全 文 ：木旬子试管苗蛭石支撑生根培养及炼苗移栽研究
柴慈江 ,史燕山 ,骆建霞 ,卢兴霞 ,王丹 ,刘颖 ,马秋英　(天津农学院园艺系 ,天津 300384)
摘要　[目的] 探讨蛭石作培养基支撑物对木旬子试管苗生根培养及炼苗移栽的影响。[方法] 将木旬子微茎置于蛭石支撑的培养基进行
生根培养 ,将培养成的木旬子试管苗经开瓶炼苗 2周后带坨移入营养钵中 , 观察移栽后的成活率 , 并观察开瓶炼苗期间木旬子试管苗叶片
气孔在黑暗条件下的开闭状况。[结果] 木旬子微茎在蛭石支撑的培养基中可形成正常的试管苗 ,其生根率达到 88.3%,显著高于琼脂培
养基(66.7%)。对木旬子试管苗移栽前进行 2周的开瓶炼苗 ,可使其叶片气孔的关闭功能得到明显恢复。木旬子试管苗经炼苗带坨移栽
后 ,在不喷雾、不覆膜及午后空气相对湿度低至 60%的条件下成活率达到 86.7%,显著高于常规移栽(31.7%)。[ 结论] 该研究为完善
木旬子组织培养快繁技术提供依据。
关键词　木旬子;试管苗;蛭石;生根;移栽
中图分类号　S 603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)17-07860-02
Study on the Rooting Culture and Hardened-seedling Transplanting of Cotoneaster hjelmqvistii Plantlets on the Medium Supported by Vermi-
culite
CHAI Ci-jiang et al　(Department of Horticulture, Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384)
Abstract 　[Objective] The study aimed to discuss the effect of vermiculite used the supporting of medium on rooting culture, acclimatizing and trans-
planting of Cotoneaster hjelmqvistii test-tube plantlets.[ Method] Themicro stem of C.hjelmqvistii was put in the vermiculite supporting medium for root-
ing culture.After acclimatized on opened cultural bottles for two weeks the plantlets rooted on the vermiculite supporting medium were transplantedwith a
lump of vermiculite into the nutrition pots , and the survival rate of the plantlets was observed , and the stoma closing state of C.hjelmqvistii test-tube
plantlets was also observed during opening bottle and acclimatizing the plantlets.[ Result] The micro stem of C.hjelmqvistii cultured on the vermiculite
supporting medium could get into normal test-tube plantlets and the rooting ratewas 88.3%, which was obviously higher than the rooting rate(66.7%)
of the micro stem cultured in agar supporting medium.The stoma closing function of C.hjelmqvistii plantlets could be obviously recovered by opening the
bottle and acclimatizing the plantlets for twoweeks before transplanting.After C.hjelmqvistii test-tube plantlets were acclimatized and transplanted with
a lump of vermiculite, the survival rate of the plantlets was 86.7% under the condition of no-spraying, no-covering and low air humidity of 60%in after-
noon , being obvious higher than the survival rate(31.7%)of the plantlets transplanted with normal method.[ Conclusion] This study provided the basis
for improving the tissue culture propagation techniques of C.hjelmqvistii.
