全 文 ：大丁草愈伤组织及试管苗培养的研究
凌 杰1，宁淑香2 (1．铁岭卫生职业学院，辽宁铁岭 112001;2．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116081)
摘要 ［目的］研究大丁草愈伤组织及试管苗的培养条件。［方法］以大丁草花柄为外植体，采用组织培养方法，进行愈伤组织诱导和分
化培养、不定芽的继代分化增殖培养以及试管苗生根培养、移栽和定植的研究。［结果］花柄愈伤组织诱导培养的理想培养基为 MS +
0． 5 mg /L 6-BA +2． 5 mg /L 2，4-D;愈伤组织分化培养和不定芽继代分化增殖培养的的理想培养基为 MS + 0． 8 mg /L AgNO3 + 0． 1 mg /L
NAA +1． 2 mg /L6-B;将继代分化增殖培养不定芽用浓度为 1． 2 mg /L IAA溶液处理 24 h，再接种到 1 /2MS + 0． 1 mg /L NAA的培养基上
进行生根培养的方法，是不定芽生根培养的理想方法;试管苗移栽成活率为 92． 8%，定植成活率为 97． 7%。［结论］定植成活的试管苗
保持了野生大丁草的所有植物学特征，且生长旺盛，可用于进行培养繁殖。
关键词 大丁草(Leibnitzia anandria);组织培养;愈伤组织;试管苗
中图分类号 Q949． 783． 5 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)05 －02671 －03
Study on Callus and Tube Seedlings Culture of Leibnitzia anandria
LING Jie et al (Tieling Health Vocational College，Tieling，Liaoning 112001)
Abstract ［Objective］To study the culture conditions of Leibnitzia anandria callus and tube seedlings． ［Method］With the flower stalks of
Leibnitzia anandria as explants，the method of tissue culture was adopted to investigate callus induction and differentiation，differentiation and
multiplication of adventitious buds，rooting and transplantation of tube seedlings． ［Result］MS + 0． 5 mg /L 6-BA + 2． 5 mg /L 2，4-D was the
best medium for induction of callus． The optimum medium for the differentiation of callus as well as the differentiation and multiplication of ad-
ventitious buds was MS + AgNO3 0． 8 mg /L + NAA 0． 1 mg /L + 6-BA 1． 2 mg /L;the best rooting culture method of tube seedlings was inocu-
lating the adventitious buds into 1 /2MS + NAA 0． 1 mg /L after being treated with 1． 2 mg /L IAA for 24 h;the transplanting survival rate was
92． 8% and stable planting survival rate was 97． 7% ． ［Conclusion］The tube seedlings survived retained all biological characteristics of the
wild Leibnitzia anandria with exuberant growth，and could be used for culture．
Key words Leibnitzia anandria;Tissue culture;Callus;Tube seedlings
