全 文 ：［收稿日期］ 20120903(011)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81274189) ;辽宁省高等
学校杰出青年学者成长计划项目(LJQ2011103)
［第一作者］ 韩瑞亭，硕士研究生，E-mail:7171713 _ cn @
sina． com
［通讯作者］ * 高慧媛，博士，副教授，从事中药、天然药物活性
成分研究，Tel:024-23986482，E-mail:gaohuiyuan
1997@ yahoo． com． cn
苦石莲中总二萜的含量测定
韩瑞亭1，2，万国盛1，孙博航1，霍晓灵1，高慧媛1*
( 1. 沈阳药科大学，教育部基于靶点的药物设计与研究重点实验室，沈阳 110016;
2. 黑龙江农业经济职业学院 制药工程系，黑龙江 牡丹江 157041)
［摘要］ 目的:建立苦石莲中总二萜的含量测定方法，优化总二萜的提取工艺，并进行含量测定。方法:采用可见分光光
度法，以 5%香草醛 /冰乙酸-高氯酸为显色剂，化合物 caesalpinins K为对照品，在 530 nm处测定其吸光度值，利用回归方程计
算苦石莲中总二萜含量。结果:Caesalpinins K对照品溶液质量浓度在 2. 0 ～ 6. 1 mg·L －1，线性关系良好，r = 0. 999 5(n = 5) ，平
均回收率为 101. 8%(RSD 2. 3%)。结论:该方法简便、准确、重复性好，可以为苦石莲的质量控制提供依据。
［关键词］ 苦石莲;二萜;可见分光光度法;含量测定
［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)06-0084-03
Determination of Total Diterpenes of Caesalpinia minax
HAN Rui-ting1，2，WAN Guo-sheng1，SUN Bo-hang1，HUO Xiao-ling1，GAO Hui-yuan1*
(1. Key Laboratory of Structure-Based Drug Design ＆ Discovery，Ministry of Education，
Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;
2. Heilonjiang Agricultural Economy Vocational College，Mudanjiang 157041，China)
［Abstract］ Objective:To establish quantitative methods of total diterpene in Caesalpinia minax and
optimization of extraction process． Method:The content of total diterpene was determined at 530 nm by vis-
spectrophotometry using caesalpinins K as standard and using the color reaction with 5% vanillina-glacial acetic acid
and perchloric acid． Result:Linear relationship of caesalpinins K reference solution was good in the range of 2. 0-
6. 1 mg·L －1 (r =0. 999 5) ，the average recovery was 101. 8% (RSD 2. 3%)． Conclusion:The present methods
are simple，accurate with good reproducibility，and could be used to control the quality of Caesalpinia minax．
［Key words］ Caesalpinia minax;diterpene;vis-spectrophotometry;quantitative determination
苦石莲为豆科云实属植物喙荚云实的种子，性
凉、味苦，有清热解毒、化湿、散瘀止痛功效，主治风
热感冒、痢疾、淋浊、痈肿、跌打损伤等［1］。化学及
药理研究表明其中所含的二萜类化合物为具有抗肿
瘤、抗病毒等多种生物活性，是其发挥药效的重要物
质基础［2］。本文前期对苦石莲的化学成分做了大
量的研究，发现其种仁富含卡萨烷型二萜，结构多具
有呋喃环或呋喃内酯结构，并表现出显著的生物活
性［3-6］。为对苦石莲种仁中的二萜成分进行深入探
