全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 29( 6): 665～ 670, 2003
Journal of Zhejiang Un iversity ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2002-09-08
作者简介: 包志毅 ( 1964— ) ,男 ,浙江东阳人 ,博士 ,高级工程师 ,从事园林植物材料及其应用、生态园林和景观生态的研究与
实践。 Tel: 0571-85114350; E-mail: bao zy@ mail. h z. zj. cn.
文章编号: 1008-9209( 2003) 06-0665-06
应用 RAPD分析红 木变异类型的遗传多样性
包志毅 1 , 张 华 1 , 包劲松2 , 黄 哲 3
( 1. 浙江大学园艺系 ,浙江 杭州 310029; 2. 浙江大学核农所 ,浙江杭州 310029; 3. 长沙市园林科学研究所 , 湖南 长沙 410003)
摘　要: 用随机扩增多态性 DNA技术 ( RAPD )分析了 27份 木材料的遗传多样性 ,包括 24个红 木
变异类型 , 1个长红 木 ( 木的另一变种 )及 2个原种 木材料。共筛选了 180个随机引物 ,其中 16个
引物能产生清晰的扩增带且多态性明显。共产生 119条带 ,平均每个引物产生 7. 4条 ,其中多态性带 96
条 ,多态性比例为 80. 7%。 对 RAPD数据进行 UPGM A聚类分析 ,结果表明: 27个样本共分为 5个聚
群 ,聚群内各样本之间没有明显的共同特征 ,但各小聚类组内各样株基本上有相同的叶色或花色。 2个
木原种、长红 木与 8个红 木类型形成了一个大聚群 , 2个 木原种与 2个红 木小叶类型亲缘关
系很近。 木与长红 木的距离小于 木与红 木之间的距离。
关　键　词: 红 木 ; 遗传多样性 ; RAPD
中图分类号: S792. 21　　　文献标识码: A
BAO Zhi-yi1 , ZHANG Hua1 , BAO Jin-song2 , HU ANG zhe3 ( 1. Dept. of Horticulture , Zhejiang Uni-
versity , Hangzhou 310029, China; 2. Institute of N uclear Agricultural Sciences, Zhejiang University ,
Hangzhou 310029, China; 3. Institute of Landscape Gardening Research, Changsha 410003, China )
Analysis of genetic diversity among Loropetalum chinense var. rubrum by RAPD. Journal o f Zh ejiang
Univ er sity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2003, 29( 6): 665-670
Abstract: Random amplified polymo rphic DN A ( RAPD) tech nique w as applied analyzing a to tal of 27
Loropetalum chinense samples including 24 accessions of Loropetalum chinense va r. rubrum ( No. 1-21,
25-27) , 1 accession of L . chinense va r. semper -rubrum ( No. 22) , and 2 accessions of L . chinense ( No.
23-24) . Six teen out 180 random primers w ere selected w hich produced distinct bands, show ing unmis-
takable po lymorphism. A to ta l of 119 bands w ere display ed, among which 96 w ere po lymo rphic, attain-
ing a po lymo rphic rate of 80. 7% . Unw eighted pair-g roup mathematic analy sis ( U PGM A) was conduct-
ed on the basis of these RAPD data and disclo sed that fiv e g r oups could be distinguished w ith 27 acces-
sions. It seemed that these g roups did no t co rr elate clo sely with leaf or flow er colo r, but the re w ere
similarities fo r lea f and /o r flowe r color in some mino r g r oups. Tw o accessions o f L . chinense w ere
closely r ela ted to 2 small-lea f accessions o f L . chinense var. rubrum . The distance betw een L . chinense
and L . chinense var. semper -rubrum w as sho rter than that be tween L . chinense and L . chinense va r.
rubrum .