Key words　 Cotoneaster hjelmqvistii;Plantlets;Vermiculite;Rooting;Transplanting
基金项目　国家科技部星火计划项目(2008GA610015);天津市科委项
目(08ZHXHNC07000)。
作者简介　柴慈江(1960-),男 ,天津人 ,硕士 ,副教授 ,从事园艺植物
组织培养研究。
收稿日期　2009-03-18
　　木旬子(Cotoneaster hjelmqvistii)为第二作者史燕山近年从英
国爱丁堡皇家植物园引进的一种优良观赏地被植物 ,经在天
津地区试验观察 ,认为其耐盐碱 、抗寒 ,很有推广价值。采用
组织培养快繁技术是尽快培育大量优质苗木的有效途径。
该文探讨了蛭石作培养基支撑物对木旬子试管苗生根培养及
炼苗移栽的影响 ,为完善木旬子组织培养快繁技术提供依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料　以在附加 6-BA 0.75 mg/L的MS 培养基中
继代培养的木旬子试管苗为试材。
1.2　试验方法
1.2.1　木旬子微茎在蛭石支撑培养基中的生根培养。蛭石支
撑培养:以大量元素减半的MS 培养基为基本培养基 ,附加
0.75mg/L的 IBA 和 1.5%蔗糖 。以 300ml大口瓶为培养容
器 ,每瓶中分别加入 95 cm3 的蛭石 ,再加入培养基 55 ml 。用
双层聚丙烯膜封口 ,常规灭菌后每瓶接种 4根试管苗茎段。
琼脂支撑培养(对照):以 100 ml 三角瓶为容器 ,每瓶加
入培养基 30 ml ,培养基成分同蛭石支撑培养 ,并加入 0.7%
琼脂作支撑物 ,常规灭菌后每瓶接种 4根试管苗茎段。
上述 2个处理接种后放入培养室培养 ,培养温度为 23～
27 ℃,光照时间 14 h/d ,光强为 2 000～ 3 000 lx。培养 35 d后
调查试管苗的生根和生长情况。
1.2.2　蛭石支撑培养的木旬子试管苗带坨移栽试验。带坨移
栽:将蛭石支撑培养的木旬子试管苗 ,除去培养瓶的封口物 ,在
室内进行开瓶炼苗 ,经过 14 d的开瓶炼苗后 ,用 L形提苗片
将试管苗带坨移入营养钵中(图 1-A),营养钵内营养土采
用沙∶土∶蛭石为 1∶1∶2的配比。
常规移栽(对照):将琼脂支撑培养的试管苗 ,经过开瓶
炼苗 7 d后 ,洗去根上的琼脂再移入营养钵中 。营养土配比
同带坨移栽。
移栽试验于 4月上旬在温室内进行 ,移栽后不覆膜 、不
喷雾 ,只在营养钵土见干时浇水。记录环境温度和空气相对
湿度 。移栽 3周后调查成活率 。
1.2.3　木旬子试管苗在开瓶炼苗过程中的气孔开度变化观
察。在“1.2.2”中试管苗移栽前的开瓶炼苗期间 ,设开瓶炼苗
0、3、7、14 d 4个处理 ,其中琼脂支撑培养的试管苗开瓶炼苗
最多为 7d ,蛭石支撑培养的试管苗开瓶炼苗最多为 14d 。每
个处理在炼苗时间完成后 ,在傍晚时将培养瓶用黑纸做成的
纸袋罩住 ,第 2天早晨去除纸袋后立即取样观察。各处理每
次重复取 1株试管苗中部 1个正常叶片 ,重复 6次 。用透明
胶带粘取法[ 1] ,粘取叶片下表皮 ,并将带叶片下表皮的胶带
胶面向下粘在载玻片上 ,压平后观察叶片气孔。每叶片在下
表皮中部随机观察 50个气孔 ,统计气孔关闭率和气孔关闭
指数 ,并分析比较。
2　结果与分析
2.1　蛭石作培养基支撑物对木旬子试管苗生根培养的影响　
由表 1 可知 ,蛭石支撑培养的木旬子试管苗生根率达到
88.3%,显著高于琼脂支撑培养试管苗的生根率(66.7%);单
株根长虽显著低于琼脂支撑培养对照 ,但根数与对照无显著
差异 。2个处理培养的试管苗的茎长和叶数也无显著差异 。
结果表明 ,用蛭石取代琼脂作培养基支撑物可显著促进木旬子
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009, 37(17):7860-7861, 7871　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　熊章琴　责任校对　傅真治
试管苗发根 ,提高试管苗的生根率 ,并且试管苗地上部的生
长质量与对照无明显差异 。这不仅可以降低试管苗生根培
养的成本 ,同时为试管苗的带坨移栽奠定了基础。图 1-B
为蛭石支撑培养基中培养的木旬子试管苗生根状况。
表 1　蛭石支撑培养对木旬子试管苗生长的影响
Table 1　Effects of vermiculite supporting mediumon the growth of Cotoneaster hjelmqvistii plantlets in vitro
培养基支撑物
Material sup-
porting medium
接种茎段数
Number of cultured
stem-sections
生根茎段数
Number of rooting
stem-section
生根率∥%
Rooting
rate
根长∥mm
Root
length
根数
Number
of roots
茎长∥mm
Stem
length
叶数
Number of
leaves
蛭石 Vermiculite 60 53 88.3 a 10.5 b 1.9 a 19.8 a 4.2 a
琼脂 Agar 60 40 66.7 b 22.7 a 2.3 a 21.7 a 5.4 a
　注:同列后不同字母表示在 0.05水平存在差异。下同。
　Note:Different letters behind the data in the same columnmean significant difference at 0.05 level.The same as below.
