全 文 ：China Brewing
2014 Vol.33 No．4
Serial No．266
山荆子（Malus baccata）又名山定子、山丁子、堂梨子、
水楸子，为一种耐寒性极强的蔷薇科苹果亚科苹果属落
叶乔木的果实[1-5]。山荆子资源主要分布在我国黑龙江、吉
林、辽宁、内蒙古、山西、河北、陕西、甘肃[6-7]。成熟的山荆子
果具有独特的风味及丰富的营养素，食用价值很高，还具
有促进人体物质代谢，增强人体消化吸收能力等重要的
生理功能[8]。在食品工业中，山荆子果可制作饮料，也可酿
制果酒等[9-10]。一些研究表明，生长于寒冷气候下的水果比
温带气候水果具有更丰富的植物次级代谢产物，这些物
质主要为一些具有抗氧化活性的酚类化合物[11]。超声波提
取技术由于具有提取时间短、有效成分提取率高、成本
低、低温保护热敏性成分等优点，近年来被广泛应用于植物
化学物的提取[12]。响应面分析法（response surface method-
ology，RSM）是采用多元二次回归方程拟合因素与响应值
之间的函数关系，通过对回归方程的分析来解决多变量
问题的一种统计学方法。与正交试验相比，该法试验周期
短，求得的回归方程精度高，可研究几个因素间的交互作
用。本研究采用超声波法通过单因素试验和响应面优化，
考察了乙醇体积分数、提取时间和超声功率对山荆子抗
氧化活性物质提取的影响，确定了最佳提取工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山荆子来自吉林农业大学果园；三吡啶三吖嗪（tripyridyl-
triazine，TPTZ）：美国Sigma公司；FeSO4、FeCl3等均为国产
分析纯。
1.2 仪器与设备
JY92-2型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份
有限公司；DELTA320型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公
司；SP-722E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 山荆子提取物的制备
山荆子成熟后烘干、粉碎。分别称取1g粉末，设定料液
响应面法优化超声波提取山荆子抗氧化物质工艺
吕 娜1，2，刘 阳1，夏海洋1，崔艳艳1，沈明浩1，张 捷2
（1.吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.浙江万里学院 生物与环境学院，浙江 宁波 315100）
摘 要：采用Box-Behnken响应面分析法研究超声波提取山荆子抗氧化物质的工艺条件。在单因素试验的基础上，研究乙醇体积分
数、超声功率、提取时间对提取液抗氧化性的影响。建立该工艺的二次多项式模型。依据回归分析确定最优提取条件。结果表明：回
归模型具有高度显著性。最佳提取工艺条件为乙醇体积分数57%，提取时间42min，超声功率为493W。此时提取液抗氧化性最强，亚
铁还原能力（FRAP）值达最大值12 375.8。
关键词：山荆子；FRAP法；抗氧化能力；响应面法；提取条件
中图分类号：O629.9 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2014）04-0052-04
doi：10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.013
Optimization of ultrasonic wave extraction of antioxidant substances from
Malus baccata by response surface methodology
L譈 Na1,2, LIU Yang1, XIA Haiyang1, CUI Yanyan1, SHEN Minghao1, ZHANG Jie2
(1.College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun, 130118, China;
2.College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo, 315100, China)
Abstract: Box-Behnken response surface methodology was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of antioxidant substances from
Malus baccata. On the basis of single factor investigation, effects of ethanol volume fraction, ultrasonic power and extraction time on the antioxidant
activity of the extract were investigated. A quadratic regression model equation which described the extraction process was fitted. The optimum ex-
traction parameters were determined by the regression analysis and the fitted regression model had high statistical significance. The optimum extrac-
tion conditions were determined as follows: ethanol volume fraction 57%, ultrasonic time 42 min, ultrasonic power 493 W. Under these conditions,
the extract showed highest antioxidant activity with the FRAP value of 12 375.8.