Key words: Loropetalum chinense va r. rubrum ; Genetic div er sity; RAPD
　　红 木是中国原产的优良观赏植物。 近几
年来以其突出的观赏特性、较强的适应性及广
泛的园林用途在园林绿化中得到很快推广。红
木品种在美国正成为畅销园林苗木。湖南的
红 木已大量销售到江、浙、粤、鄂等近 20个省
市 ,并传播到日本、新加坡、港澳台等国家和地
区。目前 ,关于红 木的系统研究还远远不够深
入 ,品种分类工作相当滞后 ,这将阻碍其进一步
的推广、交流及在国际市场上的竞争力。随着红
木的大规模生产、应用和迅速推广 ,就出现了
品种命名、栽培等方面的大量技术问题。红 木
花色、叶色、叶形、株型差异很大 ,花色有粉红、
红、紫红 ;老叶叶色有黄绿、暗红 ;嫩叶为不同灰
紫色系。花色、叶色色彩繁多 ,深浅不一 ,预示了
丰富的遗传多样性。红 木在园林绿化中的应
用潜力很大 ,但品种过于单一 ,且优良品种或类
型尚未得到充分发掘和利用 ,还没有发挥红
木丰富的品种资源优势。
　　关于红 木遗传多样性的研究在国内外均
相对较少。 在国外 , Gaw el等用随机多态扩增
DNA ( random amplified polymo rphic DN A,
RAPD)来鉴定 14个红 木样本与 2个 木样
本的遗传多样性 [1 ]。对 RAPD数据进行 U PG-
M A聚类分析 ,结果表明所有的样本可分为 4
个组 ,发现在每个组内各样本的叶与 (或 )花颜
色类似 ,但它们的叶与 (或 )花颜色并不绝对相
关。Gaw el等认为红 木是近几年才引入美国 ,
几乎没有有关这些类型成年时的表现型的资
料 [1 ]。迄今为止 ,大多数形态比较都在非成年类
型上进行。虽然有些品系在幼年时看起来很相
象 ,但成年时可能会明显不同。 反过来 ,如果遗
传上分离的无性系在形态上无法区分 ,这些无
性系就会被认为是同一品种。在国内 ,唐前瑞进
行了红 木的遗传多样性及其叶色变化的生理
生化研究 [2 ] ,从收集到的 14个红 木材料和 2
份 木材料的形态特征、生物学特性入手 ,运用
分子生物学手段 ,对红 木的遗传多样性及亲
缘关系进行了研究 ;同时对红 木叶色转变的
生理生化变化、叶绿体超微结构及花色素苷的
稳定性等方面进行了研究和分析 ,得到了一些
有益的结论。
　　目前 , RAPD技术已广泛应用于遗传连锁
图谱的构建、谱系分析和遗传多样性的研
究 [ 1～ 4]。本研究采用 RAPD分子标记技术 ,分析
了 24个红 木变异类型、 1个长红 木与 2个
木原种材料的遗传变异程度 ,以期为红 木
的分类、品种保护与育种利用提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　 24个红 木材料采自长沙市园林科学研
究所的红 木资源圃 ,编号为 1-21和 25-27。当
时每个变异类型均为 4～ 7年生的实生苗 ,植株
分别来自湖南浏阳等地。 22号材料是长红
木 ,是 木的另一变种 ,采自江西萍乡市白鹤村
桐坑一棵树龄达 300年以上的植株 ; 23号、 24
号是 木原种 ,位于浏阳市青草乡林场 (野外山
坡上 ) ;从以上 27个材料采集叶片并用硅胶
干燥。
1. 2　方　法
1. 2. 1　 DNA提取与纯化　　 DNA提取采用
CTAB法 ,参照 Stew ard和 Via方法进行 [5 ] ,并
略作修改。
1. 2. 2　 RAPD引物筛选　　扩增反应所使用
的引物购自上海生工公司提供 0. 2OD的小包
装 , 10碱基序列。从 S1～ S120、 S201～ S220、
S311～ S330、 S501～ S520共 180个引物中筛
选出 16个引物 (表 1)。
1. 2. 3　 DNA扩增　　扩增反应体系为 20
μL, 包括 10× PCR缓冲液 2μL; dN T P各 250
μmol /L; Taq酶 1单位 ; M gCl2 1. 5 mmol /L ,
DN A 50 ng ,每种引物 5 pmo l /L。 PCR反应在
PCR EXPRESS HYBAID热循环仪中进行 , 94
℃ 预变性 5 min;随后 94℃变性 45 s, 38℃退
火 1 min, 72℃延伸 1 min,如此循环 40次 ;最
后 72℃延伸 7 min。
