全 文 ：周向军，高义霞，杨 丽，等． Folin － Ciocalteu比色法测定乳苣多酚含量［J］． 江苏农业科学，2013，41(1) :300 － 302．
Folin － Ciocalteu比色法测定乳苣多酚含量
周向军1，高义霞1，杨 丽1，张 继1，2
(1．天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水 741001;2．西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070)
摘要:以没食子酸为对照，研究 Folin － Ciocalteu 法测定乳苣多酚的最佳条件。结果最佳条件为:Folin － Ciocalteu
试剂与 10% Na2CO3 比为 1 ∶ 3，反应时间 8 min，反应温度 80 ℃，Folin － Ciocalteu试剂 8 mL。重现性试验相对标准偏
差(RSD)为 1． 22%，稳定性试验 RSD为 1． 73%，加标回收率为 109． 52%。该法方便准确，可用于测定乳苣多酚含量。
关键词:乳苣;多酚;Folin － Ciocalteu;含量
中图分类号:S636． 901 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)01 － 0300 － 03
收稿日期:2012 － 07 － 01
基金项目:国家自然科学基金(编号:50773064) ;天水师范学院重点
学科支持项目(编号:ZD08037)。
作者简介:周向军(1980—) ，男，甘肃镇原人，硕士，讲师，主要从事天
然产物研究与开发;E － mail:zhouxiangjun125@ 126． com。
通信作者:张 继，女，研究员，主要从事天然植物研究。
乳苣(Mulgedium tataricum L．) ，别称蒙古莴苣、苦菜等，
多年生草本植物，广泛分布于我国各地，民间常被当作野菜食
用，具有抗菌、抗炎等功效［1 － 2］。多酚具有抗动脉硬化、降低
血压和胆固醇、抗衰老、抗氧化、抗辐射、提高免疫力等作
用［3 － 4］。目前常见的多酚测定方法有高锰酸钾滴定法、薄层
层析法、气相色谱法、高效液相色谱法、香草醛法、Folin － Cio-
calteu法、原子吸收法、铁氰化钾分光光度法等［5 － 8］。各种方
法在实际应用中均存在一定的缺点:如高锰酸钾滴定法滴定
终点较难观察;薄层层析法在分离效果、准确方面存在缺陷;
高效液相色谱法较昂贵;香草醛和铁氰化钾分光光度法稳定
性差，干扰因素多［9］;部分测定方法误差大，灵敏度不够，繁
琐费时［10］。Folin － Ciocalteu法操作简便，是国际上酚类物质
测定的常用方法，有关其对乳苣多酚含量的测定还未见报道。
为了更深入开发乳苣多酚，本试验以邻苯三酚为对照，通过
Folin － Ciocalteu法对乳苣多酚测定条件进行优化，同时对该
方法的稳定性、重现性及加标回收率等进行了评价，旨在建立
一种简便、准确的乳苣多酚含量测定方法，为其进一步研究提
供可靠的依据。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂
乳苣采自甘肃靖远县水田边，50 ℃杀青粉碎过 80 目筛
备用。
UV －1800 紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;722 分光
光度计(上海欣茂) ;TGL － 20M 离心机(湘仪离心机仪器有
限公司) ;DK － S24 电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限
公司) ;RE －2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
Folin － Ciocalteu 试剂(福林试剂)配制按王岸娜的方
法［11］稍作修改:在 1 L磨口回流装置内加入 50 g 钨酸钠、12．
5 g钼酸钠、350 mL H2O、25 mL 85%浓磷酸及 50 mL 37%浓
盐酸，充分混匀，以小火回流 10 h，加入 75 g 硫酸锂、25 mL
H2O、30 mL H2O2，开口继续加热至沸腾，维持 15 min，去除多
余的 H2O2，溶液呈金黄色，冷却后补足蒸馏水至 500 mL，置
于冰箱中长期冷藏备用，临用时稀释 2 倍。
1． 2 方法
1． 2． 1 乳苣多酚的制备 在提取时间 40 min、浸提温度
35 ℃、液固比 25 mL ∶ 1 g、乙醇浓度 55%的条件下提取乳苣