2.2　蛭石支撑培养的木旬子试管苗带坨移栽效果　由表 2可
知 ,在移栽后没有覆膜 、喷雾等保湿措施 ,午后的空气相对湿
度曾低至 60%的条件下 ,带坨移栽的木旬子试管苗成活率达
86.7%,显著高于常规移栽的试管苗。分析其原因可能是带
坨移栽的试管苗根际环境变化小 ,移栽后其根系能保持较强
的吸收功能 。此外 ,其试管苗在移栽前开瓶炼苗可长达 2周 ,
地上部得到较充分锻炼 ,这对移栽成活也非常有利 。
表 2　带坨移栽对木旬子试管苗成活率的影响
Table 2　Effects of transplanting with lump on the survival rate of Co-
toneaster hjelmqvistii plantlets in vitro
移栽方式
Transplanting
methods
移栽试管苗数
Number of transpl-
anted plantlets
成活试管苗数
Number of
survival plantlets
成活率∥%
Survival
rate
带坨移栽 60 52 86.7 a
Transplanting with lump
常规移栽 60 19 31.7 b
Transplanting by normal
method
2.3　开瓶炼苗对木旬子试管苗气孔关闭功能的影响　由表 3
可知 ,琼脂支撑培养的木旬子试管苗经过 3 d和7 d的开瓶炼苗
后 ,在黑暗中的气孔关闭率和气孔关闭指数均与未开瓶炼苗
处理(开瓶 0 d)无显著差异 。蛭石支撑培养的木旬子试管苗在
黑暗中的气孔关闭率和气孔关闭指数虽然在开瓶炼苗 3 d与
开瓶炼苗 0 d之间无显著差异 ,但在开瓶 7 d后显著增加。开
瓶炼苗 14 d后虽然又有所增加 ,但不明显(图 1-C、D)。
表3　不同开瓶炼苗时间处理后的木旬子试管苗气孔的关闭状况(黑暗中)
Table 3 　The closed situation of the stoma in Cotoneaster hjelmqvistii
plantlets after being acclimatized in open bottles for different day
(under dark conditions)
开瓶炼苗时间∥d
Days of
plantlets
acclimatized
in open
bottles
琼脂支撑培养
Cultured in agar
supporting medium
气孔关闭率∥%
Closed rate
of stoma
气孔关闭指数∥%
Closed index
of stoma
蛭石支撑培养
Cultured in vermiculite
supporting medium
气孔关闭率∥%
Closed rate
of stoma
气孔关闭指数∥%
Closed index
of stoma
0 30.0 a 41.5 a 25.3 b 46.7 b
3 30.0 a 43.0 a 25.6 b 50.7 b
7 42.5 a 43.3 a 63.0 a 79.3 a
14 - - 78.3 a 86.0 a
　注:气孔关闭指数(%)=[(全开放气孔数×0+半开放气孔数×1+全
关闭气孔数×2)/调查气孔总数×2] ×100。
　Note:Closed index of stoma(%)=[ Number of completely open stoma×0+
Number of half-open stoma×1 +Number of completely closed stoma×
2)/total number of observed stoma×2] ×100.
注:A 为移栽时的木旬子带坨试管苗;B为蛭石支撑培养的木旬子试管苗生根状况;C为开瓶炼苗 0 d时木旬子试管苗开放的气孔;D为开瓶炼苗 14
d时木旬子试管苗关闭的气孔。
Note:A ,Transplanted Cotoneaster hjelmqvistii plantlets with lump;B, The rooting situations of Cotoneaster hjelmqvistii plantlets cultured in vermiculite supporting
medium;C , The open stoma of Cotoneaster hjelmqvistii plantlets acclimatized inopen bottle for 0 day;D , The closed stoma of Cotoneaster hjelmqvistii plantlets
acclimatized in open bottle for 14 days.
