全 文 ：广东农业科学 2015 年第11期108
收稿日期：2014-12-24
基 金 项目 ：广 东 省 科 技 计 划 农 业 攻 关 项目
（2012A020602038）；2011年高等学校博士学科点专项科研
基金（20114404120022）
作者简介：周丽萍（1985-），女，在读硕士生，E-mail：
zhouliping08417@126.com
通讯作者：曹庸（1966-），男，博士，教授，E-mail：
caoyong2181@scan.edu.cn
山莓叶抑制家兔离体肠管运动活性物
的分离纯化及活性研究
周丽萍1，陈雪香2，刘晓娟2，常云佩2，肖林平1，钟晨晨1，曹 庸2
（1. 中国广州分析测试中心/广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070；
2. 华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）
摘 要：为明确山莓叶中抗腹泻的药效成分，利用溶剂萃取、常压柱层析、中压柱层析对山莓叶中的活性成分
进行分离纯化，采用家兔离体肠实验检测抗腹泻活性，并对活性单体进行结构鉴定。结果表明：山莓叶中抑制离
体肠效果好的化合物是对羟基肉桂酸乙酯，当其浓度为 20 mg/mL 时，离体肠张力增量的变化率达到 70.0%，强于
阿托品的抑制效果。
关键词：山莓叶；离体肠；分离纯化；对羟基肉桂酸乙酯
中图分类号：S853.71 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2015）11-0108-05
Isolation，purification and activity of active components
from Rubus corchorifolius leaves and their inhibition
effects on movement of isolated rabbit intestinal
ZHOU Li-ping1，CHEN Xue-xiang2，LIU Xiao-juan2，CHANG Yun-pei2，
XIAO Lin-ping1，ZHONG Chen-chen1，CAO Yong2
（1. Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology，
China National Analytical Centre，Guangzhou 510070，China；
2. College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）
Abstract：In order to ensure the anti-diarrhea components from Rubus corchori folius leaves，the active components
from R. corchori folius leaves were isolated and purified using solvent extraction，column chromatography and middle
pressure column chromatography，and their anti-diarrhea activities were determined through the movement of isolated
intestinal of rabbit，meanwhile，the structure of active monomer was identified. The results showed that the component
which had anti-diarrhea activity on isolated intestinal was P-hydroxy ethyl cinnamate in R. corchori folius leaves，when
the concentration was 20 mg/mL，the change rate of tension increment of isolated intestinal reached 70.0%，and its
inhibition effect was better than that of atropine.
Key words：Rubus corchori folius leaves；isolated intestinal from rabbit；isolation and purification；P-hydroxy
