。
解偶联蛋白(UCP)是位于线粒体内膜的一种质子
转运蛋白，可以使 H +从线粒体内膜渗透到线粒体
基质中，驱散质子梯度，使呼吸链的氧化作用与
ADP 的磷酸化作用解偶联［4］。AOX 和 UCP 在植
物产热的过程、果实成熟的过程和增强植物抵御
逆境胁迫性能过程中有着密切联系。逆境胁迫下，
AOX和 UCP共同形成抗氧化防御体系，保护植物
线粒体免受氧化损伤［5］。目前，欧李的抗逆性研
究较少，无逆境下 AOX 和 UCP 表达分析的报道。
因此，本研究采用荧光定量 PCＲ 技术，通过对荧
光信号的实时检测，快速、灵敏地对核酸进行定
量检测［6 － 8］，旨在分析 AOX家族及 UCP家族各成
员在胁迫环境下的表达水平，为进行以上两基因
家族的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
3 年生欧李幼苗由北京怀柔县引进，移栽于
东北林业大学生命科学院实验室进行盆载培养，
室内温度 25℃，温度 40%，培养基质为黑土和蛭
石混合物 (黑土∶蛭石 = 2∶ 1);每周浇水 3 次，以
水面没过基质 1 cm为宜。在实验室内进行干旱胁
迫和 SA处理，分别在干旱胁迫(停止浇水)0、4、
8、12 天和 1 mmol /L SA 喷施处理 3 天(早晚各 1
次)时取样;样品采集后立即置于 － 80℃冰箱中保
存直至总 ＲNA 提取。
试验用其他材料:植物总 ＲNA抽提试剂盒和
PCＲ产物回收试剂盒(Omega Bio － Tek 公司);
ＲNA清洁纯化试剂盒(北京原平皓生物技术有限
公 司 ); AMV Ｒeverse Transcriptase、 ＲNase
inhibitor、Oligo d(T)18(Thermo Scientific 公司);
* 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DL11EA019);国家自然科学基金资助项目(31170569)
第 1 期 胡银松等:胁迫下欧李 AOX及 UCP基因家族表达分析
dNTP Mixture、 2 × EasyTaq PCＲ SuperMix、
TransStart Top Green qPCＲ SuperMix 和 Trans2K
DNA Marker(全式金生物技术)。
1. 2 方 法
1. 2. 1 欧李总 ＲNA提取及反转录
称取冻存的欧李叶片 0. 1 g，经液氮研磨，组
织匀浆后，用植物总 ＲNA 抽提试剂盒提取总
ＲNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计
检测浓度及纯度，然后进行消化、纯化。
消化体系:ＲNA 5 μg，10 × Buffer 5 μL，
DNase I 3 μL，灭菌 DEPC水补足 20 μL 体系，置
于 PCＲ 仪中，37℃反应 30 min，然后 65℃反应
10 min终止反应。用 ＲNA 清洁纯化试剂盒纯化
ＲNA，1% 琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度
计检测浓度及纯度，然后进行反转录。
反转录体系:ＲNA 1μg，Oligo(dT)(20 μmol /
L)4. 3 μL，水补足 12. 5 μL，65℃反应 5 min。再
加入 5 × Buffer 4 μL，ＲNase Inhibitor 0. 5 μL，
dNTP 4 μL，反转录酶 1 μL，42℃反应 2h，70℃
反应 10 min终止反应; － 20℃冻存备用。
1. 2. 2 引物的设计及合成
根据欧李转录组测序结果，AOX 家族 4 成
员:AOX 1a、AOX 1b、AOX 2 和 AOX 4;UCP家
族包括 TC 12700、TD 4932、TD 6937、TD 6938
和 TC 25478，分别命名为 UCP1、UCP2、UCP3、
UCP4 和 UCP5。利用 Primer Premier 5. 0 软件分析
各基因序列并设计引物(表 1)。引物由华大基因
科技公司合成。
表 1 实时定量 PCＲ引物
名 称 序 列 名 称 序 列
AOX1a － F CGTTGGCGGAGAAGGAA UCP1 － Ｒ TGAGCCAATACAGACAGCA
AOX1a － Ｒ TCTTCGGCTCATGGTGCT UCP2 － F CTTTGAAGTATGAGGGATTT
AOX1b － F ACTTGACGGTCCAGTAAGCC UCP2 － Ｒ CAGTGGAAGGGAAGTAGC
AOX1b － Ｒ GCAATAAAGATGAGAAAGGGAT UCP3 － F TCCACATTGTTGGCTTGA
AOX2 － F CAACCGCTACATTTCCACT UCP3 － Ｒ TGATGGGAGATTCTGCTT
AOX2 － Ｒ CAACGCTATCACTTCCTTTC UCP4 － F CGCTTTCTCCGCTTGT
AOX4 － F ATACAGGCGGTTTGCG UCP4 － Ｒ GACCTTCTTCCCTGGCTAT