作者简介 凌杰(1966 － ) ，女，辽宁铁岭人，副教授，从事细胞生物学研
究，E-mail:nsx － 567 @ 163． com。
收稿日期 2011-11-06
大丁草(Leibnitzia anandria L．)属于菊科(Compositae)大
丁草属(Leibnitzia)多年生草本植物［1 －2］，生长于上坡林下、林
缘和草地，在我国的云南、西藏、辽宁等地有分布。全草含香
豆素等成分，全株可入药，具有清热解毒、利湿消肿、止咳、止
血等功效，能治肺热咳嗽、湿热泻痢、热淋、风湿关节疼、痈疖
肿毒、蛇虫咬伤、尿路感染等疾病［3 －4］。近些年来，辽宁北部
地区的养鸡农民发现，在鸡饲料中添加适量的大丁草干粉，
能够提高鸡的免疫力，增加养鸡效益。人们就大量的采集大
丁草作为饲料添加物，这使原本分布和数量就较少的大丁草
的野生种数量迅速减少，至目前已接近濒危状态。为保护大
丁草的野生资源，解决种苗问题，实现人工栽培，研究者对大
丁草进行了愈伤组织及试管苗培养的研究。虽然目前关于
菊科植物组织培养的研究报道已有很多［5 －9］，但关于大丁草
愈伤组织诱导及试管苗培养的研究鲜有报道。因此，试验对
大丁草愈伤组织及试管苗的培养条件进行了研究，以期为大
丁草的试管苗繁殖提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。大丁草花柄，于 5 月上旬采自铁岭县的
草地，长为 2 cm左右，经鉴定为 Leibnitzia anandria L．的新鲜
花柄。
1． 1． 2 主要仪器。VS-1300U超净工作台，由上海精宏实验
设备有限公司生产;DHP-9082恒温培养箱，由上海精宏实验
设备有限公司生产;GZP型光照培养箱，由上海精宏实验设
备有限公司生产;DK-S26型电热恒温水浴锅，由上海精宏实
验设备有限公司生产。
1． 1． 3 主要试剂。蔗糖，由天津大茂化学试剂厂生产;琼
脂，由北京奥博星生物技术有限责任公司生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品的灭菌。将采回的大丁草花柄，放到 200 ml 磨
口锥形瓶中，再倒入 100 ～150 ml的蒸馏水，振摇洗涤 5 min，
连续振摇洗涤 3次后移到超净工作台上，在无菌的条件下用
无菌水振摇洗涤 5 min后，用浓度 75%的乙醇灭菌约 15 s，再
用饱和的次氯酸钠溶液灭菌 10 min，最后用无菌水洗涤 6
次，即获得无菌花柄。
1． 2． 2 培养条件。以 MS和 1 /2 MS为基本培养基，附加不
同浓度的细胞分裂素和生长素;培养基加蔗糖 20 g /L、琼脂 5
g /L，pH值为 5． 8 ～ 6． 0，培养温度 25 ℃，光照强度 2 500 ～
3 000 lx，光照时间 12 h /d。
1． 2． 3 愈伤组织的诱导培养。在超净工作台上，将无菌花
柄剪成长约为 0． 3 cm的花柄段后，接种到以 MS + 0． 5 mg /L
6-BA为基本培养基，附加浓度分别为 1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0
和 3． 5 mg /L的 NAA和 2，4-D的培养基上，进行花柄段的愈
伤组织诱导培养。在无光照条件下培养 20 d后，再转移到光
照条件下培养。培养到 55 d时统计愈伤组织的诱导数，计算
愈伤组织的诱导率，观察愈伤组织的生长状况。愈伤组织的
诱导试验每种处理接种 100段外植体，重复 2次。
1． 2． 4 愈伤组织的分化培养。将以上培养的浅绿色颗粒状
愈伤组织，分散成由 4 ～8个颗粒组成的愈伤组织块，接种到
以MS + 0． 8 mg /L AgNO3 +0． 1 mg /L NAA的基本培养基，附
加不同浓度激素6-BA的 KT的分化培养基上，再进行愈伤组
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(5):2671 － 2673 责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.05.209
织的分化培养。愈伤组织分化培养试验重复 3次。
1． 2． 5 不定芽继代分化增殖培养。将由愈伤组织分化培养
的不定芽丛在无菌培养皿中切成独立的不定芽后，接种到与
以上愈伤组织分化培养相同的培养基上，进行不定芽的分化
