全 文 ：菘蓝叶肉原生质体游离与纯化研究
张胜珍 ,客绍英 ,马作东 ,马艳芝
(唐山师范学院生命科学系 ,河北 唐山 063000)
　　摘要　目的:探讨菘蓝原生质体分离的最佳条件。方法:用纤维素酶和离析酶的混合酶液提取菘蓝无菌苗幼
叶原生质体 , 对影响原生质体提取得率及活力的因素进行分析。结果:适宜菘蓝叶片原生质体游离的条件为:CPW
+0.5%PVP+3 mmol/LMES+1.0% CellulaseR-10+0.1% MacerozymeR-10+0.4 mol/L甘露醇 , pH5.6, 25 ℃黑
暗条件下酶解 6 h。在此条件下原生质体产量达 1.5×10个 /gFW, 活力达 79.14%,用 “过滤-离心-漂浮法”进行纯
化 , 蔗糖浓度 21%时纯化效果最好。结论:用混合酶系统处理 ,能够获得大量有活性的菘蓝原生质体 , 为建立高效
的菘蓝原生质体再生体系及其遗传操作奠定了基础。
关键词　菘蓝;原生质体;分离;纯化
中图分类号:R282.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)05-0664-03
收稿日期:2008-10-07基金项目:湖北省科技攻关项目(05276416);唐山市科技攻关项目(03132001A)作者简介:张胜珍(1979-),女,硕士 ,讲师 ,主要从事药用植物学与生物技术研究;Tel:0315-3863212, E-mail:zszhen6@yahoo.com.cn。
　　植物原生质体是指除去细胞壁后的裸细胞 ,其
不仅可作为研究细胞壁再生 、膜的通透性及细胞分
裂与分化等基础理论的理想材料 ,而且也是细胞杂
交 、遗传转化的良好受体 〔1〕。而原生质体的分离与
纯化获得大量有活力的原生质体是这些研究得以顺
利开展的前提。
菘蓝 IsatisindigoticaFort.为十字花科菘蓝属植
物 ,干燥根入药称板蓝根 ,干燥叶入药称大青叶 ,具
有清热 、解毒 、凉血 、止血之功效 ,是我国传统常用中
药之一 〔2〕。有关菘蓝的组织培养前人已经做了一
些阶段性研究〔3, 4〕 ,但有关原生质体方面的报道很
少 。本试验以菘蓝组培苗叶片为试材 ,对影响原生
质体产量和活力的因素进行研究 ,以建立最佳的原
生质体制备体系 ,为进一步利用体细胞杂交 、遗传转
化等手段培育新品种奠定良好的基础 。
1 　材料与方法
1.1 　材料　生长 10 ～ 15 d的菘蓝无菌苗叶片 。
1.2 　原生质体的游离　取生长 10 ～ 15 d的菘蓝
无菌苗叶片 1 g,切成 1 mm×1 mm的块状 ,然后放
入 10mL酶解液中 ,置于 25℃恒温培养箱内酶解 。
酶解液成分为:CPW盐溶液 (KH2PO4 27 mg/L、
KNO3 101 mg/L、MgSO4· 7H2O246 mg/L、CaCl2·
H2O1480 mg/L)附加一定量纤维素酶(CelulaseR-
10)和离析酶 (MacerozymeR-10), 0.5%PVP, 3
mmol/LMES, 0.3 ～ 0.5 mol/L甘露醇 , pH5.6。酶
液经 0.22 μm混合纤维素微孔滤膜过滤去除杂质 ,
pH值调至 5.6。酶解过程在 26.5 ℃恒温培养箱黑
暗中进行。
1.3 　原生质体的纯化　采用 “过滤-离心 -漂浮法 ”
进行纯化 〔5〕。酶解结束后 ,首先将原生质体连同酶
液用 200目的不锈钢细胞筛网过滤 ,以除去未酶解
完全的组织。将滤液分装在离心管中 ,以 1 100 r/
min进行第一次离心 ,时间 3 min,离心后去掉上清
液 ,向所得沉淀中缓缓加入 0.5 mL的细胞悬浮液 ,
缓慢摇匀使底部沉淀悬浮。向离心管底部缓缓注入
18% ～ 27%的蔗糖溶液 2mL,以 1 000r/min进行第
二次离心 ,时间 5 min。离心结束后用移液枪小心地
将漂浮于溶液界面间的原生质体带吸出 。
1.4　原生质体产量与活力测定　原生质体计数用
血球计数板 , 显微镜下观察 ,统计原生质体的产
量〔6〕 ,重复 5次 ,取平均值。原生质体活力测定采用