ethyl cinnamate
腹泻是常见的畜禽多发病，业已成为现代畜牧
业发展的重要障碍。抗生素的应用是治疗该病的主
要措施，并取得了良好的效果。但随着抗生素的大
量使用，出现了病原菌抗药性增强、畜禽产品药物残
留增加和环境污染严重三大问题，已成为危害人类
健康、制约我国畜牧业发展的瓶颈。近年来，许多国
家先后做出限用或禁用抗生素作为饲料添加剂的决
定，如欧盟已从 2006 年 1月开始在所有成员国全面
禁止使用抗生素作饲料添加剂，对进入欧盟的畜禽
产品执行严格的药检制度。因此，寻求高效、低毒、
低残留和低耐药性药物已成为防治畜禽腹泻迫切需
要解决的问题［1-2］。我国中药民族药种类多，来源广
泛，中草药含有某些特异性生理活性物质，长期使用
被认为是相对安全的抗生素替代物［3］。因此，从天然
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2015.11.020
109
中草药中寻找安全有效的抗腹泻药物，对于解决抗
生素残留问题，提高生产率，发展绿色畜牧业，满足
人们的食品安全需求，缩小我国畜牧业与发达国家
差距，增强我国畜禽产品在国际市场上的竞争力，具
有重要的经济意义和社会效益。
山莓（Rubus corchori folius L.f）是蔷薇科悬钩子
属植物，是湘西、鄂西北等地区少数民族长期使用的
传统中草药，在湘西地区群众常将嫩叶捣碎饲喂动
物治疗腹泻，效果良好，是民间公认安全、有效的抗
腹泻秘方［4］。目前，国内外对山莓的研究主要集中在
资源利用方面，利用其聚合果进行食品加工，利用其
鞣质作为化工原料等。在活性研究方面，本实验室
前期研究表明，山莓叶 80% 乙醇提取物（下称山莓
叶醇提物）能显著抑制兔离体十二指肠的运动［5］，并
对番泻叶、蓖麻油和致泻大肠埃希氏菌导致的小鼠
腹泻有显著抑制作用［6］，得出了最佳提取活性物质
的条件以及山莓叶乙酸乙酯提取物对抑制兔离体肠
管张力和频率的影响最显著［7］。本研究在此基础上，
对山莓叶乙酸乙酯层萃取物中的抗腹泻活性物质的
分离纯化进行了系统研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试山莓叶采于吉首大学张家界校区后山，经
吉首大学城乡资源与规划学院廖博儒副教授鉴定
为蔷薇科悬钩子属植物山莓（Rubus corchori f olius
L.f）。将采集的山莓叶阴干，粉碎过孔径 930 μm 筛，
备用。供试的新西兰兔购于南方实验动物中心，合格
证号为 SCXK（粤）2008-0020。石油醚、氯仿、乙酸
乙酯、乙醇及其他试剂均为分析纯；反相硅胶（三菱
化学）。
试验主要仪器设备有 BL-420S 型生物信号采
集处理系统、FT-100 型张力传感器（成都泰盟科技
有限公司）、LC-10ATVP plus 高效液相色谱仪（日本
岛津公司）、R204 旋转蒸发器（上海申生科技有限
公司）、FD-1PF 冷冻干燥机（北京德天佑科技有限
公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 山莓叶乙酸乙酯萃取物的提取 参照文献［8］
的方法。
1.2.2 样品的制备 精确称量第1 次中压柱层析样
品 0.2 g，溶于 1 mL 台氏液中，即配成含药 0.2 g/mL
的溶液。另因样品难溶于水，故使用对离体肠管运动
无影响的含乙醇 30% 的台氏液作为溶剂［5］，并取
1 mL 混合液作为对照品。考虑到第 2 次柱层析后所
得组分的质量偏低，因此，第 2 次柱层析分离后的样
品经冷冻干燥后，称取 0.1 g 溶于含 30% 乙醇的
1 mL台氏液中，即配成含药 0.1 g/mL的溶液。制备液
相分离后的样品经冷冻干燥后，称取 0.05 g 溶于含
30%乙醇的1 mL台氏液中，即配成含药 50 mg/mL的
溶液。
1.2.3 兔离体肠模型测定张力增量变化率 参照文
献［9］的方法。
1.2.4 山莓叶抑制家兔离体肠运动活性成分的分离
纯化 将山莓叶乙酸乙酯层萃取物首先经中压硅胶
柱色谱分离，洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯（100∶
0，50∶50，20∶80），乙酸乙酯与甲醇（100∶0，80∶1，
40∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1）进行梯度洗脱，洗
脱的流速为 15 mL/min，柱层析的检测波长分别为
220、265 nm，同时每管收集的流分量为 20 mL，共收
集 722 管，再经 TLC 检测，采用硫酸香草醛显色，合
并相同组分，共得 13 个组分，分别表示为 Fr.A~Fr.
