全 文 ：第 31卷 第 4期
2010年　 8月 河 南 科 技 大 学 学 报 :自 然 科 学 版JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology:NaturalScience
Vol.31 No.4
Aug. 2010
基金项目:河南省科技厅重点科技攻关项目(092102210182)
作者简介:邵芳芳(1983-),女 ,河南滑县人 ,硕士生;尹卫平(1956-),女 ,河南郑州人 ,教授,博士 ,主要从事天然产物研究.
收稿日期:2010-01-05
文章编号:1672-6871(2010)04-0094-03
翻白草提取物抑制硝基化反应
邵芳芳 ,尹卫平 ,梁　菊 ,刘　普
(河南科技大学 化工与制药学院 ,河南 洛阳 471003)
摘要:利用硝基化反应 , 探索建立抗糖尿病体外快速筛选模型。本研究通过形成的 3 -硝基酪氨酸(3 -
nitrotysine, 3-NT)在紫外 425nm吸收强度的变化 , 对民间草药翻白草治疗糖尿病的验方进行药效活性成分。
根据翻白草不同提取物对硝基化反应的抑制作用 , 建立了简便可靠的抗糖尿病体外筛选和快速评价方法 。实
验基于从翻白草所得的甲醇 、乙醇不同浓度和总黄酮等不同部位的提取物 , 经体外硝基化反应评价 ,筛选出翻
白草的甲醇萃取物 、95%乙醇抽提物 、总黄酮 、聚酰胺层析的 40%乙醇洗提物和 85%乙醇洗提物为有效抗糖
尿病部位 , 均有明显的抑制蛋白硝化的作用。该研究通过优化外硝基化反应最佳条件 ,进而建立的体外硝基
化反应模型 , 揭示了翻白草提取物含有抑制硝化的物质即为该植物的抗糖尿病成分。因此 , 抑制蛋白硝基化
作用可以考虑作为体外抗糖尿病的有效手段 ,并且有望完善成为体外抗糖尿病药物快速筛选的简便方法和模
型之一。
关键词:翻白草;提取物;酪氨酸;硝基化;抑制率
中图分类号:R285.5 文献标识码:A
0　前言
翻白草(PotentilaDiscolor.Bunge)始载于《救荒本草》 ,又称鸡腿儿 ,为蔷薇科委陵菜属多年生草本
植物 ,根部或干燥全草均可入药 。可用于解毒 、吐血 、便血 、崩漏 、痢疾 、疟疾 、痈疖等 。全国各地均有分
布 ,为我国传统中药 [ 1] 。在民间用翻白草泡水口服降糖的偏方 ,具有良好的临床效果 [ 2] 。近年来也有
许多关于翻白草降血糖的报道 [ 3 -4] 。国外已有研究表明 ,糖尿病患者组织中蛋白质硝基化程度增
高 [ 5-7] 。机理研究证实 ONOO—可使酪氨酸(Tyr)或蛋白质酪氨酸残基发生硝化反应 ,生成 3-硝基酪
氨酸(3-NT)。Antonio等发现糖尿病患者的内皮细胞和糖尿病小鼠的视网膜细胞在血糖正常一周后
其高血糖应激的标志物 3-NT仍保持诱导表达 [ 8] 。因此 , 3-NT水平可用来作为糖尿病的一项指标。
本研究在经典淬灭流动反应制备 ONOO—的方法的基础上 ,采用新的方法合成了 ONOO— ,并建立体外抑
制蛋白质硝化模型 ,用于评价翻白草提取物的抑制蛋白硝化能力 ,为抗糖尿病新药先导化合物的筛选寻
研究提供实验基础。
1　仪器与试剂
UV-2501型紫外可见分光光度计(日本岛津);L-酪氨酸(购于中国惠兴生化试剂有限公司);H2O2
和 HCl均为分析纯;二次蒸馏水由本实验室自制 。翻白草 2008年购于河南省禹州药材公司。洛阳梓生
科技有限公司王忠东高级工程师鉴定为植物药蔷薇科委陵菜属翻白草种(PotentilaDiscolor.Bunge)。
2　方法
2.1　翻白草提取物的制备研究
翻白草 3 kg,用 95%乙醇回流提取共 3次 ,每次 4h。合并提取液 ,浓缩 ,回收乙醇得浸膏 ,为部位 1
(F1)。
部位 1用乙醇溶解后 ,部分用 100 ～ 120目的聚酰胺层析 ,收集滤液并浓缩 ,得到黄色粉末状物质 ,
DOI :10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2010.04.019
第 4期 邵芳芳等:翻白草提取物抑制硝基化反应
经鉴定为总黄酮部分(F2)。另一部分同样用聚酰胺柱层析 ,依次用乙醇和甲醇溶液梯度洗脱 ,浓缩 ,得
