全 文 ：第 27 卷第 4 期
2 0 0 6 年 1 2 月
扬州大学学报 (农业与生命科学版 )
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2 7 N o
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2 0 0 6
· 研究简报 ·
亚麻莽原生质体培养再生植株的研究
张永泰 ` , 毛善靖 2 , 李爱民 ’ , 秦旭颖 2 , 王幼平 2 `
l(
. 江苏省里下河地区农业科学研究所 . 江苏 扬州 , 2 25 0 07 ; 2 . 扬州大学 生物科学与技术学院 , 江苏 扬州 , 2 25 0 0 9)
中圈分类号 : 5 5 65 文献标识码 : A 文章编号 : 1 6 7 1 一 4 65 2 ( 2 0 0 6 ) 0 4 一 0 0 7 8 一 0 2
亚麻莽 ( aC o el ia n s a t动us L . C r a n t z . )为+ 字花科一 禁乙酸 , 0 . 2 m g · L 一 ’ 6 一 B A , pH s · 8 )离心洗涤 l ~ 2 次即
年生草本植物川 。 其种子含油率为 4 30 9 · k -g ` , 粗蛋白 可得到较纯净的原生质体 。
含量为 30 ~ 3 40 9 · k -g ’ ,富含维生素 ( 70 0 m g · kg- ’ ) , 3) 原生质体培养和植株的再生 : 经纯化后的原生质
目前尚未得到充分利用川 . 亚麻葬油中含有多种对人体 体用原生质体培养基调整密度至 l x 1 0 5 个 · m L 一 ’ , 将
有益的不饱和脂肪酸 ,含量高达 90 9 · k g 一 `以上 ,其中亚 2 m L 原生质体悬浮液滴在直径 6 cm 的培养皿 中 , 于
麻酸含量达 3 0 9 · k g- ` , 亚油酸含量达 1 80 9 · k g 一 , , 这 25 ’ C 黑暗条件下液体静置培养 。 在 10 ~ 30 d 的培养中 ,
2 种不饱和脂肪酸具有降低血液中低密度脂蛋白及胆固 每隔 3 d 加人 0 . 2 m L 新鲜培养基 ,并观察原生质体成壁
醉的作用 , 可保持心 脏及心血管的健康闭 . 同时 , 亚麻油 及再生细胞的分裂情况 。 当肉眼观察到愈伤组织时 . 用粗
中高含量不饱和脂肪酸对人的皮肤具有极好的保健作 头的吸管小心吸出愈伤组织 ,转人固体培养基中 ( M S十
用 ,作为护肤产品的开发对象 ,亚麻油已成为化妆品工业 10 9 · L 一 ’ 蔗糖 , 20 9 · L 一 ’ 山梨醇 , 2 50 m g · L 一 ’水解酷
中的新原料之一 ,具有较高的工业利用价值闭 。 迄今 ,有 蛋白 , 6 9 · L 一 ’琼脂搪 , 。. s m g · L 一 ’ N A A , .0 s m g · L 一 ’
关亚麻葬原生质体培养再生植株的研究尚未见报道 。 6一B A , 1 m g · L 一 ’ T D Z , pH .5 8) 。 愈伤组织长到一定体积
为了开发和利用亚麻葬优质种质资源 ,本试验以亚 后 , 进行相同培养基的继代培养 (每 4 周 1 次 ) , 直至芽出
麻葬无菌苗幼叶为试验材料 ,建立原生质体培养及植株 现 . 切下长出的芽转到普通 M S 培养基中 , 4 周后进行生
再生的实用技术体系 , 为开展原生质体融合 (远缘体细胞 根培养 ,培养基为 M S + 0 . 5 m g · L 一 ’ N A A + 6 9 · L 一 ’琼
杂交 )及遗传转化提供条件 . 脂糖 。
1 材料与方法 2 结果与分析
1
.
1 供试材料 2 . 1 原生质体分离
供试材料亚麻莽品种为 C A M I / 9 6 , 由德国 IP K 研究 由光照培养 4 周的绿苗叶片通过酶解可获得大量的
所 G en eb an k 博士提供 。 原生质体 。 选择合适的酶液组成 、浓度和酶解时间是获得
1
.
2 试验方法 高质量原生质体至关重要的因素 。 本试验选用 0 . 25 %纤
1) 无菌苗获得 : 亚麻葬种子用 70 m L · L 一 `乙醉浸 维素酶和 .0 05 %离析酶组合 , 25 ` c 黑暗培养过夜后 , 轻
泡 l m in , 无苗水冲洗 1次 ,转人 30 9 · L 一 ’次抓酸钠溶液 微摇晃 ( 10 O r · m in 一 ’ , 10 m in ) ,分离原生质体效果非常
中消毒 25 m in , 无菌水冲洗 5 次 ,接种于含 30 9 · L 一 ’蔗 理想 , 而且以 4~ 5 周的幼苗作为外植体最为理想 .
