全 文 ：收稿日期:2009-12-31
作者简介:熊丽(1983-),女(汉族), 江西南昌人 ,助理馆员 , 硕士研究生 , Tel.024-23986188, E-mailxionglibb@163.
com;陈晓辉(1954-), 女(汉族),辽宁沈阳人 , 教授 ,主要从事体内药物分析和质量控制的研究 , Tel.024-23986259,
E-mailcxh-syphu@yahoo.com.cn。
文章编号:1006-2858(2010)08-0639-04
RP-HPLC法同时测定田基黄中
4种黄酮成分的含量
熊　丽 1 , 陈晓辉2 , 梁　健 2
(1.沈阳药科大学 图书馆 , 辽宁 沈阳 110016;2.沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立同时测定田基黄中 4种黄酮(异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮
素)含量的 RP-HPLC法 。方法 采用 ZorbaxSBC18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),以乙腈-体积
分数为 0.5%的乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱 , 检测波长为 360 nm,流速为 1.0mL·min-1 , 柱温
为 35 ℃。结果 异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素质量浓度分别在 6.09 ～
203.00、18.93 ～ 631.00、1.89 ～ 63.00、 4.11 ～ 137.00 mg·L-1内与峰面积线性关系良好 , 4种黄酮
低 、中 、高的回收率为 97.5% ～ 102.6%, RSD均小于 3%。结论 RP-HPLC法可作为田基黄质量控
制的一个有效方法。
关键词:黄酮;田基黄;反相高效液相色谱法
中图分类号:R917　　　文献标志码:A
　　田基黄(HerbaHypericiJaponici)为藤黄科金
丝桃属植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.)
的干燥全草 ,始载于《生草药性备要》、《植物名实
图考》[ 1] 。具有清热利湿 、散瘀止痛的作用 。现
代药理研究表明田基黄具有抑菌 、保肝 、抑制肿瘤
细胞 、增强免疫等多种功效[ 2-4] 。其注射液在临
床用于治疗急 、慢性肝炎 ,传染性肝炎 ,原发性肝
癌等。田基黄中主要含有黄酮类 、吨酮类 、间苯三
酚类衍生物等化学成分。文献 [ 5]报道田基黄中
3个黄酮类化合物异槲皮苷 、槲皮苷和槲皮素-7-
O-鼠李糖苷具有保肝退黄作用 。鉴于黄酮类成分
是田基黄药材发挥药理作用的主要活性部位 ,文
献 [ 6]报道采用高效液相色谱法测定田基黄药材
中槲皮素的含量 ,文献 [ 7]报道采用高效液相色
谱法同时测定田基黄药材中槲皮苷和异槲皮苷的
含量。但对于多种黄酮类成分同时含量测定未见
报道。因此本文作者以异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮
素 -7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素(结构式见图 1)此
4种黄酮为指标性成分 ,采用 RP-HPLC法对其进
行同时含量测定 ,为田基黄药材的质量控制提供
了可靠的实验依据。实验结果表明该方法准确 、
快速 、专属性强。
Fig.1　Thestructuresofisoquercitrin(a), quercitrin(b), quercetin-7-O-α-L-rhamnoside(c)andquercetin(d)
1　仪器与材料
ShimadzuLC-2010A高效液相色谱仪 (日本
Shimadzu公司),超声清洗器(浙江象山县石浦海
天电子仪器厂), AB135-S型天平(瑞士 Metler-
Toledo公司)。
异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷
和槲皮素对照品(自制 ,经 HPLC面积归一化法测
第 27卷 第 8期
2 0 1 0 年 8 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.27 　No.8
Aug.2010 p.639
定 , 4种成分的纯度质量分数均大于 98.5%),甲
醇 、乙腈(色谱纯 ,山东禹王实业有限公司),无水
乙醇(分析纯 ,天津市大茂化学试剂厂),醋酸(色
谱纯 ,天津科密欧化学试剂开发中心),水(二次
重蒸水 ,自制)。
田基黄药材购自沈阳南塔大药房 ,经沈阳药
科大学中药学院孙启时教授鉴定为田基黄(Hype-
ricumjaponicumThunb.)。样品经粉碎机粉碎 ,过
830μm筛 ,置于广口瓶中密闭保存 。
2　方法与结果
2.1　色谱条件选择
色谱柱:ZorbaxSB-C18(250mm×4.6 mm, 5
μm);流动相:乙腈 -体积分数为 0.5%的乙酸溶
液 ,二元线性梯度洗脱 ,梯度程序见表 1;检测波
长:360 nm;柱温:35 ℃;流速:1.0 mL·min-1;进
样量:10μL。
Table1　Mobilephasegradientsystem