1. 2. 4　电泳与数据统计　　取 10μL反应产
物 ,加入约 3μL上样缓冲液 , 于含溴化乙锭的
1. 2%琼脂糖凝胶上 ,在 4 V /cm的电压下 , 0. 5
× TBE电泳缓冲液中电泳约 3. 5 h。 分子量标
准用 100 bp DN A Ladder。电泳结束后在紫外
透射仪上拍照。
　　以分子量标记为依据 ,确定扩增产物的位
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置。将重复性好、清晰的谱带记为 1,不出现记
为 0。所得数据矩阵用 PAUP 4. 0b7软件 ( phy-
logenetic analysis using pa rsimony )进行分
析 [6 ] ,距离用平方平均距离 ( squa red average
distance, DISTSQ)表示。所得的距离矩阵采用
U PGM A( unweighted pair-g roup method wi th
a ri thmetic means, 未加权成对组算术平均法 )
进行聚类。 靴带检验 ( boo tst rap test )值是从
500次重复计算所得。
2　结果与讨论
2. 1　引物筛选
　　 16个随机引物共产生 119个扩增产物 ,平
均每个引物产生 7. 4个扩增产物。其中共有条
带 23条 ,多态性带 96条 ,多态性比为 80. 7%
(表 1)。每个随机引物扩增的可记录谱带数在 5
条 ( S7、 S72、 S108)到 11条 ( S80、 S83)之间。谱
带的分子量大小均在 0. 2～ 3. 0 kb之间。
表 1　 16个随机引物对 27个材料扩增的多态性
Table 1　 Genet ic polymorphism in 27 L . ch inense t axa w i th
16 primers
引物 序　　列 总带数 多态性带 多态性率 /%
S3 CATCCCCCT G 6 5 83. 3
S4 GGACT GGAGT 7 6 85. 7
S5 TGCGCCCT TC 9 8 88. 8
S7 GGTGACGCAG 5 4 80. 0
S25 AGGGGTCT TG 7 5 71. 4
S27 GAAACGGGTG 6 5 83. 3
S31 CAATCGCCGT 8 7 87. 5
S51 AGCGCCATT G 9 8 88. 9
S68 TGGACCGGTG 7 5 71. 4
S72 TGTCATCCCC 5 3 60. 0
S73 AAGCCTCGTC 9 7 77. 8
S80 ACT TCGCCAC 11 9 81. 8
S83 GAGCCCTCCA 11 10 90. 9
S108 GAAACACCCC 5 4 80. 0
S314 ACAGGT GCTG 7 6 85. 7
S516 C TCTGCGCGT 7 6 85. 7
总计 119 96 80. 7
　　从引物 S7的扩增图谱 (图 1)来看 ,该引物
在 27个样本中共产生 5个扩增产物 ,其中 4个
是多态的 ,约在 0. 42 kb处 ,有一条带是 12号、
15号、 27号所特有的。 S7对每个样本都有显著
的扩增带 ,但却不能区分 2号与 6号 , 10号与
14号 , 18号、 21号与 25号。引物 S25、 S31对每
个样本都有相互差异的扩增谱带 (图 2、图 3)。
S25共产生了 7个扩增产物 ,其中 5个是多态
的 ,在 0. 57 kb处产生了 24号样本的特异性
带。在 0. 7 kb处 ,除了 14号、 22号无带 ,其他各
样本均有扩增带。
M为分子量标准 ; 1～ 27为样本号 .
图 1　引物 S7的 RAPD图谱
Fig. 1　 RAPD prof iles of 27 L . chinense taxa w ith
primer S7
M为分子量标准 ; 1～ 27为样本号 .
图 2　引物 S25的 RAPD图谱
Fig. 2　 RAPD prof iles of 27 L . chinense taxa w ith
primer S25
M为分子量标准 , 1～ 27为样本号 .
图 3　引物 S31的 RAPD图谱
Fig. 3　 RAPD prof iles of 27 L . chinense taxa w ith
primer S31.