0.1%的中性红染色法〔7〕。原生质体活力以一个视
野中有活力的原生质体占该视野中原生质体总数的
百分数表示。每种处理随机检查 20个视野 ,取平均
值。
2　结果与分析
2.1　酶液浓度对原生质体提取的影响　采取含不
同浓度组合的酶解液 (含 0.45 mol/L甘露醇 ,
pH5.6)对菘蓝无菌苗叶片进行处理 , 25 ℃黑暗酶
解 5 h,原生质体分离情况见表 1。
　　由表 1可以看出 ,不同浓度的酶液组合对叶片
原生质体产量及活力的影响明显不同。同一离析酶
浓度下 ,随着纤维素酶浓度的升高 ,原生质体的产量
明显增加 ,但当纤维素酶含量超过 1.0%时原生质
体的产量反而下降;同一纤维素酶浓度下 ,随着离析
酶浓度的升高 ,原生质体的产量反而减少 ,可能是因
为高浓度的离析酶对原生质体的毒害和损伤作用较
为严重 ,从而导致完整的原生质体减少 。由此可见 ,
·664· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 5期 2009年 5月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.05.027
纤维素酶在菘蓝原生质体的分离过程中起主要作
用 。此外随着两种酶浓度的增加 ,细胞碎片逐渐增
多 。从原生质体的产量 、活力及细胞碎片等多方面
综合考虑 , 菘蓝原生质体分离的最佳酶浓度为:
1.0%CelulaseR-10和 0.1% MacerozymeR-10。
　表 1 　酶液浓度对原生质体产量和活力的影响
处理 CelulaseR-10/% MacerozymeR-10/% 产量/(×105个 /gFW)活力/% 细胞碎片
1 0.7 0.1 0.8 51.56 +
2 0.7 0.2 0.9 54.33 +
3 0.7 0.3 0.6 48.73 ++
4 1.0 0.1 1.1 57.71 +
5 1.0 0.2 1.0 53.28 ++
6 1.0 0.3 0.9 50.05 +++
7 1.3 0.1 0.7 43.12 ++
8 1.3 0.2 0.5 36.25 +++
9 1.3 0.3 0.4 30.31 ++++
　　注:“ +”越多表示碎片越多
2.2 　渗透压对原生质体提取的影响　采用筛选出
的最佳混合酶液 ,使用 0.3 ～ 0.5 mol/L5个梯度的
甘露醇来调节渗透压 ,并于 26.5℃黑暗条件下对菘
蓝叶片酶解 5 h。当甘露醇浓度为 0.4mol/L时 ,原
生质体产量和活力均达到最高峰值 ,分别为 1.5×
10
5个 /gFW和 79.14%。而当甘露醇浓度高于或
低于 0.4 mol/L时 ,原生质体产量的活力都呈下降
趋势。从原生质体的形态看 ,当甘露醇的浓度低于
0.4mol/L时 ,分离得到的原生质体膨胀 ,有破裂现
象;在甘露醇浓度为 0.4 mol/L时 ,分离得到的原生
质体光亮且圆形规则;当甘露醇的浓度高于 0.4
mol/L后 ,分离得到的原生质体形状不规则 ,皱缩 。
因此 ,最适甘露醇浓度为 0.4 mol/L。
2.3 　酶解时间对原生质体提取的影响　采用筛选
出的最佳混合酶液(0.4 mol/L的甘露醇调节渗透
压),分别进行 4、5、6、7 h的酶解处理。结果在 4 ～ 6
h内 ,随着酶解时间的增加 ,原生质体产量也相应提
高 ,其中酶解 6h的原生质体产量最高 ,达到 1.5×
10
5个 /gFW,并且得到的原生质体在显微镜下观察
形态完整 ,质膜完好 ,活力为 79.14%。而当酶解时
间超过 6 h后 ,原生质体产量和活力又相对降低 ,且
大部分原生质体质膜已破裂 ,碎片显著增加 ,表明原
生质体产量下降是最早游离的原生质体大量破碎所
致 。所以酶解 6h,应及时进行收集与纯化 。
2.4 　pH值对原生质体提取的影响　采用筛选出
的最佳混合酶液(附加 0.4 mol/L的甘露醇),将其
pH值分别调为 5.4、5.6和 5.8,并于 26.5℃黑暗条
件下对菘蓝叶片酶解 6 h。不同 pH值下进行原生