讨，本文采用紫外-可见分光光度法对总二萜的提取
工艺以及含量测定方法进行了研究，确立了简便、可
行的含量测定方法，旨在为苦石莲质量的综合评价
及质量标准研究提供依据。
1 材料
苦石莲(购自安国市昌达中药材饮片有限公
司)经沈阳药科大学路金才教授鉴定为豆科云实属
Caesalpinia 植物喙荚云实 Caesalpinia minax Hance
的干燥种子;caesalpinins K 对照品(本研究室自制，
经 NMR，HPLC测定，纯度 ＞ 98%) ;其余试剂(分析
纯，市售)。
·48·
第 19 卷第 6 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.06.043
UV-1700 型紫外分光光度计(日本岛津公司) ，
AB135-S型电子天平(上海梅特勒—托利多仪器有
限公司) ，FW177 型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪
器有限公司) ，KQ-250DB 型数控超声波清洗器(昆
山市超声仪器有限公司)。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的制备 精密称定经五氧化二磷减
压真空干燥 24 h的 caesalpinins K对照品 6. 20 mg置
50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得 124 mg·
L －1的 caesalpinins K对照品溶液。
2. 2 供试品溶液的制备 精密称取本品的干燥粉
末(粉碎过 60 目筛)约 0. 5 g，置索氏提取器中石油
醚脱脂 4 h，挥干石油醚，干燥至恒重，置 50 mL具塞
三角瓶中，精密加入乙酸乙酯 25. 0 mL，称重，25 ℃
下 100 Hz超声提取 40 min，补足失重，滤过，残渣再
加乙酸乙酯 25. 0 mL，称重，25 ℃下 100 Hz 超声提
取 40 min，补足失重，滤过，合并 2 次滤液，混匀，精
密量取续滤液 2. 0 mL置 10 mL量瓶中，用甲醇稀释
至刻度，摇匀，经 0. 45 μm 滤膜滤过，作为供试品
溶液。
2. 3 测定波长的选择 取上述对照品溶液 0. 2 mL
供试品溶液 2 mL，分别置于 10 mL具塞磨口试管中
水浴挥干溶剂;各加新鲜配制的 5%香草醛-冰乙酸
溶液 0. 2 mL、高氯酸 0. 8 mL，摇匀，闭塞，80 ℃水浴
中加热 20 min;取出，流水冷却，分别加冰乙酸 5. 0
mL，摇匀，30 min 后用分光光度计于 400 ～ 800 nm
处进行光谱扫描，以不加对照品的随行试剂为空白。
结果表明，caesalpinins K 对照品溶液和供试品溶液
均在 530 nm波长处有最大吸收，故选取 530 nm 为
测定波长。
2. 4 测定方法 精密量取上述供试品溶液 2. 0 mL
置 10 mL具塞磨口试管中水浴挥干溶剂;加新鲜配
制的 5% 香草醛-冰乙酸溶液 0. 2 mL、高氯酸 0. 8
mL，摇匀，闭塞，80 ℃水浴中加热 20 min;取出，流水
冷却，加冰乙酸 5. 0 mL，摇匀，静置 30 min后用分光
光度计在 530 nm波长处测定吸光度，以 caesalpinins
K为对照品，按回归方程计算总二萜的含量。
2. 5 标准曲线的绘制 精密量取 2. 1 项下对照品
溶液 0. 1，0. 15，0. 2，0. 25，0. 3 mL，分别置于 10 mL
具塞试管中，水浴挥尽溶剂，按 2. 4 项下的方法显色
并测定吸光度，以 caesalpinins K 浓度(ρ，mg·L －1)
为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，算得
回归方程为:Y = 0. 108X + 0. 053(r = 0. 999 5) ，表明
质量浓度在 2. 0 ～ 6. 1 mg·L －1线性关系良好。
2. 6 提取方法的选择 称取干燥的苦石莲种仁粉
末(粉碎过 60 目筛)约 0. 5 g，精密称定，经石油醚
脱脂后，分别按下述 3 种方法提取:①加热回流提取
法:加乙酸乙酯 25 mL，称重，95 ℃水浴加热回流提
取 2 h;②超声提取法:加乙酸乙酯 25 mL，称重，25
℃下 100 Hz超声提取 1 h;③索氏提取法:加乙酸乙
酯 25 mL，称重，用索氏提取器于 95 ℃水浴回流提
取 2 h(每小时抽提次数不少于 4 次)。
分别补足失重，滤过，按 2. 4 项下的方法测定吸
光度，计算含量，结果加热回流法提取测得总二萜含
量与超声提取法相当，索氏提取法效率最低，经综合
考虑选择较为简便的超声提取法。
2. 7 正交试验法优化总二萜的超声提取工艺 本