图 1　木旬子试管苗移栽、生根及气孔开闭状况
Fig.1　The situations of rooting, transplanting and stoma close of Cotoneaster hjelmqvistii plantlets
　　植物气孔在黑暗条件下一般处于关闭状态[ 2] 。未经开
瓶锻炼的木旬子试管苗的气孔在黑暗中关闭率较低 ,表明其关
闭功能较弱 。经开瓶锻炼的木旬子试管苗在黑暗中气孔关闭
率和关闭指数的增加标志着气孔关闭功能的恢复。因此 ,开
瓶炼苗可以明显促进蛭石支撑培养的木旬子试管苗叶片气孔
关闭功能的恢复 ,但对琼脂支撑培养的试管苗气孔关闭功能
的恢复无明显影响 。分析其原因 ,可能与培养容器有关。据
(下转第 7871页)
786137卷 17期　　　　　　　　　　　　　　柴慈江等　木旬子试管苗蛭石支撑生根培养及炼苗移栽研究
2.2　酶的基本性质
2.2.1　最适温度。以邻苯二酚为底物 ,在 0 ～ 30 ℃酶活性随
着温度的升高而增加 ,高于 30 ℃时 ,酶活性随着温度的升高
而降低。结果表明 ,温度为 30 ℃时 ,酶活力达到最高值 ,其
最适温度为 30 ℃。
2.2.2　最适 pH值 。在 pH值为 0～ 7.0 ,酶活性随着 pH值的
升高而升高;在 pH值 7.0之后 ,随着 pH 值的升高酶活性降
低。结果表明 ,pH值为 7.0时 ,酶活力达到最高值 ,最适 pH
值为 7.0。
2.2.3　酶催化邻苯二酚的动力学参数。在 30 ℃, pH 值为
7.0的磷酸测活体系中 ,改变底物邻苯二酚的浓度 ,测定酶的
反应初速度 ,以酶的反应初速度对底物浓度作图 ,呈典型双
曲线关系 ,说明酶催化底物水解反应遵循Michaelis-Menten方
程式。采用 Lineweaver-Burk双倒数作图法 ,求得酶催化邻苯
二酚的Km 和 Vm 分别为 2.73mmol/L和 0.91μmol/(L·min)。
2.3　金属离子对酶活性的影响 　研究 Mn2+、Zn2+ 、Ag+和
Cu2+对酚氧化酶的影响 ,结果表明 ,当浓度低于 0.05 mmol/L
时 ,4种离子对多酚氧化酶都有微弱的激活作用 ,并且随着金
属离子浓度的增加激活作用亦有所增加 ,但是浓度达到0.05
mmol/L后开始表现出抑制作用 ,随着金属离子浓度的增加
抑制作用亦增加。
3　结论与讨论
(1)在昆虫中多酚氧化酶主要以酶原的形式存在 。多酚
氧化酶原可有两种活化方法 ,一是蛋白酶水解 ,昆虫表皮蛋
白酶对多酚氧化酶原是非特异性的 ,从一种昆虫分离的表皮
蛋白酶能很快降解同种或异种多酚氧化酶原;另一方法是用
去污剂活化 ,如阳离子去污剂CPC(cetylpyridinium chloride)可
以活化昆虫多酚氧化酶原[ 3] 。鉴于此 ,笔者在提取缓冲液中
加入了去污剂 Brij35和胰蛋白酶以便于更好地将其提取出
来。家蚕表皮多酚氧化酶的最适温度为 30 ℃左右 ,这与家
蚕的生长发育的适温和自然环境的温度比较一致 。结果与
Kohjiyamamoto等[ 4]的结果一致。其最适 pH 值为 6.0 ～ 7.0 ,
这一结果与家蚕体内血液的弱酸性非常接近 ,也与其自身的
pH值缓冲性能相类似[ 5] 。不同浓度的金属离子对其活性影
响结果显示 ,低浓度的Mn2+和Zn2+激活明显 ,而Ag+和Cu2+
则对其有明显抑制作用。有必要对 4种金属离子激活和抑
制的机理进行深入研究。
(2)自 20世纪 30年代 ,Bodine和Allen在异黑蝗(Melano-
plus differentialis)的卵中发现酚氧化酶后[ 6] ,对多酚氧化酶的
酶学和分子生物学都进行了广泛深入的研究[ 7] 。近年来 ,人
们对漆酶的酶学 、分子生物学方面也进行了研究[ 8] ,但远不
如多酚氧化酶的研究深入。自 1972年 ,Yamazaki[ 9]在家蚕蛹
表皮中检测到有活性的漆酶后 ,之后有关家蚕表皮漆酶的报
道非常少。为了丰富对昆虫漆酶的了解 ,有必要对家蚕表皮
漆酶进行进一步的研究。
参考文献
[ 1] RESCIGNO A ,SANJUST E ,MONTANARI L ,et al.Detectionof laccase ,peroxi-
dase , and polyphenoloxidase on a single polyacrylamide gel electrophoresis[ J] .
Analytical Letters , 1997, 30(12):2211-2220.
[ 2] BRADFOLDM M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[ J] .Anal
Biochem, 1976, 72:248-254.
