全 文 ：图５　加入４ｍｇ·ｍＬ－１蟾酥溶液的家兔交感神经放电曲线
图６　加入６ｍｇ·ｍＬ－１蟾酥溶液的家兔交感神经放电曲线
由图１－图６可见，随着蟾酥溶液浓度的升高，
家兔交感神经放电逐渐减弱．说明蟾酥对家兔的
交感神经有一定的影响．
３　讨论
随着蟾酥浓度的升高，家兔交感神经放电逐
渐减弱．
原因一，交感神经可以增大心搏力量，使心肌
收缩力增强，心脏射血功能加强，每搏输出量增
加，心输出量增多，动脉血压升高．蟾酥使心肌收
缩力增强，向家兔耳缘静脉内注射一定浓度的蟾
酥溶液时，家兔心肌收缩力增强，血压升高，可能
抑制了交感神经的兴奋，使交感神经放电减弱．［８］
原因二，交感神经能加速心搏频率，使每分输
出量增多，外周阻力增大，血压升高．但蟾酥具有加
快心率的作用，向家兔耳缘静脉内注射一定浓度的
蟾酥溶液时，家兔心搏频率加速，血压升高，可能抑
制了交感神经的兴奋，使交感神经放电减弱．
原因三，交感神经可以使血管收缩，从而增加
血流外周阻力，提高血压．蟾酥在一定范围内具收
缩冠状动脉和升高血压的作用，家兔在被注射入
蟾酥溶液后，收缩冠状动脉，致使血压升高，抑制
了交感神经的兴奋，使交感神经放电减弱．
原因四，交感神经对气管平滑肌具有抑制作
用，可以使支气管扩张，有利于通气．蟾酥具有显
著的呼吸兴奋性作用，使家兔的呼吸加深加快，心
肌收缩力加强，心输出量增强，心率加快，动脉血
压升高，可能抑制了交感神经的兴奋，使交感神经
放电减弱．［９］
参考文献
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ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００２，７２（６）：６９９－７０９．
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编辑：琳莉
　　收稿日期：２０１５－０９－０１
通讯作者：潘裕添
白凤菜醇提物对斑马鱼酒精性脂肪肝损伤的修复
陈灿滨１，陈志亮２，薛　钰１，张文娟１，李秀敏１，潘裕添１＊
（１．闽南师范大学 菌物产业工程技术中心，福建 漳州 ３６３０００；２．漳州片仔癀药业股份有限公司，福建 漳州 ３６３０００）
摘　要：以斑马鱼为实验材料，研究白凤菜醇提物对斑马鱼酒精性脂肪肝损伤的修复作用．实验结果表明，
白凤菜醇提物对斑马鱼慢性酒精性脂肪肝具有防治作用．白凤菜醇提物能抑制成鱼酒精肝损伤血
清中ＡＬＴ和ＡＳＴ的升高，抑制肝组织中 ＭＤＡ的升高，提高肝组织中ＳＯＤ活性水平；能够有效减
轻肝脏的炎性病理；能够升高斑马鱼幼鱼组织匀浆液中的 ＡＳＴ和 ＡＬＴ含量，抑制肝组织中 ＭＤＡ
的升高，提高肝组织中ＳＯＤ活性水平，幼鱼整体肝脏脂肪明显减少．
关键词：斑马鱼；白凤菜；酒精肝；脂代谢；胆固醇
［中图分类号］Ｑ５９３　　　［文献标志码］Ａ　　　　［文章编号］１００３－６１８０（２０１６）０１－００５３－０４
　　酒精性肝病是世界范围内关注的健康问题， 其确切的发病机制尚不清楚，为了进一步研究酒
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２０１６年第１期 牡丹江师范学院学报（自然科学版） Ｎｏ．１，２０１６
（总第９４期） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ　９４
DOI:10.13815/j.cnki.jmtc(ns).2016.01.022
精性脂肪肝预防和发病机制，理想的实验动物模
型是非常重要的．［１］酒精饲养是传统酒精性脂肪
肝造模的常规方法，原理是通过长时间饮酒引起
肝脏损伤导致机体产生过量代谢产物或者乙醛，
从而释放肾上腺素导致体内血压升高，肝细胞缺
氧，造成肝细胞空泡变性，严重者甚至坏死．［２－３］本
研究实验动物采用斑马鱼，其基因与人类７０％蛋
白质编码基因相关，８７％的基因与已知人类疾病
有关的基因组相对应［４］，遗传发育和生理与哺乳
动物相似，酒精可以简单地添加到饲养的鱼水，在
一定程度上模拟人饮用酒精的状态，实验花费时
间少，费用低．白凤菜（Ｇｙｎｕｒａ　ｄｉｖａｒｉｃａｔａ（Ｌ．）
ＤＣ．），又名白子菜、白背三七，为菊科菊三七属多
年生草本植物，分布于台湾省至华南、西南一带，