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2. 2　距离矩阵
　　 27个样本两两间的距离矩阵见表 2。 由表
2可见 , 13与 22、 23之间的距离最远 ,都是
0. 424; 18与 21的距离最近 ,只有 0. 091,其他
则介于 0. 091～ 0. 424之间。红 木各类型之间
的遗传距离在 0. 091～ 0. 406之间 , 2个 木与
24个红 木之间的遗传距离在 0. 176～ 0. 424
之间 ,平均值为 0. 280。 2个 木与长红 木 ( 1
个 )之间的遗传距离分别为 0. 23与 0. 261,平
均值为 0. 246。说明 木与红 木之间的距离
大于 木与长红 木之间的距离。
2. 3　聚类分析
　　图 4是根据 119条 RAPD带进行 U PG-
M A分析所得的树状分类图。 由图 4可见 , 27
个样本可初步划分为 5个聚群。 第 1个聚群有
1号 , 25号和 2号 ;第 2个聚群有 3号 , 5号 , 6
号 , 18号 , 21号 , 19号 , 20号 , 23号 , 24号 , 11
号和 22号 ;第 3个聚群有 8号 , 10号和 14号 ;
第 4个聚群有 4号 , 26号 , 17号 , 12号 , 27号 ,
15号 , 7号和 9号 ;第 5个聚群有 13号与 16
号。根据形态、花色、叶色等性状的考察结果 (张
华 , 2002) ,各个聚群内部所有的类型之间并不
能找出一个显而易见的共同特征 ,但各个聚群
中的小聚类组在形态上有明显的共同之处。
　　在第 1个聚群中 , 1号与 25号这两个样本
之间的距离较近 ,因为 25号采自一个与 1号具
有相同形态特征 (绿叶红花 )的植株上的一个绿
叶白花 (原种 木的形态特征 )的变异枝条 ,尽
管形态上差异很大 ,但从 RAPD分析来看 ,二
者的亲缘关系是很近的。
　　在第 2个聚群中 , 3号与聚群内其它类型
遗传关系最远 ,其次为 22号 ,再者是 11号。 3
号的花属于浅粉色 ,是所有调查类型中花色最
淡的 ,其新叶萌发最迟 ,属于先花后叶类型。 22
号是长红 木 ,它与聚群内其它类型的距离也
较远。 23号与 24号这两个 木原种聚为一小
组 ,它们的花瓣形状有差别 , 19号与 20号 2个
小叶类型聚在一起 ,且与 23号、 24号的距离较
近。 18号与 21号聚在一起 ,且支持率高达 90,
它们春季花色相同 ,新叶颜色、叶形、花形都很
相近 ,只是 21号的花瓣稍大一点。
　　在第 3个聚群中 , 8号与 10号春季新叶颜
　　 ( 1-21, 25-27) -L . chinense var. rubrum; 22-L .
ch inense var. semper-rubrum; ( 23-24) -L . ch inense.
图 4　 27个样本的 UPGMA分析图
Fig. 4　 Clus ter analysi s of RAPD data using
U PGMA m ethod
色相同 ; 8号与 14号的花瓣均较大 ,且均出现 5
个花瓣的小花。 但 10号在其它形态指标如株
型、老叶颜色、叶片大小等方面与 8号差异
很大。
　　在第 4个聚群中 , 4号、 26号与 17号形成
一个小聚类组 , 4号与 26号的支持率达 80, 4
号、 26号与 17号秋季花色相同 ,且 4号与 17
号春季花色也相同 ; 12号、 27号、 15号也聚在
一起 ,它们的花色都是紫红色 ,叶色都属于暗紫
色或黑褐色 ,植株均健壮 ; 7号与 9号叶色与花
色都相近。
　　在第 5个聚群中 , 13号是在夏季调查时唯
一开花的类型 ,它与观叶的 16号聚在一起。 从
形态上观察 ,这两个类型无论是叶色、花色均未
发现有必然的联系。
　　本研究表明用 RAPD分子标记技术可以
将 27份 木材料都区分开来 ,实验证明它是一
种分析种内个体之间遗传多样性的有效方法。
669　第 6期 　 包志毅 , 等: 应用 RAPD分析红 木变异类型的遗传多样性 　 　　　　
形态调查表明红 木各类型形态上差异显著 ,
RAPD分析结果反映了 木种内存在丰富的
遗传多样性 ,但并不与形态的多样性完全相关。
这些结果为通过选择、种内杂交等手段改良红
木 ,培育观赏价值更高的优良品种提供了理
论基础。
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2002. ( in Chines e)
“杭嘉湖平原农业面源污染控制技术研究
及其示范样板建设”通过鉴定
　　 2003年 1月 23日 ,由环资学院徐建明教授主持的浙江省科技重点项目“杭嘉湖平原农业面源污染控制技术研
究及其示范样板建设”通过了省科技厅主持的科技鉴定。
由来自中国科学院南京土壤所、南京农业大学、中国科学院北京生态环境研究中心、浙江省农科院、浙江省环
科院、杭州市环科所、浙江大学农生院和环资学院的专家教授组成的鉴定委员会 , 认真听取了项目组的总结汇报 ,
审阅了提供鉴定的全部技术文件 、查新报告 , 评审组一致认为:该项目通过政府及有关部门、高等学校和实施区域
农村的紧密结合 ,科技人员、管理干部和农民群众的积极参与 ,建立了我国第一个水网平原地区农业面源污染控制
技术的综合示范样板 ,所提出的一整套结合实际的农业面源污染物控制与减排的综合集成技术和所建立的基于
WebGIS防治农业面源污染的决策咨询系统有重大创新 ,达到国际先进水平。 成果对于控制农业面源污染 ,加快推
进全面建设小康社会具有重要的现实意义 ,社会、生态和经济效益显著 ,推广应用前景广阔。
—— 浙江大学环资学院　　　　
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