M。然后对活性最强组分进行低压硅胶柱层析分离
纯化，用氯仿与甲醇进行梯度洗脱，每 20 mL 收集1
瓶，共收集 389 瓶，经 TLC 检测合并相同组分，共得
18 个组分，分别表示为 Fr.1~Fr.18。浓缩冻干后用于
抗腹泻活性检测和进一步分离纯化。
1.2.5 液相分析条件 色谱柱：Dikma Technologies
C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水为流动相，
梯度洗脱；检测波长 320 nm，流速为1 mL/min，进样
量为 20 μL。
1.2.6 Fr.13的净化及结构鉴定 根据 1.2.5 的液
相条件，将 Fr.13 用制备液相色谱法分 3 段（1～24
min、4～26.5 min、26.6～33 min）进行收集。对收集的
洗脱液进行浓缩，得 Fr.a、Fr.b、Fr.c。将活性强的组
分进行重结晶处理，得到山莓叶中主要活性化合物。
采用 1H NMR 和 13C NMR 鉴定其化学结构。
1.2.7 对羟基肉桂酸乙酯（EC）的抑制肠蠕动活性研
究 分别用含 30% 乙醇的台氏液，配制 5、10、20、
40、80、160 mg/mL 的对羟基肉桂酸乙酯溶液，及 5、
10、20、40、80、160 mg/mL 的硫酸阿托品药液，比较
羟基肉桂酸乙酯与硫酸阿托品对抑制家兔离体肠运
动的功效。
试验数据用 SAS 统计分析软件（V8）处理，采
110
用配对试验设计，组间数据采用 t检验。采用单因素
方差分析不同因素处理组之间张力增量变化率的差
异性。
2 结果与分析
2.1 乙酸乙酯层中压柱层析分离后的样品对家兔离
体肠管的抑制作用
由图 1 可知，组分 Fr .B 的张力增量变化率
为 -3%，可能具有促进肠蠕动的效果；组分 Fr.I、
Fr.J、Fr.K 张力增量变化率分别为 30%、64%、
29%；其他组分的张力增量变化率在 1%~15% 之
间，因此组分 Fr.J 的张力增量变化率远大于其他组
分；乙酸乙酯层萃取物张力增量变化率为 52%，小
于组分 Fr.J 的张力增量变化率。对其进行组间方
差分析得出，组分 Fr.J 对家兔离体肠的抑制效果明
显优于乙酸乙酯层和其他柱层析组分。说明山莓叶
乙酸乙酯层经全自动中压柱层析分离后得到了初步
纯化。
80
60
40
20
0
-20
张
力
增
量
变
化
率（
%）
i j
d g e e f
c
a
c
h
f
b
Fr.
A
Fr.
B
Fr.
C
Fr.
D
Fr.
E
Fr.
F
Fr.
G
Fr.
H Fr.
I
Fr.
J
Fr.
K
Fr.
L
Fr.
M
乙
酸
乙
酯
层
i
组分
图中小写英文字母不同者表示差异显著，图2、图3同
图 1 中压柱层析后各组分对家兔离体肠管张力增量变化率比较
2.2 中压柱层析组分 Fr.J柱层析分离后的样品对
家兔离体肠管的抑制作用
从图2 可以看出，Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.8的张力增
量变化率分别为 -10%、-8%、-3%、-6%，加样后使
肠蠕动的张力增加，具有促进肠蠕动的效果。Fr.13、
Fr.17的张力增量变化率分别为 48%、36%，远大于其
他组分的张力增量变化率。但由显著性差异分析可
知，Fr.17 样品加入后与加样前比较，抑制肠蠕动的张
力变化并无显著差异。因此结合显著性差异分析和
张力增量变化率情况，Fr.13 样品抑制家兔十二指肠
蠕动的效果显著，具有抗腹泻活性。Fr.J 的张力增量
变化率为 29%，根据方差分析得出，Fr.13 对家兔离
体肠的抑制效果明显优于 Fr.J 和其他柱层析组分，
说明 J 层样品中具有抗腹泻效果的成分经低压柱层
析分离后又得到一定的纯化。组分不同其抑制家兔
肠运动活性也存在差异，随着样品的洗脱分离，到
Fr.17 组分时，其抑制蠕动的活性很小，说明活性物基
本上被洗脱分离。Fr.13样品即为所得的活性部位。
60
40
20
0
-20
张
力
增
量
变
化
率（
%）
Fr.
1
Fr.
2
Fr.
3
Fr.
4
Fr.
5
Fr.
6
Fr.
7
Fr.
8
Fr.
9
Fr.
10
Fr.
11
Fr.
12
Fr.
13
Fr.
14
Fr.
15
Fr.
16
Fr.
17
Fr.