喜生于潮湿的阴地上．白凤菜的根、茎、叶均可入
药，主入肝、肺、肾、大小肠诸经，有消炎、解热、解
毒、利尿、降血压等功效，主治肝炎、肝硬化、肺炎、
肺癌、高血压、感冒、发烧、肾脏炎等疾病．［５－６］本研
究通过酒精处理建立斑马鱼成鱼、幼鱼酒精性脂
肪肝模型，研究白凤菜醇提物对酒精引起的斑马
鱼肝损伤的保护作用．
１　材料与方法
１．１　实验药物
将白凤菜晒干，置于电热鼓风干燥箱内６０℃
烘干，粉碎，过５０目筛，密封备用．取一定量的白
凤菜粉末，用７０％乙醇提取３次，每次２ｈ．合并
提取液，抽滤掉白凤菜渣滓，滤液旋转蒸发浓缩至
适宜体积，浓缩后乙醇溶剂粗提物用离心浓缩仪
离心浓缩至粉末，恒温箱挥发多余的乙醇，备
用．［７］
１．２　实验动物
４－５月龄的野生型成年斑马鱼．２８±１℃恒温
环境中，光照１４ｈ明－１０ｈ暗，每日三餐定时喂食
新鲜丰年虫，饲养一个星期，待用．斑马鱼幼鱼来
自野生型ＴＵ品系斑马鱼，前一晚取卵．将野生型
ＴＵ品系斑马鱼喂饱后放入交配缸中，雌雄鱼分
开，中间插入隔板，次日清晨拨开挡板收集胚胎．
胚胎培养于２８℃恒温培养箱中培养至９６ｈｐｆ．恒
温培养箱要及时换水，剔除死卵．
１．３　实验试剂与实验仪器
水乙醇、丙二醇、苏木精、伊红染液；ＡＬＴ，
ＡＳＴ，ＴＣ，ＴＧ，ＳＯＤ，ＭＤＡ 生化试剂盒；Ｎｉｋｏｎ
ＳＭＺ１８体视显微镜，ＴＥＣＡＮ　ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００ＰＲＯ
酶标仪，Ｌｅｉｃａ　ＴＰ　１０２０脱水机，Ｌｅｉｃａ　ＥＧ１１５０Ｈ
包埋机，ＳＬＥＥ包埋机．
１．４　实验
斑马鱼成鱼、幼鱼均分为５组：正常组、模型
组、白凤菜醇提物低剂量组、白凤菜醇提物中剂量
组和白凤菜醇提物高剂量组．成鱼鱼缸中酒精浓
度１．０％，鱼水每日一换，连续四周．对照组以常
规鱼水饲养．实验组自造模之日起，分别加入白凤
菜醇提物低、中、高浓度的药物于鱼水中．幼鱼鱼
缸中酒精浓度２．０％，饲养３２ｈ．自造模之日起，
分别加入白凤菜醇提物低、中、高浓度的药物于鱼
水中．
检验项目　成鱼体重、肝重、肝脏指数；斑马
鱼血清肝功能检测 ＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、ＴＣ活
性、ＴＧ活性、ＳＯＤ活性、ＭＤＡ活性．
成鱼肝脏 ＨＥ染色　将固定的组织样脱水，
用石蜡进行包埋，切片，厚度为４μｍ，漂片后
７０℃烘片３０ｍｉｎ，苏木素－伊红（ＨＥ）染色，中性
树胶封片，ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４０显微镜进行观察．
幼鱼肝脏大小及卵黄吸收显微镜拍照及统计
　随机挑选斑马鱼幼鱼，使用低浓度ｔｒｉｃａｎｅ麻
醉，在ＮｉｋｏｎＳＭ１８体视显微镜拍照统计，按照斑
马鱼的表形分为正常、一般严重、严重三个组别进
行归类．
白凤菜醇提物对斑马鱼幼鱼整体油红染色脂
肪含量的影响　将随机选取的斑马鱼幼鱼放在培
养皿中，多聚甲醛固定２～４ｈ，ＰＢＳ洗３～４次，丙
二醇低浓度到高浓度梯度脱水，０．５％油红避光孵
育，摇晃过夜．丙二醇高浓度到低浓度复水，洗净
背景，８０％甘油４℃永久保存．ＮｉｋｏｎＳＭ１８体视
显微镜拍照统计．［８］
斑马鱼幼鱼谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨
酶（ＡＳＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力和丙二
醛（ＭＤＡ）含量测定　斑马鱼幼鱼发育至９６
ｈｐｆ，挑选发育正常的斑马鱼幼鱼，移入６孔板的
样孔中，每个培养孔中放入５０条斑马鱼幼鱼，
设置对照组和模型组以及白凤菜醇提物低、中、
高共五组．样孔中加入新配好的酒精溶液，对照
组为胚胎培养用水．每个组别设３个重复．待实
验结束后，测定 ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＳＯＤ活力和 ＭＤＡ
含量．［９］
生物化学与分子生物学指标　９６ｈｐｆ斑马鱼
幼鱼实验处理３２ｈ，用试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）提取总