Key words: Malus baccata ; FRAP assay; antioxidant capacity; response surface methodology; extraction condition
收稿日期：2014-02-25
基金项目：浙江省科技厅公益项目（2010C32066）；吉林农业大学博士启动基金（201308）
作者简介：吕 娜（1980-），女，副教授，博士，研究方向为天然产物化学。
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中 国 酿 造
2014年 第 33卷 第 4期
总第 266期
比1∶10，根据单因素和响应面试验设计确定每组的提取条
件，置于超声波细胞粉碎机中提取，得到的提取液离心后
取上清，真空浓缩后用用溶剂定容至10mL，待测。
1.3.2 提取液抗氧化性的测定
参照BENZIE I F F等[13]的方法，采用亚铁还原/抗氧化
能力（Ferric reducing/antioxidant power，FRAP）法测定山
荆子提取液的抗氧化性的大小。将浓度为25~800μmol/L
的FeSO4溶液250μL与3mL预热至37℃的FRAP工作液（由
0.3mol/L醋酸盐缓冲液 25mL、10mmol/L TPTZ溶液2.5mL、
20mmol/L FeCl3溶液 2.5mL组成）混合，反应10min后，于波
长593nm处测定其吸光度值，以OD593nm值（y）为纵坐标，FeSO4
溶液浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：
y =0.002 3x+0.195 7，相关系数R2=0.998。同样取3μL提取
液与247μL蒸馏水混匀，再与3mL FRAP工作液反应，同样
测定OD593nm值。根据反应后吸光度值，在标准曲线上求得
相应FeSO4的浓度（μmol/L），定义为FRAP值。FRAP值越
大，表明溶液中含有的抗氧化活性物质越多，即抗氧化
活性越强。
1.3.3 单因素试验
以FRAP值为考察指标，比较FRAP值与乙醇体积分
数、提取时间和超声功率的关系。
1.3.4 响应面试验方案
在3个单因素试验结果基础上设计因素水平，以FRAP
值为响应值（Y），通过Box-Behnken Design模型设计3因
素3水平的试验，并结合响应面分析法对山荆子抗氧化
活性物质提取的工艺参数进行优化分析，因素水平设计
见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对FRAP值的影响
控制反应条件为超声功率400W，提取时间30min，乙
醇体积分数分别为0、20%、40%、60%、80%时，检测提取液
的FRAP值，结果如图1所示。由图1可知，当乙醇体积分
数＜60%时，FRAP值随乙醇体积分数的增加而增加。但当
乙醇体积分数＞60%时，FRAP值反而下降。这可能因为当
乙醇体积分数过高时，山荆子果实中脂溶性物质的溶出量
增大，使抗氧化活性物质的溶解度降低，从而导致FRAP值
降低。因此，选取体积分数60%乙醇作为提取溶剂较适合
提取山荆子中的抗氧化活性物质。
2.1.2 提取时间对FRAP值的影响
控制反应条件为超声功率400W，提取剂为体积分数
60%乙醇，分别超声10min、20min、30min、40min、50min、
60min后，检测提取液FRAP值的大小，结果如图2所示。由
图2可知，当提取时间＜40min时，所获提取液的FRAP值随
提取时间的增加而增加。40min时FRAP值达到最大，之后
随提取时间增加FRAP值减小，这可能与山荆子较长时间的
暴露于超声波环境中，导致了果实中部分具有抗氧化活性
的物质结果被破坏有关。
2.1.3 超声功率对FRAP值的影响
设定提取剂为体积分数60%乙醇，提取时间40min，分
别用 100W、200W、300W、400W、500W、600W、700W的超
声波提取山荆子中的抗氧化活性物质，提取液的FRAP值
如图3所示。由图3可知，当超声功率为500W时，FRAP值达
到最大，即提取液的抗氧化活性达到最高值。而继续增加
超声功率，FRAP值反而减小，可能是由于超声波功率过高
导致了山荆子中抗氧化活性物质的破坏。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment
因素
水平
+1 0 -1
A乙醇体积分数/% 80 60 40
B超声功率/W 600 500 400
C提取时间/min 50 40 30
图1 乙醇体积分数对提取液FRAP值的影响
Fig. 1 Effect of ethanol volume fraction on FRAP value of extract
图2 提取时间对提取液FRAP值的影响
Fig. 2 Effect of extraction time on FRAP value of extract
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2.2 响应面法优化山荆子抗氧化活性物质的提取工艺
2.2.1 试验设计及结果
在单因素试验基础上，进行Box-Behnken响应面优化
试验，试验方案及结果如表2所示。
采用Design-Expert 8.05b软件，对表2中的结果进行多
元拟合回归，获得FRAP值对乙醇体积分数、超声功率和提
取时间的二次多项回归模型：
Y=12 184.2-1 250.9A-158.58B+326.16C -880.43AB+
860.51AC -994.71BC -3 081.3A2 -1 436.24B2-684.43C2
2.2.2 响应面结果分析
为了检验回归方程的有效性，对回归模型进行了方差