多酚，3 000 r /min离心 15 min，保留上清液，滤渣进行第 2 次
抽提，合并 2 次上清液，旋转蒸发浓缩并定容，得多酚粗
提液［12］。
1． 2． 2 最大吸收波长的选择 准确吸取 0． 5 mL 乳苣多酚
液、3 mL福林试剂于 10 mL容量瓶中摇匀，静置 4 ～ 5 min，加
3 mL 10% Na2CO3，摇匀，75 ℃保温 10 min，蒸馏水定容，显色
后扫描，以 55%乙醇代替样液作对照。
1． 2． 3 福林试剂与 10% Na2CO3 比例的选择 吸取 2 mL多
酚定容至 50 mL，吸取 5 mL于 100 mL容量瓶中，加入 50 mL
H2O，3 mL福林试剂摇匀，静置 4 ～ 5 min，加入不同体积 10%
Na2CO3，使福林试剂与 10% Na2CO3 体积比分别为 3 ∶ 1、
2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 10，定容，75 ℃恒温水
浴 10 min，测定吸光值。
1． 2． 4 反应温度、反应时间及福林试剂用量的确定 分别在
不同反应时间、不同反应温度及福林试剂用量下测定吸光值，
确定最佳用量。
1． 2． 5 正交试验 为了进一步考察各因素影响的显著性，确
定乳苣多酚测定的最佳条件，在单因素基础之上选择福林试
剂与碳酸钠体积比、福林试剂用量、反应时间和反应温度为因
素，进行正交试验［L9(3
4) ］。
1． 2． 6 标准曲线的制作及乳苣多酚含量测定 以吸光值为
纵坐标，没食子酸质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。取一
定体积乳苣多酚液，同标准曲线操作，计算样液多酚含量。
1． 2． 7 分析方法的评价
1． 2． 7． 1 重现性试验 精确吸取乳苣多酚液 0． 04 mL 各 5
份，按上述方法测定，计算 RSD。
1． 2． 7． 2 稳定性试验 精确吸取乳苣多酚液 0． 04 mL 各 5
份，按上述方法测定，反应结束后在 4 ℃分别放置 0、0． 5、1、
2、3、4、5 h，测定吸光值，计算 RSD［13］。
1． 2． 7． 3 加标回收率试验 准确吸取已确定浓度的乳苣多
—003— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 1 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.01.110
酚各 5 份，每份 0． 04 mL，各组精确加入不同量没食子酸，使
其分别为 0． 05、0． 1、0． 125、0． 15、0． 175 mg，依上法测定，以加
标测得的量减去原样的量，除以加标量，计算加标回收率［14］。
2 结果与分析
2． 1 最大吸收波长的选择
酚类化合物与福林试剂反应后生成蓝色化合物，通过测
定蓝色化合物吸收光谱，选定最大吸收波长作为比色法测定
波长［15］。由图 1 可知，乳苣多酚与福林试剂作用后在 745 ～
755 nm范围内具有最大吸收峰，选择 750 nm作为测定波长。
2． 2 福林试剂用量及其与 10% Na2CO3 比例的选择
显色剂与酚类化合物的显色反应必须在碱性条件下完
成，Na2CO3 提供一定的碱性环境，其数量不足将影响显色效
果［16］，因此福林试剂及其与 Na2CO3 的比例会影响体系的比
色。由图 2 可知，福林试剂与 10% Na2CO3 在 1 ∶ 10 ～ 3 ∶ 1
范围内，吸光值不断增大;当福林试剂与 10% Na2CO3 之比达
到 1 ∶ 2 时，吸光值开始下降，因此选择 1 ∶ 3 作为最佳比例。
由图 3 可知，福林试剂用量在达到 7 mL 前，随其体积的增加
吸光值不断增加，随后开始下降，因此选择 7 mL为最佳体积。
2． 3 反应温度的确定
显色温度对比色灵敏度也有一定影响，过高或过低均不
利于多酚显色。由图 4 可知，在温度达到 75 ℃之前，随温度
增加，吸光值缓慢增加，至 75 ℃达到最大值，随后开始下降。
可能是生成的蓝色化合物在高温下不稳定，因此选择 75 ℃
作为最佳反应温度。
2． 4 反应时间的确定
酚类化合物与显色剂反应需要一个过程。由图 5 可知，
在 8 min之前，随时间延长，吸光值不断增加，8 min以后开始
下降，因此选择 8 min为最佳时间。
2． 6 正交试验
影响乳苣多酚测定的因素顺序为:B ＞ A ＞ C ＞ D，即福林
试剂用量对测定影响较大，达到显著水平，福林试剂与 10%