ＲＮＡ．取等量浓度的ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ，半
定量ＲＴ－ＰＣＲ反应．引物及ＰＣＲ循环数见表１．
取等量的反应产物电泳跑胶，以ａｃｔｉｎ作内参，拍
照，使用ＮＩＨ的Ｉｍａｇｅ　Ｊ软件对凝胶图像进行电
泳条带信号强度分析，计算出各个基因的相对表
达率．［１０］
　　统计学处理　所有数据均以平均数±标
准差（ｘ±ｓ）表示，用ＳＰＳＳ１０．０软件处理，采用单
因素方差分析法，Ｐ＜０．０５表示差异具有显著性
水平，Ｐ＜０．０１表示差异为极显著性水平．
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２０１６年第１期 牡丹江师范学院学报（自然科学版） Ｎｏ．１，２０１６
（总第９４期） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ　９４
表１　半定量ＲＴ－ＰＣＲ引物及ＰＣＲ反应循环数
Ｇｅｎｅ
ｓｙｍｂｏｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′／３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　 Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ａｃｃ１
Ｆａｓｎ
Ｆａｄｓ２
Ｈｍｇｃｓ１
Ｈｍｇｃｒａ
Ｈｍｇｃｒｂ
ＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡＣＴ
ＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧ
ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＧＡＡＴＣＡＣＣＧ
ＧＧＴＣＧＴＴＡＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴ
ＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ
ＧＣＣＴＧＴＴＡＧＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＡ
ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＧＡ
ＧＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧ
ＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＣＧＴＡＣＡＡＧＧ
ＧＡＴＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡ
ＡＴＣＧＧＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴ
ＴＣＧＴＧＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴ
３０
２３
２２
３０
２５
２５
２　结果与分析
２．１　白凤菜醇提物对斑马鱼成鱼体重、肝重和肝
指数的影响
　　酒精肝模型斑马鱼体重下降，肝脏重量升高，
肝指数显著升高（Ｐ＜０．０５）；与模型组比较，不同
浓度白凤菜醇提物组肝重下降，体重和肝指数都
升高，结果见表２．
表２　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼体重、肝重和
肝指数的影响
组别 体重／ｇ 肝重／ｇ 肝指数／（ｇ／ｇ）
对照组
模型组
白凤菜高浓度组
白凤菜中浓度组
白凤菜低浓度组
０．２９３２±０．０３２５
０．２７４３±０．０４１６
０．２８６４±０．０３２７
０．２９４５±０．０４３３
０．２８８４±０．０２９６
０．００５１±０．０００７
０．００５７±０．０００９
０．００５５±０．０００６
０．００５７±０．０００７
０．００５６±０．０００５
０．０１７４±０．００１３＊
０．０２０８±０．００１５
０．０１９２±０．００１５
０．０１９４±０．００１４