18 Jr.
J
层析柱组分
i
e
m l
l
k k
e d
h gh
a
d
g
f
b
c
j
l
图 2 Fr.J分离组分对家兔离体肠管张力增量变化率的影响
111
2.3 Fr.13制备液相净化后样品对家兔离体肠管的
抑制作用
由图3可知，Fr.a、Fr.b、Fr.c的张力增量变化率分别
为10%、47%、32%，而Fr.13的张力增量变化率为29%，
Fr.b、Fr.c 对家兔离体肠的抑制效果明显优于 Fr.13。
说明活性组分净化后，其抗腹泻活性又得到提高。
2.4 Fr.13分离纯化后的液相检测及结构鉴定
采用一维核磁 1H-NMR 和 13C-NMR 对化合
物的结构进行分析。其理化数据为：1H-NMR 谱
数据（600MHz，CDC l 3）为：δ：1.31（3H，t，
J=7.1Hz，-CH3）；4.24（2H，q，J=7.1Hz，-CH2-O-）；
6.28（1H，d，J=16Hz，H-2）；6.82（2H，d，J=8.6Hz，
H-3，5）；7.41（2H，d，J=8.6Hz，H-2，6）；7.63（1H，
d，J=0.4Hz，H-3）。13C-NMR 谱数据（600MHz，
CDCl3）为：δ：167.51（C=O），158.0（C-4），144.83
（C-7），129.9（C-2，6），126.9（C-1），115.90（C-3，
5），114.92（C-8），60.58（-O-CH2-），14.58（-CH3）。
以上数据与文献［10］对照基本一致，故确定该化合
物为对羟基肉桂酸乙酯。图 3 不同分离组分对家兔离体肠管张力增量变化率的影响
60
50
40
30
20
10
0
张
力
增
量
变
化
率（
%）
组分
Fr.a Fr.b Fr.c Fr.13
d
a
b
c
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
响
应
值（
MV
）
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Fr.a
Fr.b
Fr.c
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5
保留时间（min）
2.5 对羟基肉桂酸乙酯对家兔离体肠运动的影响
从图 5 和图 6 可以看出，加入 40 mg/mL 的对羟
基肉桂酸乙酯后，兔离体肠管的收缩幅度逐渐减小，
肠管蠕动张力明显减弱，且对肠蠕动的抑制效果较
同浓度阿托品更强，说明对羟基肉桂酸乙酯有很好
的抑制兔离体肠蠕动的活性。
从图 7 可以看出，阿托品和对羟基肉桂酸乙
酯都有很好的抑制兔离体肠管运动的作用，在加
入 20 mg/mL 对羟基肉桂酸乙酯时，对兔离体肠管
的运动张力抑制作用达到最大、为 70.0%。并且在
5~160 mg/mL 浓度范围内，对羟基肉桂酸乙酯对兔离
体肠管的运动张力抑制作用明显强于阿托品。
图 4 Fr.13液相检测图谱增量变化率的影响
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
质
量（
g）
0 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 205 215
EC
时间（s）
图 5 40 mg/mL对羟基肉桂酸乙酯（EC）加入前后对兔离体肠管的影响
甲
醇
含
量（
%）
112
80
60
40
20
0
张
力
增
量
变
化
率（
%）
5
浓度（mg/mL）
EC
Atr
10 20 40 80 160
图 7 对羟基肉桂酸乙酯及阿托品对家兔离体肠
张力增量变化率的影响
3 结语
山莓叶属于民间抗腹泻草药，山莓叶乙酸乙酯层
多次柱层析分离纯化后对家兔离体肠管抑制作用的
试验结果表明，其活性物质主要是对羟基肉桂酸乙
酯，当其浓度为 20 mg/mL 时，其张力增量变化率达
到 70.0%。而 200 mg/mL 乙酸乙酯层萃取物对兔离
体十二指肠的张力减小百分率仅为 63%［7］，因此山
莓叶分离纯化后的组分抗腹泻效果明显。本试验深
入研究了山莓叶中抗腹泻成分的物质基础，确定了
抗腹泻组分，为今后大量富集奠定了基础。同时，本
试验首次发现对羟基肉桂酸乙酯存在于山莓叶的提
取物中。有研究报道沙姜中肉桂酸乙酯类化合物具
有抗促癌作用［11］，可能山莓叶中也存在一定的抗肿
瘤效果的物质，这为今后更好地研究山莓叶的利用
价值提供了一定基础。
参考文献：
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图 6 40 mg/mL阿托品（Atr）加入前后对兔离体肠管的影响
1.2
1.0
0.7
0.5
0.2
0
质
量（
g）
Atr
0 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 205
时间（s）
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（责任编辑 崔建勋）