继代培养。不定芽分化继代培养试验重复 3次，每次重复试
验继代培养 5 代。每次接种的不定芽数量为 200 个。接种
培养 40 d观察统计。
1． 2． 6 不定芽的生根培养。将继代分化增殖培养的不定芽
进行以下处理: (1)向每个培养瓶中加入 5 ml 浓度为 1． 2
mg /L IAA无菌溶液，处理 24 h后从培养瓶中取出，切成独立
的不定芽，再接种到1 /2 MS + 0． 1 mg /L NAA 的培养基上进
行生根培养;(2)将继代分化增殖培养的不定芽从培养瓶中
取出并分割成独立的不定芽后，把下部切口在浓度为 20
mg /L IAA处理 5 min后，再接种到 1 /2 MS + 0． 1 mg /L NAA
的培养基上进行生根培养;(3)将继代分化增殖培养的不定
芽从培养瓶中取出并分割成独立的不定芽后，直接接种到
1 /2MS +0． 1 mg /L NAA +0． 5 mg /LIAA的培养基上进行生根
培养。不定芽的生根培养试验每种处理接种 200 个不定芽，
重复3次。
1． 2． 7 试管苗的移栽与定植。将采用(1)处理生根培养试
管苗的培养瓶的瓶塞打开，放到温室光照下炼苗2 d后，用镊
子将试管苗取出，洗净根部的培养基，移栽到上面铺着一层
厚度约为 7 cm河沙的温室苗床上。移栽试验重复 3 次，移
栽株数分别为 400、500和 600株。把移栽成活的试管苗于 5
月上旬一次性定植到铁岭郊区的林缘旁。
2 结果与分析
2． 1 生长素对愈伤组织诱导的影响 培养 55 d时观察统计
结果，由表 1可知，在附加不同浓度 NAA和 2，4-D的培养基
上，均可诱导培养出愈伤组织。但在不同浓度 NAA 培养基
上的诱导率低于附加不同浓度 2，4-D 的培养基。在附加浓
度为 2． 5 mg /L 2，4-D的培养基上，愈伤组织的诱导率最高，
不仅诱导率达到了 95%、长势好，而且诱导培养的愈伤组织
外观为浅绿色的颗粒状。一般认为，这样的愈伤组织为具有
分化力的愈伤组织［10 －11］。观察还表明，在附加浓度为 2． 5
mg /L 2，4-D的培养基上，培养 10 d左右时，培养的花柄段切
口处长出愈伤组织。在暗培养的条件下，生长的愈伤组织为
淡黄色的;转到光照下后 10 d左右变成了浅绿色。2次重复
试验的结果基本一致。以上结果这表明，MS + 6-BA 0． 5
mg /L +2，4-D 2． 5 mg /L这种培养基是大丁草花柄段愈伤组
织诱导培养的理想培养基。
2． 2 细胞分裂素对愈伤组织分化培养的影响 由表 2 可
知，在附加不同浓度 KT的培养基上，愈伤组织不分化或分化
率很低;在附加不同浓度 6-BA的培养基上，愈伤组织分化的
效果较好;其中在附加为浓度为1． 2 mg /L 6-BA的培养基上，
不仅分化率达到了 97%、分化不定芽长势好，而且每个愈伤
组织块平均能分化出 4． 6个不定芽。结果还表明，将愈伤组
织块接种到附加为浓度为 1． 2 mg /L 6-BA 的培养基上培养
到 9 d时可见开始分化。而后，伴随着先分化不定芽的叶片
的生长，在其周围又会相继分化出多个不定芽。培养到 50 d
时，每块培养的愈伤组织就会分化生长为由多个生长旺盛不
定芽组成的不定芽丛。3次重复试验的结果基本一致。以上
结果证明，MS + 0． 8 mg /L AgNO3 + 0． 1 mg /L NAA + 1． 2
mg /L 6-BA是大丁草愈伤组织分化培养的理想培养基。
表 1 生长素对愈伤组织诱导的影响
NAA
mg /L
2，4-D
mg /L
诱导率
%
愈伤组织
外部特征
长势
0 0 0 －
1． 0 0 31 浅灰色、疏松、规则块状 +
1． 5 0 52 浅灰色、疏松、规则块状 +
2． 0 0 43 浅灰色、疏松、规则块状 +
2． 5 0 68 浅灰色、较疏松、规则块状 +
3． 0 0 76 浅灰色、较疏松、不规则块状 +
3． 5 0 80 浅灰色、疏松、不规则块状 +
0 1． 0 22 黄绿色、紧密、块状 +
0 1． 5 31 黄绿色、紧密、较均匀颗粒状 +
0 2． 0 77 浅绿色、紧密、较均匀颗粒状 + +
0 2． 5 95 浅绿色、紧密、较均匀颗粒状 + +
0 3． 0 81 黄褐色、紧密、块状 +
0 3． 5 46 黄褐色、紧密、块状 +
注:+ +为长势好;E +为长势一般，－为不生长。
表 2 细胞分裂素对愈伤组织分化的影响
6-BA