质体产量及活力测定。结果酶液的 pH值大于或小
于 5.6,均会影响菘蓝原生质体的产量和活性 , 5.6
时达到最高的 79.14%。究其原因可能是由于 pH
值影响了酶的活性 ,或影响了原生质体的稳定性 ,从
而影响原生质体的制备效率 。因此 ,提取菘蓝原生
质体的最适 pH值为 5.6。
2.5　蔗糖浓度对原生质体纯化的影响　菘蓝叶片
酶解后用 18%、21%、24%、27%4种不同浓度的蔗
糖对原生质体进行纯化 ,结果见表 2、图 1。用 18%
的蔗糖纯化后的原生质体大多数已沉到离心管底
部 ,得到的条带不明显(图 1-a);用 21%的蔗糖纯
化 ,得到的原生质体条带最清晰(图 1-b),在显微镜
下能够观察到纯化较干净的原生质体(图 2-b);用
24%的蔗糖纯化得到的条带呈絮状 (图 1-c);用
27%的蔗糖纯化后 ,原生质体和杂质都漂浮在上下
两层液面之间 ,下层无沉淀(图 1-d)。因此 ,菘蓝原
生质体纯化的最适蔗糖浓度为 21%。
　表 2 　蔗糖浓度对原生质体提取的影响
蔗糖浓度 /% 产量 /(×105个 /gFW)
18 0.7
21 1.5
24 0.9
27 0.5
图 1　纯化时获得的原生质体聚集带
a.18%蔗糖　b.21%蔗糖　c.24%蔗糖　d.27%蔗糖
图 2　纯化前后原生质体观察(×400)
a.纯化前原生质体　b.纯化后原生质体
3　讨论
3.1　酶种类对原生质体分离的影响　酶是分离原
生质体的关键成分。纤维素酶 、果胶酶及离析酶是
常用的酶类。在具体的分离过程中通常为其中的一
种或多种配合使用 。但植物种类不同时所需的最适
·665·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 5期 2009年 5月
酶种类有较大差别 〔8, 9〕。本实验在预试验过程中用
纤维素酶(CelulaseR-10)、果胶酶(Petinase)和离
析酶(MacerozymeR-10)对菘蓝原生质体进行了分
离 。结果发现:CelulaseR-10和 PectinaseY-23配
合使用 ,很难分离得到菘蓝原生质体 ,而 Celulase
R-10和 MacerozymeR-10配合使用 ,能在较低的浓
度下和较短的时间内得到大量菘蓝原生质体。
3.2 　酶液浓度和酶解时间对原生质体分离的影响
　酶解去壁对植物细胞是一个严重的机械损伤和生
理损伤过程 。适宜的分离条件要求既能将细胞壁完
全去除 ,又要尽量减少对原生质体的损伤 。当酶种
类确定后 ,酶液浓度和酶解时间成为影响分离效果
最重要的因素〔10〕。建立适宜的酶解浓度-时间组合
是获得高产优质原生质体的重要条件 。本实验结果
表明 ,菘蓝幼叶用 1.0%CelulaseR-10+0.1%Mac-
erozymeR-10酶解液 ,酶解 6h可获得大量活力较高
的原生质体 。
3.3 　渗透压对原生质体分离的影响　建立一个稳
定的酶液渗透压体系是影响菘蓝原生质体分离的另
一重要因素 。不同植物原生质体分离时用到的甘露
醇浓度差别很大 〔11, 12〕。渗透压稳定剂一般有甘露
醇 、山梨醇 、蔗糖 、葡萄糖等 。本实验中以甘露醇作
为渗透压稳定剂 ,最适浓度为 0.4 mol/L。
3.4 　叶龄对原生质体的影响　菘蓝叶肉原生质体
产量及活力受组培苗叶龄的大小影响很大 ,尚未展
开的较小细嫩叶片 ,分离得到的原生质体极易破碎;
由老叶分离原生质体时则产生大量碎片及其它形状
不规则的杂质 ,界面离心纯化时 ,常常很难形成界
面 ,因此 ,酶解时应选择生长旺盛 、颜色深绿 、刚刚展
平的细嫩叶片 ,经酶解后容易得到较高产量和活力
的原生质体 。这与 PeralesEH〔13〕研究结论相一致 。
本试验采用 10 ～ 15 d苗龄的菘蓝组培苗叶片作为
初始分离原生质体的材料 ,效果最佳。
参 考 文 献
[ 1] 陈发棣 , 赵宏波 ,房伟民 , 等.菊科植物原生质体研究进
展 [ J] .西北植物学报 , 2005, 25(9):1913-1920.