t/min φ(acetontrile)/% φ[ φ(aqueousaceticacid)=0.5%] /%
0 12 88
20 12 88
35 30 70
45 30 70
2.2　系统适用性试验
取供试品溶液按上述色谱条件进样 , 4种黄
酮各组分色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于
1.5,对称因子均在 0.95 ～ 1.05之间 ,理论塔板数
均不低于 5 000。
2.3　溶液制备
对照品储备液制备:精密称取减压干燥至恒
定质量的异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素 -7-O-α-L-鼠
李糖苷和槲皮素对照品适量于 25 mL量瓶中 ,
加甲醇溶解并稀释至刻度 ,制成异槲皮苷 、槲皮
苷 、槲皮素 -7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素质量浓度
分别为 0.406、1.262、 0.126、0.274 g·L-1的混
合对照品储备液。精密量取对照品储备液
2.5 mL,置 5 mL量瓶中 ,加甲醇至刻度 , 摇匀 ,
作为对照品溶液 。
供试品溶液制备:取田基黄细粉约 1.0 g,精
密称定 ,精密加体积分数为 60%的乙醇 40 mL于
圆底烧瓶中 ,称重 ,回流提取 1h,放冷 ,再称重 ,用
体积分数为 60%的乙醇补足损失的重量 ,摇匀 ,
经 0.45μm微孔滤膜过滤 ,取续滤液 ,即得 。
2.4　线性关系考察
取混合对照品溶液 0.15、 0.30、 0.60、 1.30、
2.50、5.00mL,分别置 10mL的量瓶中 ,加入甲醇
至刻度 ,分别精密吸取配好的对照品系列溶液 10
μL进样分析 ,以对照品峰面积(A)为纵坐标 ,质
量浓度(ρ/mg·L-1)为横坐标 ,进行线性回归 ,结
果表明异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖
苷和槲皮素质量浓度分别在 6.09 ～ 203.00、
18.93 ～ 631.00、 1.89 ～ 63.00和 4.11 ～ 137.00
mg·L-1内与峰面积线性关系良好 ,回归方程分别
为 A=1.96×104ρ-1.01×104 , r=0.999 9(n=
6)、A=1.75×104ρ-4.99×104 , r=0.999 8(n=
6)、A=3.01×104ρ-0.227×104 , r=0.999 9(n=
6)和 A=3.96×104ρ-0.601×104 , r=0.999 8(n
=6)。
2.5　精密度试验
精密吸取异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-
鼠李糖苷和槲皮素质量浓度分别为 24.36、
75.72、 7.56和 16.44 mg· L-1的对照品溶液
10 μL,连续重复进样 6次 ,异槲皮苷 、槲皮苷 、槲
皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素峰面积 RSD分
别为 1.5%、1.5%、1.3%、1.5%(n=6)。
2.6　重复性试验
精密称取同一批样品(安徽芜湖产地),共 6
份 ,按 “ 2.3”条方法操作 , 在上述色谱条件下进
样 ,异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷
和槲皮素峰面积 RSD分别为 0.8%、 1.9%、
1.6%、2.4%(n=6)。
2.7　稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液 (安徽芜湖产地)
各 10μL,分别在 0、2、4、8、12、24 h进样分析 ,异
槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮
素峰面积 RSD分别为 0.9%, 1.6%、1.1%、1.6%
(n=6)。表明样品在 24 h内稳定性良好。
2.8　加样回收试验
精密称取已知含量的田基黄药材(安徽芜湖
产地)9份 ,每份 0.5 g,每 3份为一组 ,每组分别
精密加入异槲皮苷对照品溶液 (质量浓度为
640 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷　
1.04g·L-1)0.5、1.0、1.5 mL;槲皮苷对照品溶液
(质量浓度为 2.890 g·L-1)0.5、1.0、1.5 mL;槲
皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷对照品溶液(质量浓度为
0.184g·L-1)0.5、1.0、1.5 mL;槲皮素对照品溶
液(质量浓度为 0.590 g·L-1)0.5、1.0、1.5 mL,
常压下挥干溶剂 ,按 “ 2.3”条操作制成供试品溶
液 ,在上述色谱条件下进样分析 ,计算回收率 ,结
果见表 2。
Table2　Recoveriesofthefourflavoindsinsample(n=3)
Compound msample/mg madded/mg mfound/mg Recovery/% x/% RSD/%
Isoquercitrin 1.046 0.520 1.027 97.5