实验选取提取次数(次)、乙酸乙酯体积(mL)、提取
时间(min)作为考察因素，每个因素各取 3 个水平，
见表 1。应用 L9(3
4)正交表安排试验，实验数据见
表 2。通过正交试验和数据处理发现，影响苦石莲
总二萜提取率的因素主次顺序为 A ＞ B ＞ C，综合考
虑最终确定条件为 A2B2C3 即乙酸乙酯体积为 25
mL，25 ℃下 100 Hz超声提取 2 次，每次 40 min。
表 1 提取的因素和水平
水平
因素
A /times B /mL C /min
1 1 10 20
2 2 25 30
3 3 40 40
表 2 苦石莲中总二萜提取率正交试验
No． A B C 空列 含量 /%
1 1 1 1 1 0. 481
2 1 2 2 2 0. 546
3 1 3 3 3 0. 526
4 2 1 2 3 0. 576
5 2 2 3 1 0. 599
6 2 3 1 2 0. 598
7 3 1 3 2 0. 577
8 3 2 1 3 0. 600
9 3 3 2 1 0. 580
K1 0. 518 0. 545 0. 560
K2 0. 591 0. 581 0. 567
K3 0. 586 0. 568 0. 567
R 0. 073 0. 037 0. 007
2. 8 重复性试验 取同一批号的样品 6 份，按 2. 4
项下的方法测定并计算总二萜的平均含量为
0. 57%，RSD 2. 6%，表明该方法重复性良好。
·58·
韩瑞亭，等:苦石莲中总二萜的含量测定
2. 9 稳定性试验 取同一供试品溶液，按 2. 4 项下
的方法，分别于 5，10，20，30，40，50，70，90 min 测定
吸光度，结果 30 min内吸光度变化幅度较大，30 min
至 90 min吸光度变化幅度较小，RSD 1. 8%，表明供
试品溶液经显色后在 30 min 至 90 min 内稳定性良
好，故宜在显色 30 min后测定吸光度。
2. 10 加样回收率试验 精密称定已知含量的样品
粉末(过 60 目筛)约 0. 25 g，共 6 份，分别精密加入
caesalpinins K对照品约 1. 5 mg，按 2. 2 项下的方法
制备加样回收率供试品溶液，依法测定，结果见
表 3。
表 3 总二萜的加样回收率
称样量
/ g
样品中
含量 /mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回
收率 /%
RSD
/%
0. 250 3 1. 43 1. 52 2. 98 102. 28
0. 250 7 1. 43 1. 50 2. 93 100. 10
0. 251 1 1. 43 1. 48 2. 97 103. 88
101. 8 2. 30. 250 2 1. 43 1. 51 2. 91 97. 95
0. 251 8 1. 44 1. 47 2. 94 102. 59
0. 250 9 1. 43 1. 52 3. 01 104. 15
2. 11 样品含量测定 分别精密称取 3 个不同批次
的苦石莲样品粉末各 3 份，每份约 0. 5 g，制备成供
试品溶液，按 2. 4 项下的方法测定，用回归方程计算
苦 石 莲 中 总 二 萜 的 平 均 含 量 为 0. 57%，
RSD 1. 25%。
3 讨论与结论
目前尚无文献报道苦石莲中总二萜的含量测定
方法，苦石莲中已鉴定结构的二萜类化合物多数为
呋喃二萜类化合物［2］，该类化合物与三萜类化合物
生合成途径相似，同时也具有与香草醛 /冰乙酸-高
氯酸显色剂显色的相关基团，故参考三萜类化合物
的显色方法进行显色和测定，经试验供试品和
caesalpinins K 对照品依法显色后均在 530 nm 处有
最大吸收，基于此并参考相关文献［7-10］本实验建立
了苦石莲中总二萜的含量测定方法，并进行了方法
学考察。实验中先用石油醚脱脂再用溶剂提取后制
成供试品溶液，可以基本消除脂溶性成分的干扰。
通过对提取方法进行考察，表明超声提取和热回
流提取效率相近，考虑到热回流法比较费时，且提取
得出总二萜量并不明显高于超声提取法，故选择相对
简便、易行的超声提取法。另外，通过正交试验对超
声提取工艺进行了优化，综合考虑，得出超声提取的
最佳工艺为 A2B2C3 组合，即乙酸乙酯体积为 25 mL，
25 ℃下 100 Hz提取 2次，每次提取时间为 40 min。
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［责任编辑 顾雪竹］
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第 19 卷第 6 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013