AOX4 － Ｒ GCTTTAATATGCGGTGGC UCP5 － F CACTCATCTCCTAGCTGGTC
UCP1 － F AGTGACTTCGTCGGAGATG UCP5 － Ｒ TGTCTTCACGGAAACTCAA
1. 2. 3 ＲT-PCＲ及荧光定量 PCＲ
将反转录产物稀释 10 倍作为 PCＲ 模板。
PCＲ反应体系:稀释后的 cDNA 4 μL，正向引物
(10 μmol /L)1 μL，反向引物(10 μmol /L)1 μL，
2 × EasyTaq PCＲ SuperMix 10 μL，用 ddH 2O补足
总体积 20 μL。反应条件:94℃反应 3 min，94℃
反应 30 s，退火温度 30 s，72℃反应 30 s，共 35
个循环，72℃延伸 5 min。取 3 μL PCＲ 产物进行
1% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用 Bio-Ｒad成像分析
仪照相。
荧光定量 PCＲ 在实时定量 PCＲ 仪(Ｒoche 公
司)上进行。在定量 PCＲ 专用的反应板中加入
TransStart Top Green qPCＲ SuperMix 10 μL，
10 μmol /L引物各 1 μL，H2O 4 μL，待测样品
cDNA 各 4 μL，总反应体系为 20 μL，每个样品
做 3 个重复。反应条件为:94℃预变性 3 min，
94℃变性 30 s，退火 30 s，72℃延伸 30 s，50 个
循环，72℃采集荧光。结束后做 95 ～ 65℃ 的熔解
曲线分析。反应结束后分析试验结果，采用
Origin7. 5 作图。
2 试验结果与分析
2. 1 欧李总 ＲNA 的提取
取 1. 5 μL 总 ＲNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳检
测后，28S ＲNA 和 18S ＲNA 条带明亮清晰，28S
ＲNA 条带的亮度约为 18S ＲNA 条带的 2 倍，完整
性好、无降解。OD260 /OD280 均在 1. 8 ～ 2. 0 之
间，表明总 ＲNA 的质量较高，符合逆转录反应要
求(图 1)。
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林 业 科 技 第 40 卷
图 1 欧李总 ＲNA鉴定结果
1. 干旱0 d;2. 干旱4 d;3. 干旱8 d;4. 干旱12 d;5. SA处理3 d
2. 2 半定量 ＲT-PCＲ
对欧李 AOX 基因家族和 UCP 基因家族 ＲT-
PCＲ 扩增产物进行 1%的琼脂糖凝胶电泳分析，
结果无非特异性扩增，无引物二聚体。不同处理
时间和不同处理类方式之间表达差异明显(图 2)。
图 2 欧李叶片中 AOX家族和 UCP家族半定量表达分析
1. 干旱 0 d;2. 干旱 4 d;3. 干旱 8 d;
4. 干旱 12 d;5. SA处理 3 d
2. 3 荧光定量 PCＲ
干旱胁迫时，AOX1a 和 AOX1b 的表达量与
对照(干旱处理 0 天)相比较呈先降低后升高趋
势，4 天时表达量最小，12 天时表达量最大，比
对照分别提高了 17. 9% 和 74. 8%;AOX4 的表
达则表现为先上升后下降的趋势，8 天时高于对
照 163. 9%而达到最大值，然后下降，但是始终
高于对照水平;而 AOX2 的相对表达量却无显著
变化。
UCP1 和 UCP2 的表达量都随着干旱处理天数
增加而持续升高，干旱胁迫 12 天时，二者表达量
达到 最 大，分 别 高 于 对 照 水 平 159. 6% 和
143. 9%;UCP3、UCP4 和 UCP5 的趋势大致相同，
都表现为先升高后降低，8 天时表达量最大，但
UCP3 和 UCP4 的峰值明显低于 UCP5，分别超出
对照水平 81. 5%、55. 0%和 257. 2%。
SA处理 3 天后，仅 UCP2 的表达量有所上升，
两家族其他成员的表达量都不同程度下降，
AOX1a、AOX2 下降幅度最大，分别为 94. 0%和
89. 0%;UCP3 和 UCP4 次之;UCP5 的下降幅度
最小，只有 13. 2%(图 3)。
图 3 不同处理下 AOX及 UCP家族的相对表达量
3 结论与讨论
3. 1 干旱胁迫是植物最常见的非生物胁迫之一，
它能干扰植物体内活性氧(ＲOS)的平衡，导致植
物遭受氧化损伤［9］。植物通过 “渗透感受器”感
受外界干旱胁迫信号，通过酶联传导反应，调控
一系列基因的表达［10］，来应对不良环境。其中，
AOX和 UCP 扮演着非常重要的角色。本研究中
AOX1b和 AOX4 及 UCP家族各成员的表达水平整
体上调(图 2，图 3)，与之前对于小麦［11 － 12］和烟
草［13］的研究结果一致，随着干旱胁迫天数的增
加，各基因的表达趋势却不尽相同。AOX4、
UCP3、UCP4 和 UCP5 在 8 天时表达量最大，之后
就有所下降，AOX1b、UCP1 和 UCP2 表达量不断
升高直到 12 天达到峰值，而 AOX1a 和 AOX2 的