mg /L
KT
mg /L
接种愈伤
组织块数
分化率
%
分化不定
芽长势
平均分化不
定芽数∥块
0 0 100 0 0
0． 4 0 100 31 + 1． 8
0． 8 0 100 61 + + 2． 9
1． 2 0 100 97 + + 4． 6
1． 6 0 100 68 + 1． 6
2． 0 0 100 76 + 1． 6
0 0． 4 100 0 － 0
0 0． 8 100 7 － 1． 1
0 1． 2 100 8 － 1． 2
0 1． 6 100 0 － 0
0 2． 0 100 0 － 0
注:+ +为长势好;E + +为长势一般，－为不分化。
2． 3 不定芽继代分化增殖培养 观察表明，接种后 7 d 左
右，在接种的不定芽基部开始分出不定芽，随后，伴随着先分
化不定芽的生长，又会在不定芽的基部周围相继分化多个不
定芽。3次重复试验的统计证明，经过 40 d的培养，继代培
养不定芽的分化率为 99． 2%，平均每个培养不定芽能分化出
5． 2个不定芽，分化的不定芽平均高度比由愈伤组织分化的
不定芽高 0． 6 cm，叶片数增加 1． 5片，并且外观上叶色深绿，
叶柄增粗，叶片伸展，较由愈伤组织分化的不定芽明显旺盛。
按照 40 d每个继代培养不定芽分化 5． 2 个不定芽的速度计
算，每个继代增殖培养的不定芽 1年能繁殖出 5． 29 个不定芽
(约为 270万个) ，除掉各种不利因素的影响，完全可保证 1
年 1个不定芽繁殖 100万个不定芽，这种繁殖速度完全能满
足人们栽培对大丁草种苗的需求。不定芽分化继代培养实
验重复 3次，每次重复试验继代培养 5 代的结果基本一致。
上述结果也证明，MS + 0． 8 mg /L AgNO3 + 0． 1 mg /LNAA +
2762 安徽农业科学 2012 年
1． 2 mg /L 6-BA是大丁草不定芽继代分化增殖培养的理想培
养基。
2． 4 处理方法对不定芽生根培养的影响 将经过 3种方法
处理的不定芽接种培养 28d后观察统计，结果见表 3。采用
方法一对不定芽进行处理，生根效果最好。不仅生根率为
95． 5%、平均试管苗生根数为 5． 3 条，而且试管苗长势好。
观察还表明，采用这种方法对不定芽进行处理，接种培养 4 d
有的不定芽可见开始生根，随后伴随着生根率和生根数的增
加，试管苗也迅速生长，不仅叶片长大，而且叶片数量增加、
叶色加深、叶柄变粗，生长为旺盛的试管苗。3次重复试验的
结果基本一致。以上结果证明，向继代分化增殖培养不定芽
的培养瓶中加入 5 ml 浓度为 1． 2 mg /L IAA 溶液处理 24 h
后，再接种到 1 /2MS + 0． 1 mg /L NAA 的培养基上进行生根
培养的方法，是大丁草不定芽生根培养的理想方法。
表 3 不同处理方法对不定芽生根培养的影响
处理 接种数量 生根率∥% 平均生根数∥株 试管苗长势
1 200 95． 5 5． 3 + + +
2 200 92． 0 3． 4 + +
3 200 16． 5 1． 4 +
2． 5 试管苗的移栽与定植 移栽后 30 d统计，3 次重复试
验共移栽 1 500株，成活 1 392株，平均移栽成活率为92． 8%。
定植后 30 d统计，定植的 1 200 株试管苗，成活了 1 172 株，
定植成活率为 97． 7%。观察还表明，定植的试管苗初期生长
较慢，40 d后生长速度加快，外观上生长旺盛整齐，且根系发
达，地下根系是地上部的 2 倍左右，并保持了野生大丁草的
所有对植物学性状。
3 结论与讨论
研究以大丁草的花柄为材料，通过愈伤组织的诱导培
养，愈伤组织的分化培养，成功地培养出大丁草的试管苗，并
建立起快速繁殖技术。这不仅证明大丁草的花柄细胞组织
也具有全能性，而且也是迄今为止首次关于花柄愈伤组织培
养，并诱导分化试管苗培养的报道。
在不定芽的培养中，由不定芽继代分化增殖培养的不
定芽，其长势明显好于由愈伤组织分化培养的不定芽。产
生这种现象主要原因有:不定芽具有多个叶片，在进行分化
继代培养过程中，叶片能进行光合作用，从而能为继代分化
增殖培养的不定芽提供一些营养和生长调节剂，有助于促
进不定芽的生长;不定芽本所携带的营养较愈伤组织多，也
能促进分化不定芽的生长;不定芽是一种完整的器官，其自
身不仅具有较强的适应性，而且对培养环境也会形成更强的
适应性。
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