糖和 6 9 · L 一 ,琼脂的 12/ M s 培养基中 , 25 ℃发芽 , 培养 2 . 2 原生质体密度
4 周后便长成可供利用的无菌苗 . 原生质体能进行正常细胞分裂的首要条件是细胞壁
2) 原生质体分离 : 将无菌苗叶片切成小片 . 在酶液 的再生 ,这需要采用不同浓度配 比的蔗糖 、 甘露醉和山梨
( 0
.
25 %纤维素酶 o n oz u k a R 一 10 和 0 . 05 % 离析酶 R 一 10 ) 醇作渗透压稳定剂 。 有研究川表明 , 蔗糖是细胞壁再生的
中酶解过夜 , 经 50 拌m 滤网过滤 、 洗涤 (0 . 154 m of · L 一 ` 关键性条件 ,但是蔗糖浓度过高会抑制原生质体生长 . 本
N a C I
,
0
.
2 25 m o l
·
L 一 ’ C a C I: · Z H ZO , 0
.
0 0 5 m o l
·
L 一 ’ 试验结果表明 ,单独使用 13 0 9 · L 一 `蔗糖 , 原生质体均漂
K a
,
0
.
005 m ol
·
L
一 ’葡萄糖 , p H 5 . 8) 、 离心 , 去上清液 , 浮在培养基表面 , 原生质体分裂频率很低 。 用 45 9 · L 一 ’
吸取原生质体 ,再用原生质体培养基 ( M S + 150 m g · L 一 ` 山梨醇配合 45 9 · L 一 ’甘露醉作渗透压稳定剂效果较好 ,
水解酪蛋白 , 8 7 5 m g · L 一 ’ C a C I: · Z H ZO , 4 5 · 5 9 · L 一 `山 当培养密度为 2 x 1 0 3 、 2 x 1 0 ` 、 l 义 1 0 , 、 1 x 2 0` 个 · m L 一 ’
梨醇 , 4 5 . 5 9 · L 一 `甘 露 醇 , 2 . 5 9 · L 一` D 一葡 萄糖 . 时 , 原生质体分裂频率依次为 20 % 、 60 % 、 75 % 、 45 % 。 由
12 5 m g
·
L 一 ` D 一果糖 , 0 . 5 m g · L 一 ` 2 , 4一D , 。 . 2 m g · L 一 ’ 此可见 , 在此培养基中 ,培养密度对原生质体分裂频率的
收稿日期 : 2 0 0 6 一 0 7 一 2 2
鑫金项 目 : 江苏省高新技术研究计划项目 ( BG Z。 。53 0 8) ; 扬州大学大学生创新基 金资助项 目
作者简介 : 张永泰 ( 1 9 6 4一 ) . 男 , 江苏兴化人 . 江苏省里下河地区农业科学研究所副研究员 , 主要从事油料作物遗传育种研究 .
, 联系作者 , E一 m a i l : w a n g y p@ y z u · e d u · c n
第 4 期 张永泰等 : 亚麻莽原生质体培养再生植株的研究 7 9
影响很大 ,培养过程中需要确定一个合适的接种密度 。 在
培养过程中 ,每隔 3 d 加人新鲜培养基有利于原生质体的
分裂 。
2
.
3 原生质体培养 、 愈伤组织及芽的形成
在培养密度为 I X 10 5 个 · m L 一 `条件下 , 亚麻莽的原
生质体培养 l d 即开始形成细胞壁 , 可观察到部分原生质
体分裂 ,且 以均等分裂为主 。 原生质体发生第 1 次分裂的
时间不等 ,培养 1~ 7 d 时均可观察到 ,培养 3~ 7 d 时部分
细胞发生第 2 次分裂 ,形成 4 细胞团 (图 l . A ,见封三 ) 。 培
养 10 d 时 ,形成具有 10 个细胞的细胞团 (图 1 . B , 见封
三 ) ; 培养 4 周 后 , 逐渐 形成肉眼可 见的小 愈伤 组织
(图 1. C ,见封三 ) , 小愈伤组织被转移至固体培养基中再
培养 4 周 , 可见有绿色的愈伤组织形成 (图 1 . D , 见封三 ) 。
在相同培养基中每 4 周进行继代培养 1 次 (图 1 . E , 见封
三 ) ,培养 4 周后 , 可见小绿芽出现 (图 1 . F ,见封三 ) . 切下
小芽转人普通的 M S 培养基中 , 以利于幼苗生长 。 本试验
从 270 个愈伤组织中再生获得 21 株幼苗 ,幼苗再生频率
为 7 . 8% 。
丰富的变异类型压 ’ 〕 。 近年来体细胞杂交的重点转移到创
造胞质杂种以转移雄性不育等细胞质基因组控制的遗传
性状 , 或通过细胞融合对现有雄性不育系进行改良方面 。
作者计划通过甘蓝油菜与亚麻养远缘杂交 ,获得有利于油
菜脂肪酸改良的新的种质资源和雄性不育系 , 以应用于油
菜育种 ,从而促进油菜脂肪酸改良的发展 。
参考文献 :
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[ 2〕
3 讨论
利用原生质体无性系变异可提供广泛的育种中间材
料 。 通过体细胞杂交的方法可消除种间甚至属间和科间的
不亲和障碍 ,这些种间和属间杂种为品种改良提供了十分
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