分析，结果如表3所示。由表3可知，模型的 P＜0.000 1，差
异极显著，说明该模型拟合度较好，回归方程能很好的描
述各因素与响应值之间的关系，证明了该方法是可靠的。失
拟项 P =0.398 9＞0.05，差异不显著，表明可以用该模型预
测实验结果。模型的相关系数R2=0.975 1，说明该模型能解
释97.51%的响应面变化。变异系数（coefficient of variation，
CV）为5.48%，说明模型的置信度较高，模型方程能够较好
地反映真实的试验值。以上表明可以用该模型来分析和
预测山荆子抗氧化物质提取的最佳条件。从回归方程各
项方差分析结果看出，因素A、BC、A2、B2对响应值有极显
著影响，AB、AC、C2对响应值有显著影响。结果表明，试验
各因素对抗氧化活性物质提取的影响不呈简单的线性关
系，3因素对响应值影响的大小顺序为乙醇体积分数＞提
取时间＞超声功率。
2.2.3 响应面分析与优化
各因素之间两两相互关系对FRAP值影响的响应面及
等高线见图4。由图4可知，FRAP值随乙醇体积分数、超声
功率及提取时间增大呈先增后降的趋势，说明3个因素在
所选范围内能产生最佳的响应值。在响应面分析中，曲面
越陡峭表明该因素对响应值的影响越大[14-15]。可见，乙醇体
积分数对提取液FRAP值的影响最显著，表现为响应面中
曲面较陡，提取时间次之，而超声功率对FRAP值的影响最
不显著，表现为曲线较平滑。
2.2.4 提取工艺条件的确定
通过二次回归预测的最佳工艺参数为体积分数57%
乙醇溶液、超声功率493W、提取时间42min，在此条件下提
取液的FRAP理论值为12 324.2。采用该工艺进行3次重复
试验，得到提取液的FRAP平均值为12 375.8，测定结果稳
定，偏差不大，与响应面优化结果差异不显著，置信区间
图3 超声功率对提取液FRAP值的影响
Fig. 3 Effect of ultrasonic power on FRAP value of extract
表2 响应面法设计与试验结果
Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment
试验号 A B C Y FRAP值
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
60
60
80
60
80
80
60
40
40
80
60
60
60
60
60
40
40
500
600
400
500
500
600
600
500
400
500
500
400
500
400
500
600
500
40
30
40
40
30
40
50
30
40
50
40
30
40
50
40
40
50
12 750
10 765
7 765
12 714
5 504
5 663
9 069
10 322
7 909
8 236
11 859
9 069
11 895
11 352
11 704
9 330
9 612
注：“**”表示影响极显著水平（P＜0.01）；“*”表示影响显著水平
（P＜0.05）；R2=0.975 1。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性
模型
A
B
C
AB
AC
BC
A2
B2
C2
残差
失拟项
纯误差
总离差
7.81×107
1.25×107
2.01×105
8.51×105
3.10×106
2.96×106
3.96×106
4.00×107
8.69×106
1.97×106
1.99×106
9.69×105
1.02×106
8.01×107
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
8.67×106
1.25×107
2.01×105
8.51×105
3.10×106
2.96×106
3.96×106
4.00×107
8.69×106
1.97×106
2.84×105
3.23×105
2.55×105
30.51
44.04
0.71
2.99
10.91
10.42
13.92
140.63
30.55
6.94
1.26
＜0.000 1
0.000 3
0.428 0
0.127 2
0.013 1
0.014 5
0.007 3
<0.000 1
0.000 9
0.033 7
0.398 9
**
**
*
*
**
**
**
*
不显著
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（confidence interval，CI）＜95%，表明响应面法优化得到的
提取工艺科学合理，准确可靠。
3 结论
本研究在单因素试验的基础上采用响应面法对山荆
子抗氧化成分进行了提取工艺优化，得到了最佳提取工
艺参数为乙醇体积分数57%，超声功率493W、提取时间
42min。在此条件下，FRAP值为12 375.8。研究结果为今后
野生山荆子资源的综合利用以及天然抗氧化剂的开发提
供一定的理论依据。
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图4 各两因素交互作用对提取液FRAP值影响的响应面及等高线
Fig. 4 Response surface plot and contour line of the interaction
among each two factors of ethanol concentration volume
fraction, ultrasonic power and extraction time on FRAP
value of the extract
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