[ 2] 张润珍 , 张玉文 .板蓝根的研究进展 [ J] .中草药 ,
2000, 31(6):474-476.
[ 3] 陈微 , 梅文泉 ,赵丰萍 , 等.菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬
浮培养 [ J] .西南农业大学学报 , 2002, 24(2):105-107.
[ 4] 陈秋芳 , 黄群策 ,秦广雍 .菘蓝叶片离体培养与试管无
性系的建立 [ J] .河南农业科学 , 2007, (12):98-100.
[ 5] 范春丽 , 陶澜 ,林呐 , 等.甘蓝型黄籽油菜原生质体的游
离和纯化 [ J] .中国农学通报 , 2005, 21(2):43-45.
[ 6] 孙敬三 , 朱至清 .植物细胞工程实验技术 [ M] .北京:
化学工业出版社 , 2006:7-8.
[ 7] 杨汉民 .细胞生物学实验(第二版)[ M] .北京:高等教
育出版社 , 1997:58-60.
[ 8] 谷晓峰 , 罗正荣 .罗田甜柿原生质体分离 、培养及植株
再生 [ J] .园艺学报 , 2002, 29(4):369-371.
[ 9] 景艳春 , 康向阳 ,王君 , 等.新疆杨叶肉原生质体游离和
纯化的研究 [ J] .西北植物学报 , 2007, 27(3):509-514.
[ 10] JourdanPS, EarleED, MutschlerMA.Improvedproto-
plastcultureandstabilityofcytoplasmictraitsinplants
regeneratedfromleafprotoplastsofcauliflower(Brassica
Oleracessp.botrytis)[ J] .PlantCell, Tissandorgan
culture, 1990, 31(3):227-236.
[ 11] 严寒 ,田志宏 .马蹄金子叶原生质体的分离技术 [ J] .
植物生理学通讯 , 2005, 41(1):73-76.
[ 12] 马占强 ,林良斌 , 董娜 , 等 .紫罗兰下胚轴原生质体分
离条件的研究 [ J] .云南农业大学学报 , 2005, 20(2):
155-158.
[ 13] PeralesEH, SchiederO.Plantregenerationfromleaf
protoplastsofapple[ J] .PlantCell, TissueandOrgan
Culture, 1993, 34(1):71-76.
本刊投稿须知
1　本刊从 2006年第 1期起将刊登 “作者简介 ”内容 ,请作者在文章首页下脚按 “姓名 、出生年 、性别 、职称 、
研究方向和联系方式 ”等内容注明。
2　来稿应为打印稿 ,投稿时不必附软盘;实验性文章应附单位介绍信 。
3　本刊目前一律不处理网上投稿 ,请作者务必以邮寄方式投稿 。
4　投稿同时请从邮局汇寄处理费(50元 /篇),切勿在稿件中夹带现金;汇款时请注明文章第一作者姓名及
稿件题目。
·666· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 5期 2009年 5月