[ 3] HALLM , SCOTT T ,SUGUMARANM ,et al.Proenzyme of Manduca sexta phe-
noloxidase:purification , activation ,substrate specificity of the active enzyme ,and
molecular cloning[ J] .Proc Natl Acad Sci(USA), 1995, 92∶7764-7768.[ 4] KOHJI YAMAMOTO , MIKIMASA SUGIOKA , HIROSHI FUJII.Isolation and
characterization of prophenoloxidase isoforms from the si lkworm, Bombyx mori(a80 strain)[ J] .J Seric Sci Jpn, 1999, 68(1):65-72.
[ 5] 时超美.昆虫酚氧化酶原活化及其在免疫中的作用[ J] .昆虫知识 ,
2000, 37(5):310-314.
[ 6] 樊廷俊,汪小锋.中国对虾(Penaeus chinensis)酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质[ J] .生物化学与生物物理学报 ,2002,34(5):589-594.
[ 7] BRUNET P C J.The metabolism of the aromatic a mino acids concerned in the
cross-linking of insect cuticle[ J] .Insect Biochem, 1980 ,10∶467-500.
[ 8] SADHASIVAM S ,SAVITHA S ,SWAMINATHAN K.Production ,purification and
characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoder-
ma harzianum WL1[ J] .Process Biochemistry , 2008 ,43(7):736-742.
[ 9] YAMAZAKI H I.Cuticular phenoloxidase from the silkworm, Bombyx mori:Proper-
ties, solubilization ,and purification[ J] .Insect Biochemistry ,1972 ,2:431-444.
(上接第 7861页)
夏阳等研究 ,在干旱条件下葡萄细胞弹性增大[ 3] 。蛭石支
撑培养的培养容器为大口瓶 ,开瓶后瓶内空气湿度迅速降
低 ,较低的空气湿度可能促进了木旬子试管苗叶片气孔保卫
细胞弹性的恢复 ,进而使其恢复关闭功能 。而琼脂支撑培
养采用三角瓶为培养容器 ,瓶口小 ,开瓶后瓶内仍有较高的
空气湿度 ,这可能是影响其气孔关闭功能恢复的主要因素 。
对此尚待作进一步研究 。
由于开瓶炼苗促进了蛭石支撑培养的木旬子试管苗叶片
气孔关闭功能的恢复 ,对增强试管苗移栽后的保水能力及
提高移栽成活率具有重要意义。
3　小结
以无机基质取代琼脂进行试管苗的生根培养 ,并对生
根试管苗进行带坨移栽 ,可以简化试管苗移栽后的管理 ,提
高移栽成活率并降低成本 ,这一点已在葡萄和枣试管苗的
移栽试验中得到证实[ 4-6] 。该项研究结果表明 ,木旬子微茎
在蛭石支撑的培养基中可形成正常的试管苗 ,其生根率达
到88.3%,显著高于琼脂支撑培养基中微茎的生根率;对蛭
石支撑培养的木旬子试管苗移栽前进行 2周的开瓶炼苗 ,可
使其叶片气孔的关闭功能得到明显恢复 ,进而增强其地上
部的保水能力;将开瓶炼苗后的木旬子试管苗带坨移入营养
钵 ,在移栽后不喷雾 、不覆膜 ,午后空气相对湿度低至 60%
的条件下 ,移栽成活率达到 86.7%。研究结果为木旬子组培
快繁技术在生产中的应用提供了技术支撑 。
参考文献
[ 1] 陈佰鸿 ,李新生,曹孜义 ,等.一种用透明胶带粘取叶片表皮观察气孔
的方法[ J] .植物生理学通讯 ,2004, 40(2):215-218.
[ 2] 吕忠恕.果树生理[M] .上海:上海科学技术出版社 ,1982:206-208.
[ 3] 夏阳,罗新书.几种果树水分生理指标的比较研究[ J] .落叶果树, 1993
(1):1-8.
[ 4] 柴慈江 ,严仁玲, 王震星, 等.葡萄试管苗土支撑培养带坨移栽研究[ J] .华北农学报 ,1995, 10(1):116-119.
[ 5] 柴慈江 ,宁保生 ,陈桂林.枣试管苗带土坨移栽成活率高[ J] .中国果
树 ,1998(4):56.
[ 6] 柴慈江 ,魏志勇.晚红葡萄试管苗快速繁殖技术研究[ J] .北方园艺 ,
2005(1):61-62.
787137卷 17期　　　　　　　　　　　　　马晓春等　家蚕表皮多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究