到 5个部位分别为 40%乙醇洗脱浸膏(F3)、50%乙醇洗脱浸膏(F4)、65%乙醇洗脱浸膏(F5)、85%乙
醇洗脱浸膏(F6)和甲醇浸膏(F7)。
上述所得 7个粗体物(F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7),即为本研究的原料提取物。
2.2　过氧亚硝酸根(ONOO— )制备
目前制备 ONOO—的方法主要采用淬灭流动反应法合成 ,本研究在经典的 NaNO2和 H2O2反应的方
法上 ,通过改进合成了过氧亚硝酸溶液[ 9] 。合成方法是采用在 4 ℃下 ,将 2.5 mL、0.6 mol/LHCl和 3
mL、0.7mol/LH2O2混合稀释至 100mL,并配制 0.6 mol/LNaNO2溶液 100mL,分别用两支 20 mL注射
器吸取等量上述两溶液 ,匀速注入三通管内混合 ,流出液快速引入 0 ℃、1.5 mol/LNaOH溶液中 ,过量
H2O2用 MnO2催化分解 ,过滤混和液至棕色试剂瓶 ,于 -20 ℃保存。以 1.0 mol/L的 NaOH为参比 ,在
302nm处检测其紫外吸收 ,根据朗伯 -比尔定律来确定过氧亚硝酸溶液的浓度(ε=1 670)。
2.3　硝化反应最佳条件确定
(1)硝化最佳硝化时间的确定。以酪氨酸为底物(浓度为 1×10-3 mol/L),以 pH7.2的 PBS磷酸
盐缓冲作为反应介质 ,加入同浓度的过氧亚硝酸。分别反应一定时间 ,检测酪氨酸硝化情况。
(2)ONOO—最佳浓度的确定 。取 6支试管 ,分别加入 0.3 mL、1.0 mmol/L的 L-Tyr, 0.3 mL不同
浓度的 ONOO—溶液 ,检测 428 nm处吸光度 。
2.4　翻白草提取物抑制蛋白硝化实验
根据已得的最佳酪氨酸硝化条件 ,加入 L-酪氨酸 0.3mL和 ONOO—溶液 0.3 mL,随即加入翻白草
的不同提取物 ,最后用 pH7.2 PBS定容至 3.0 mL,在 37 ℃水浴中反应 90 min后 ,用 3.0 mol/L的
NaOH终止反应 ,检测 428 nm处吸光度 。其中设 PBS为参比溶液 , 设空白对照 , 溶媒(PBS)代替
ONOO—溶液作为样本对照组(考虑到样品自身吸光度值)。每个浓度组平行测定 3次 ,抑制率以 3次测
定结果的平均值表示 。按下面公式计算抑制率:
R=[ Ao -(Ax -Axo)] /A0 ×100%,
式中:Ao为空白对照吸光度;Ax为加入样品后吸光度;Axo为样本对照吸光度。
3　结果与讨论
3.1　最佳硝化条件确定
不同反应时间对酪氨酸硝化的影响见图 1。
不同浓度过氧亚硝酸根对酪氨酸硝化的影响见图 2。
　　图 1表明了蛋白硝化产物的量随反应时间的延长而增多。当反应 90min时 ,硝化产物达到最大值 ,
即最佳反应时间为 90min。图 2表明了不同浓度 ONOO—对硝化产物的影响 。硝化产物随 ONOO—浓度
增大而不断增大 ,当 ONOO—浓度达到 4.78mmol/L时 ,硝化产物达到最大值 ,之后随着 ONOO—浓度增
大 , 硝化产物的量反而减小。
·95·
由上述实验结果可知 ,最佳反应条件是 pH7.2(中性条件下)、水浴 37 ℃(模拟人体温度)、反应 90
min以及过氧亚硝酸根浓度达到 4.78 mmol/L时 ,过氧亚硝酸根硝化 L-Tyr的反应进行最完全。
3.2　翻白草提取物抑制蛋白硝化结果
分别对翻白草不同提取物在上述最佳条件下进行抑制蛋白硝化实验 ,发现 50%乙醇洗脱物 , 65%
乙醇洗脱物无明显的抑制硝化作用 ,而甲醇萃取物 、95%乙醇浸提物 、总黄酮 、40%乙醇洗脱剂和 85%
乙醇洗脱剂均有抑制蛋白硝化作用 ,后 5种有效提取物作为进一步的研究对象。
5种有效提取物在不同浓度对硝基化抑制作用测定结果见表 1。
表 1　不同提取物在不同浓度下的蛋白硝化抑制率 x±s, n=3
样品浓度 /
(μg/mL)
甲醇萃取物
抑制率 /%
95%乙醇提取物
抑制率 /%
总黄酮抑制率 /
%
40%乙醇洗提物
抑制率 /%
85%乙醇洗提物
抑制率 /%