Na2CO3 比例、显色时间，反应温度影响不显著。乳苣多酚最
佳测定条件为 A2B3C2D3，即福林试剂用量 8 mL，福林试剂与
10% Na2CO3 比 1 ∶ 3，温度 80 ℃，反应时间 8 min。
表 1 乳苣多酚提取正交试验及结果
序号
A:福林与
碳酸钠比
B:福林用量
(mL)
C:显色时间
(min)
D:反应温度
(℃) 吸光值
1 1 ∶ 2 6 6 70 0． 711
2 1 ∶ 2 7 8 75 0． 825
3 1 ∶ 2 8 10 80 0． 851
4 1 ∶ 3 6 8 80 0． 864
5 1 ∶ 3 7 10 70 0． 865
6 1 ∶ 3 8 6 75 0． 899
7 1 ∶ 4 6 10 75 0． 733
8 1 ∶ 4 7 6 80 0． 780
9 1 ∶ 4 8 8 70 0． 877
k1 0． 796 0． 770 0． 797 0． 818
k2 0． 876 0． 823 0． 855 0． 819
k3 0． 797 0． 876 0． 816 0． 832
R 0． 080 0． 106 0． 058 0． 014
2． 7 标准曲线的制作
以吸光值为纵坐标，没食子酸质量(mg)为横坐标建立标
准曲线，见图 6。回归方程为 y = 2． 307 1x + 0． 012 1(r2 =
0. 999 6) ，y 为吸光值，x 为没食子酸质量 (mg)。在
0 ～ 0． 6 mg 范围内线性关系良好，可用于乳苣多酚含量测定。
2． 8 重现性试验
由表 2 可知，RSD为 1． 22%，表明具有良好重现性。
—103—周向军等:Folin － Ciocalteu比色法测定乳苣多酚含量
表 2 重现性试验
项目 1 2 3 4 5
D750 nm 0． 196 0． 199 0． 194 0． 198 0． 2
平均 RSD(%) 1． 22
2． 9 稳定性试验
由表 3 可知，随时间延长，吸光度呈现先下将后上升的趋
势，但幅度不大，RSD为 1． 73%，表明 5 h内稳定性良好。
2． 10 加标回收率试验
由表 4 可知，平均回收率为 109． 52%，其 RSD为 2． 91%。
表明该法具有较好的准确度，可用于乳苣多酚含量的测定。
表 3 不同时间的吸光值变化
编号 0(h) 0． 5(h) 1(h) 2(h) 3(h) 4(h) 5(h) RSD(%)
1 0． 196 0． 19 0． 186 0． 187 0． 185 0． 19 0． 194 1． 69
2 0． 199 0． 192 0． 188 0． 189 0． 19 0． 197 0． 198 2． 07
3 0． 194 0． 189 0． 187 0． 184 0． 188 0． 193 0． 195 1． 79
4 0． 198 0． 191 0． 186 0． 188 0． 192 0． 19 0． 192 1． 36
5 0． 2 0． 195 0． 191 0． 19 0． 19 0． 196 0． 198 1． 75
平均值 1． 73
表 4 加标回收率试验
编号
没食子酸量
(mg)
D750 nm
加标后测定量
(mg)
回收率
(%)
1 0． 05 0． 326 0． 136 112
2 0． 1 0． 437 0． 184 104
3 0． 125 0． 517 0． 219 111． 2
4 0． 15 0． 58 0． 246 110． 67
5 0． 175 0． 64 0． 272 109． 71
平均值 109． 52
3 讨论与结论
不同文献报道的福林法测定多酚条件差异较大，其中最
佳波长集中在 650 ～ 760 nm，显色温度在 20 ～ 60 ℃，显色时
间在 30 ～ 120 min，福林试剂用量在 1． 0 ～ 3． 0 mL，福林试剂
与碱溶液的体积比差异较大，在 1 ∶ 2 ～ 1 ∶ 5。本试验最佳反
应条件为:福林试剂与 10% Na2CO3 之比为 1 ∶ 3，反应时间为
8 min，反应温度为 80 ℃，福林试剂为 8 mL。本试验稳定性、
重现性和回收率试验 RSD分别为 1． 22%、1． 73%、2． 91%，与
苹果［17］、橄榄［18］、刺槐花［19］及竹醋液等［20］相近，可用于测定
乳苣多酚含量。该法测定总酚时易受其他还原物质(如还原
糖类、芳香氨基酸、抗坏血酸等)的干扰，因此这些物质对乳
苣多酚含量测定的影响有待进一步研究。
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