０．０１９４±０．００１７
２．２　白凤菜醇提物对酒精性脂肪肝斑马鱼血清
功能的影响
　　模型斑马鱼血清 ＡＬＴ、ＡＳＴ活性、ＴＧ水平
均显著升高，ＴＣ水平无明显变化；与模型组对
比，白凤菜醇提物各组别血清 ＡＬＴ、ＡＳＴ活性，
ＴＣ、ＴＧ水平均有下降趋势，见表３．由表４可以
看出，与正常组相比，斑马鱼 ＳＯＤ 含量降低，
ＭＤＡ含量升高；与模型组对比，白凤菜醇提物各
组别ＳＯＤ含量呈升高趋势，ＭＤＡ 水平呈下降
趋势．
表３　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼血清
ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＴＣ，ＴＧ的影响 （ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别 ＡＬＴ／（Ｕ／Ｌ） ＡＳＴ／（Ｕ／Ｌ） ＴＣ／（ｍｍｏｌ／ｌ） ＴＧ／（ｍｍｏｌ／ｌ）
对照组
模型组
白凤菜高浓度组
白凤菜中浓度组
白凤菜低浓度组
９６．７０±２６．９２＊
１７６．０７±１６．９５
１３４．６７±１１．５３＊
１５５．３１±１７．１１
１２１．２±２０．８１＊
４１２．３０±２２．２６＊
５４０．７３±３５．１５
４２１．６７±２０．３２＊
４３４．１０±２７．２１＊
４９４．５７±２９．７０
４．６３±０．４３
３．７５±０．３８
３．７９±０．３１
３．５３±０．６０
３．９６±０．４７
１．２５±０．２８＊＊
２．８８±０．３４
１．７４±０．３９＊
１．９５±０．３８＊
１．９９±０．２２＊
注：Ｐ＊＜０．０５，Ｐ＊＊＜０．０１，下同．
表４　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼血清及肝组织
ＳＯＤ、ＭＤＡ影响（ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别
ＳＯＤ　 ＭＤＡ
血清 肝脏 血清 肝脏
对照组
模型组
白凤菜高浓度组
白凤菜中浓度组
白凤菜低浓度组
１．２５±０．２７
０．７０±０．１４
０．９４±０．２１
０．８６±０．２６
０．８１±０．２０
０．９０±０．２１
０．６１±０．１６
０．７９±０．１２
０．８６±０．０９
０．６６±０．１８
９．０６±２．５０
１５．１９±３．２４
１２．０４±１．９６
１１．５９±２．７０
１１．８３±２．４９
８．５２±２．４９
１３．６９±２．１５
９．６２±２．５６
１０．６９±２．７０
１１．８５±２．２３
２．３　白凤菜醇提物对斑马鱼酒精肝炎性病理变
化的影响
　　正常组肝细胞排列整齐，细胞分界清，核圆，
位于细胞中央，胞质丰富；模型组肝小叶结构破
坏，肝板排列紊乱，肝细胞肿胀明显，呈气球样变
性，大泡性脂肪变性，小叶炎性浸润．白凤菜醇提
物组肝组织炎性及变性坏死明显改善，见图１．
图１　白凤菜对酒精肝斑马鱼肝组织炎性病理变化的影
响（ＨＥ染色ｘ４００）
２．４　白凤菜醇提物对斑马鱼幼鱼肝脏大小及卵
黄囊吸收的影响
　　模型组斑马鱼幼鱼经过２．０％的酒精处理
３２ｈ后，体形出现畸形，主要表现在脊柱弯曲，心
包水肿，卵黄囊水肿以及鱼鳔畸形等．体视显微镜
放大倍数拍照观察到斑马鱼幼鱼肝脏出现肿大，
正常对照组的斑马鱼幼鱼肝脏呈月牙形，酒精处
理组的斑马鱼幼鱼肝脏呈现圆形，同时伴随卵黄
囊吸收变慢的情况，这与肝脏功能变差密切相关，
按照表形严重程度分成正常、一般严重、严重三种
情况，对各组进行分类统计．可以观察到白凤菜醇
提物能够明显改善上述情况，见图２．
图２　白凤菜醇提物对斑马鱼幼鱼肝脏大小
及卵黄囊吸收的影响
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２０１６年第１期 牡丹江师范学院学报（自然科学版） Ｎｏ．１，２０１６
（总第９４期） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ　９４
２．５　白凤菜醇提物对斑马鱼幼鱼脂肪含量的影响
模型组斑马鱼幼鱼肝脏组织发生脂肪变性
后，肝脏变大，肝脏染色明显加深，按照染色深浅
程度分成正常、一般严重、严重三种情况对各组进
行分类统计．可以观察到白凤菜能够明显缓解斑