10.00 45.96±4.30 7.93±5.58 21.67±4.56 13.98±4.51 7.98±6.35
16.67 48.83±6.23 18.16±6.32 34.20±3.98 27.96±6.24 14.72±6.54
23.33 59.48±6.17 23.68±5.24 39.26±4.69 31.72±5.96 20.25±7.21
30.00 65.12±5.26 35.98±6.25 56.87±3.85 38.17±4.36 29.45±5.58
40.00 71.59±6.33 39.89±5.94 45.04±5.23 48.92±5.33 37.42±6.39
50.00 74.66±5.26 50.69±4.84 44.57±5.65 49.46±5.15 49.69±4.29
66.67 65.12±4.65 58.62±5.68 37.50±4.21 45.70±5.52 47.85±6.45
　　由表 1可知:翻白草的甲醇萃取物对硝基化反应表现出良好的抑制效果 ,并且随浓度的增大抑制率
不断增大 ,当浓度达到 50μg/mL时抑制率达到最大 ,最大值为 74%,浓度继续增大时 ,抑制率下降。不
同浓度翻白草的 95%乙醇提取物均有抑制蛋白硝化作用 ,在 10.00 ～ 50.00μg/mL浓度范围内 ,有明显
的量效关系 ,相关度为 0.996 8,当浓度增大到 66.67 μg/mL时抑制率变化开始平缓 ,最大抑制率在
58%左右。表中翻白草的总黄酮提取物也有较好的抑制效果 。随着浓度增加 ,抑制率增强 。最大抑制
率达到 56%左右。
翻白草作为治疗糖尿病的民间药用验方 ,通过本文抑制硝化反应的实验研究 ,为翻白草防治糖尿病
提供了理论依据 。同时基于植物化学研究手段 ,该研究也为进一步分离有效成分 、筛选抗糖尿病新药先
导化合物奠定了基础 。
参考文献:
[ 1] 　中国植物志编委会.中国植物志:37卷 [ M] .北京:科学出版社 , 1985:223-33l.
[ 2] 　刘金环 , 阮维国.翻白草水煎剂中微量元素的研究 [ J] .河北大学学报:自然科学版 , 2003, 23(3):337.
[ 3] 　王晓敏 , 王建红 ,徐冬平 ,等.翻白草水提液对糖尿病小鼠降血糖作用 [ J] .江西中医学院学报 , 2005, 17(2):53 -
54.
[ 4] 　白金丽 , 孙　俊 ,胡　军.翻白草成份对糖尿病的初步药理学研究 [ J] .云南中医中药杂志 , 2009, 20(3):53-55.
[ 5] 　TurkoIV, MuradF.ProteinNitrationinCardiovascularDiseases[ J] .PharmacolRev, 2002, 54(4):619-639.
[ 6] 　CerieloA, QuagliaroB, Catone, etal.RoleofHyperglycemiainNitrotyrosinePostprandialGeneration[ J] .DiabetesCare,
2002, 25(8):1439-1443.
[ 7] 　CerielloA.Nitrosine:NewFindingsasaMarkerofPostprandialOxidativeStress[ J] .IntJClinPractSuppl, 2002, 129(7):
51-58.
[ 8] 　IhnatMA, ThorpeJE, KamatCD, etal.ReactiveOxygenSpeciesMediateaCellular` Memory ofHighGlucoseStress
Signaling[ J] .Diabetologia, 2007, 50(7):1523-1531.
[ 9] BeckmanJS, BeckmanTW, ChenJ, etal.ApparentHydroxylRadicalProductionbyPeroxynitrite:Implicationsfor
EndothelialInjuryfromNitricOxideandSuperoxide[ J] .ProcNatlAcadSciUSA, 1990, 87(4):1620-1624.