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第 1 期 胡银松等:胁迫下欧李 AOX及 UCP基因家族表达分析
变化并不明显。这说明在不同的干旱时期，同一
基因家族各成员所起的作用并不相同，推测欧李
通过调控各成员的表达水平来应对不同时期的干
旱胁迫。
3. 2 水杨酸(SA)是广泛存在于单子叶和双子叶
植物体内的一类酚类物质，对植物抗氰呼吸的诱
导具有普遍性，是导致天南星科植物佛焰花序产
热的“致热源”［14］，SA 能显著提高交替途径容
量及交替氧化酶的表达量［15 － 16］。本研究用水杨酸
连续处理欧李叶片 3 天，一方面探索较长期 SA处
理对植物交替呼吸途径的影响，另外初步了解 SA
与与 UCP 之间的作用关系。结果发现，AOX 和
UCP家族成员的表达量普遍下调，仅 UCP2 例外。
推测其原因，可能是由于持续的 SA处理，显著提
高了 SOD及 POD 等酶［17］的活性，细胞内的活性
氧持续低于正常水平，活性氧通过负反馈调解使
AOX和 UCP表达下调。
3. 3 UCP 与 AOX 都定位于线粒体内膜，空间位
置临近，生理功能上联系更为紧密，在植物产热
过程中、果实成熟过程中和增强植物抵御逆境胁
迫等生理过程中，两者究竟是如何作用，分子机
制为何，这些都尚待进一步的探索。为此，今后
的试验中将在这方面进行更为深入的研究。
3. 4 本研究通过对欧李耐协迫机制进行系统研
究，提出调控机制，以期最终驯化为适应黑龙江
省特别针对哈尔滨地区的生境，为绿化北方城市、
改善盐碱地植被恢复提供选择树种。
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第 1 作者简介:胡银松(1988 －)，男，硕士研究生，
主要从事林木抗逆生理与分子生物学方面的研究。
通讯作者:宋兴舜(1978 －)，男，副教授，主要从事
林木抗逆生理与分子生物学方面的研究。
收稿日期:2014 － 11 － 28
(责任编辑:潘启英)
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林 业 科 技 第 40 卷
Analysis of AOX and UCP Families Expression
Level in Prunus humilis under Stress
HU Yinsong
(Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 150040)
Abstract In order to provide fundamental knowlege of genes from alternative oxidase(AOX)and
uncoupling protein(UCP)families， the expression levels of them were investigated in Prunus humilis
leaves under water stress(WS)and salicylic acid(SA)treatments in the present study． Specific primers
and real － time fluorescence quantitative ＲT － PCＲ were designed and carried out． The actin gene，a
housekeeping gene was used as reference gene． Then，we assayed the changes of AOX and UCP families
in the leaves of Prunus humilis using the method of relative quantification PCＲ． As a result， the
expression level of AOX4，UCP3，UCP4 and UCP5 exhibited a maximum value on the day 8 under WS，
thereafter，it declined gradualy． However，the expression level of AOX1b，UCP1 and UCP2 increased
over time，and reached the peak on the day 12． No changes of AOX1a and AOX2 were observed
compared with controls． On the day 3 of SA treatment，the expression levels of all members of both
families were declined except UCP2．
Key words Prunus humilis;Alternative oxidase;Uncoupling protein;ＲT － PCＲ;Salicylic acid
01