马鱼幼鱼对酒精吸收形成的脂肪沉积，见图３．
图３　白凤菜醇提物对斑马鱼幼鱼整体油红染色脂肪
含量的影响
２．６　斑马鱼幼鱼谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨
酶（ＡＳＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力和丙二醛
（ＭＤＡ）含量测定
　　模型组斑马鱼幼鱼较对照组 ＡＬＴ，ＡＳＴ，
ＳＯＤ活性出现显著性下降（Ｐ＜０．０１），ＭＤＡ出
现了显著性上升（Ｐ＜０．０１），白凤菜醇提物能够
使酒精肝斑马鱼ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＳＯＤ活性呈上升趋
势，ＭＤＡ水平呈下降趋势（Ｐ＜０．０５）．
表５　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼幼鱼匀浆
ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＳＯＤ，ＭＤＡ的影响 （ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组别 ＡＬＴ／（Ｕ／Ｌ） ＡＳＴ／（Ｕ／Ｌ） ＳＯＤ／（ｍｍｏｌ／ｌ） ＭＤＡ／（ｍｍｏｌ／ｌ）
对照组
模型组
白凤菜高浓度组
白凤菜中浓度组
白凤菜低浓度组
６５．７０±８．２５＊＊
３３．２３±４．８３
５１．２７±１．２８＊
５４．８３±７．８３＊
４０．１７±８．６２
５９７．５７±２０．３４＊＊
３０２．４３±３１．７２
４３５．２±２８．１７＊
３４４．２±２４．９１
３５４．３±２３．５４
７８．６３±４．４０＊＊
４７．９±５．９８
５９．５３±４．２０
５７．３７±４．４８
５９．４±７．２６
１．３９±０．２９＊＊
３．８９±０．４９
３．１７±０．３４
２．９６±０．２１
２．７４±０．２０＊
２．７　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼脂肪、胆固醇
代谢相关基因表达的影响
　　模型组斑马鱼幼鱼能够使脂肪代谢 ＡＣＣ１，
Ｆａｄｓ，Ｆａｓｎ以及胆固醇代谢基因 Ｈｍｇｃｒａ，
Ｈｍｇｃｒｂ，Ｈｍｇｃｒｓ相关基因表达上调，使酒精肝
斑马鱼脂肪代谢以及胆固醇代谢相关基因呈下调
趋势．见图４．
图４　白凤菜醇提物对酒精肝斑马鱼脂肪、胆固醇代谢
相关基因表达的影响
３　讨论
实验采用酒精诱导斑马鱼成鱼和斑马鱼幼鱼
酒精性脂肪肝模型，以白凤菜醇提物作为治疗用
药，观察白凤菜对酒精肝的治疗作用．斑马鱼成鱼
实验结果表明，白凤菜能降低脂肪肝斑马鱼血清
ＡＬＴ，ＡＳＴ和 ＭＤＡ的活性，升高ＳＯＤ水平，改
善肝脏脂肪变性从而减轻肝脏炎症程度；斑马鱼
幼鱼实验表明，白凤菜能够有效改善酒精肝斑马
鱼的脂肪堆积，提高酒精肝幼鱼整体匀浆的
ＡＬＴ，ＡＳＴ和ＳＯＤ的活性，降低 ＭＤＡ含量；分
子生物学相关基因表达表明，白凤菜醇提物能够
有效的抑制脂肪、胆固醇基因的表达，证实白凤菜
具有良好的治疗酒精肝疾病的作用，为该药的临
床应用和进一步研发提供药理学基础，也为进一
步对酒精性脂肪肝防治和发病机制的研究奠定实
验基础．
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［９］Ｌｉｅｂｅｒ　Ｃ　Ｓ．Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ：ｉｔｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｌｃｏｈｏｌ，２００４，３４
（１）：９－１９．
［１０］王詝．脉胞菌ｈＨ３ｖ基因的初步研究及原核表达载体构建［Ｊ］．牡丹江师范学院学报：自然科学版，２００９（４）：２３－２５．
编辑：琳莉
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２０１６年第１期 牡丹江师范学院学报（自然科学版） Ｎｏ．１，２０１６
（总第９４期） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ　９４