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· Ⅷ · JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology:NaturalScience 2010
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PANYan-Ling1 , SHEN Yan-Lin2 , LIULi-Min3 　 (1.DepartmentofMathematics, ZhengzhouNormalUniversity, Zhengzhou450044, China;2.DepartmentofInformationEngineering, XuchangVocationalTechnicalColege, Xuchang461000, China;3.ColegeofMathematics＆ InformationScience, HenanNormalUniversity,Xinxiang453007, China)Abstract:Thispaperstudiestheutility-indiferencepricingandhedgingprobleminoneperiodmodel.Theexplicitsolutionoftheindiferencewiththeexponentialutilityfunctionisobtained.Theminimalentropymartingalemeasureisconstructedbyindiferencepricing slimit.Thepricingofclaimissolvedintheincompletemarket.Keywords:Indiferenceprice;Exponentialutility;MinimalentropymartingalemeasureCLCnumber:O211.6;F830.9　　　Documentcode:A ArticleID:1672-6871(2010)04-0092-02
· Chemistry, ChemicalEngineeringandOthers·
InhibitingNitrationofExtractsfromPotentilaDiscolorBunge (94 )⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯SHAOFang-Fang, YINWei-Ping, LIANGJu, LIUPu　(SchoolofChemicalEnginering＆ Pharmaceutics,HenanUniversityofScience＆Technology, Luoyang471003 , China)Abstract:Usingnitrationrapidscreeningtheanti-diabeticmodelinvitrowasestablished.Basedontheabsorptionintensityof3-nitrotyrosineat425 nm, folkprescriptionPotentilaDiscolor.Bungewasstudiedonitsactiveingredients.Thestudymethodadoptedanti-freeradicalmodelinvitroaccordingtofreeradicaltheoryaboatdiabete.Accordingtotheanti-nitrationsofdiferentextracts, amethodtoscreenactiveingredientsofanti-diabetesmelitusrapidlywasesteblishedinvitro.Mathanolextract, diferentconcentrationethanolextractsandtotolflavonoidswereevaluatedbythismodel.Therewassupiorerinhibitionactivityinfractionasfolows:mathanolextract, 95%ethanolextract, totalflavonoids, 40%ethanolelutedsand85% ethanolelutedsfromthecolumnchromatographyofpolyamide.Theresultsshowedthatthereareanti-diabiticsubstancesinPotentilaDiscolor.Bungewhichprovidesthebasisstudyforchemicalseparating.Therefore, inhibitoryproteinnitrationreactioncanbeconsideredasanefectivemeansofanti-diabetesinvitro.Besides, itcanberefinedintooneofsimplemethodsandmodelstorapidlyscreenanti-diabaticdruginfuture.Keywords:Potentiladiscolor.bunge;Extracts;Tyrosine;Nitration;InhibitionratioCLCnumber:R285.5　　　　　Documentcode:A ArticleID:1672-6871(2010)04-0094-03
ApplicationofMathProgramminginSoft-SensorofGasolineEndpoint (97 )⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯
XUEZhen-Xia1 , BAIXiu-Qin2 　(1.SchoolofMathematics＆ Statistics, HenanUniversityofScience＆Technology, Luoyang471003, China;2.DepartmentofBasicCourse, PingdingshanIndustrialColegeofTechnology, Pingdingshan467001, China)Abstract:Thispaperdealtwithmathmodelsinsoft-sensorofthegasolineendpointandrealizationonlinebasedontheregressionmethodsinmathprogramming.Thecombinationmodelinsoft-sensorofthegasolineendpointwasdeveloped.Inaddition, thealgorithmofthemodelbymeansofMATLAB, programprincipal
programandinterfacewithC++ BUILDERwasgiven.Agoodefectisobtaidwhenputingintooperationinindustrialequipment, whichshowseficiencyoftheproposedmodel.Themethodcanbewidelyappliedinadvancedprocescontrolinindustry.Keywords:Mathprogramming;Soft-sensing;Regresionmethod;EndpointCLCnumber:O235　　　　　Documentcode:A ArticleID:1672-6871(2010)04-0097-04
SynthesisandCharacterizationofNonlinearOpticalMaterialof5 -(2 -Methylthio-4 -methyl-5 -pyrimidinyl)-2, 4 -pentadiynylSorbate (101 )⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯LILi1 , HUANGYan-Qin1 , LIUShu-Zhi2 　(1.DepartmentofChemistry＆ ChemicalEngineering, XinxiangUniversity, Xinxiang453003, China;2.TheKeyLaboratoryofScience＆ TechnologyofControlableChemicalReactionsofMinistryofEducation, BeijingUniversityofChemicalTechnology, Beijing100029, China)Abstract:5-(2-Methylthio-4-methyl-5-pyrimidinyl)-2, 4 -pentadiynylsorbate(SPD)compoundwassynthesizedbythereactionof5-(2-Methylthio-4-methyl-5-pyrimidinyl)-2, 4-pentadiyn-1-olandsorbylchloride, whichwasconfirmedbyUV, IR, NMR, DEPT, gCOSY, gHSQCandgHMBCspectra.TheopticalnonlinearpropertyofSPDwasmeasuredusingaQ-switchedNd:YAGlaserwith8nspulseexcitationat
532nm.ThereversesaturationabsorptionandnonlinearrefractionofSPDwereobservedbymeansofZ-scan
techniqueandthevalueofthird-orderopticalnonlinearsusceptibilitieχ(3)wasobtained.Keywords:Nonliearopticalproperty;Synthesis;Characterization;Z-scanCLCnumber:O624.41　　　　　Documentcode:A ArticleID:1672-6871(2010)04-0101-04