1.046 1.040 1.566 100.3 99.6 1.3
1.046 1.560 2.097 100.9
Quercitrin 2.885 1.445 2.925 102.6
2.885 2.890 4.389 102.0 102.1 0.7
2.885 4.335 5.856 101.8
Quercetin-7-O-α-L-rhamnoside 0.184 0.092 0.182 97.8
0.184 0.184 0.275 99.5 98.3 0.9
0.184 0.276 0.361 97.5
Quercetin 0.586 0.295 0.589 100.3
0.586 0.590 0.881 99.7 100.2 1.1
0.586 0.885 1.184 100.7
2.9　样品测定
取收集的不同产地的田基黄药材粉末各约
1.0g,精密称定 ,按 “供试品溶液制备”方法操作 ,
在上述色谱条件下进行 HPLC分析 ,结果见表 3,
代表性色谱图见图 2。
Table3　Contentsofthefourflavonoidsindifferentsamples(n=3)
No. Origin w(isoquercitrin)/%
w(quercitrin)
/%
w(quercetin-7-O-α-L-
rhamnoside)/%
w(quercetin)
/%
1 Wuhu, Anhui 0.209 1 0.577 0 0.036 8 0.117 2
2 Nanchang, Jiangxi 0.130 5 0.281 2 0.039 3 0.084 9
3 Chengdu, Sichuan 0.188 5 0.479 4 0.041 1 0.080 5
4 Yueyang, Hunan 0.142 9 0.510 7 0.037 7 0.035 0
5 Hangzhou, Zhejiang 0.177 3 0.398 7 0.025 7 0.122 1
6 Jiujiang, Jiangxi 0.256 9 0.403 7 0.021 5 0.043 0
7 Luo′an, Jiangxi 0.299 6 0.573 2 0.018 4 0.115 0
8 Kaifeng, Henan 0.174 8 0.378 3 0.023 9 0.040 9
9 Fuzhou, Fujian 0.104 7 0.306 9 0.019 0 0.048 5
10 Xiaogan, Hubei 0.185 2 0.412 5 0.025 8 0.065 4
11 Yulin, Guangxi 0.202 7 0.432 9 0.028 6 0.059 0
12 Chongqing 0.066 5 0.246 0 0.012 3 0.032 0
13 Ningbo, Zhejiang 0.147 7 0.421 3 0.022 4 0.079 4
14 Qinxi, Guangxi 0.155 1 0.516 9 0.018 9 0.031 5
15 Nanning, Guangxi 0.181 3 0.383 6 0.032 3 0.066 5
16 Nantong, Jiangsu 0.256 1 0.558 4 0.030 7 0.012 3
641第 8期 熊　丽等:RP-HPLC法同时测定田基黄中 4种黄酮成分的含量
1—Isoquercitrin;2—Quercitrin;3—Quercetin-7-O-α-L-rhamnoside;4—Quercetin
Fig.2　Chromatogramsofreferencesubstances(a)andsample(b)
3　讨论
a.提取方法与溶剂的选择:以体积分数为
60%的乙醇为提取溶剂 ,分别考察了超声波振荡
与加热回流提取方法 ,比较其含量 。结果显示 , 4
种成分的提取回收率均较高 ,对含量较小的槲皮
素 -7-O-α-L-鼠李糖苷加热回流提取法优于超声波
振荡法 ,故选择加热回流法 。采用加热回流法 ,分
别考察了体积分数分别为 40%、60%、80%、95%
的乙醇和体积分数为 60%的甲醇为提取溶剂时各
指标成分的提取效率 ,发现以体积分数为 60%的
乙醇为提取溶剂时各指标成分的提取效率较高 ,且
提取物中干扰峰较少 ,色谱分离效果较好 ,故采用
体积分数为 60%的乙醇为提取溶剂。
　　b.RP-HPLC法测定中药材中多种黄酮类成
分的文献报道较多[ 8-10] ,作者在文献 [ 8-10]的
基础上 ,根据具体情况 ,对色谱条件进行了优化。
分别取各对照品适量并溶于甲醇 , 用岛津 UV-
265FW型分光光度仪绘制紫外吸收光谱 ,发现在
250nm以及 360 nm附近 4种黄酮均有较强吸
收 ,由于在 360 nm处检测时样品中其它成分的干
扰较小 ,故选择 360 nm作为检测波长。考察了不
同的反相色谱柱(HypersilC18、KromasilC18和 Zor-
baxC18柱),发现在 ZorbaxC18柱上 ,峰形和分离度
均较好。在 ZorbaxC18柱上比较了乙腈-0.02 mol
·L-1磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调 pH为 3.0)和
乙腈-体积分数为 0.5%的乙酸溶液 2种洗脱系统
对指标成分的分离效果 ,发现后者与前者分离效
果相近 , 为简化操作 , 故选择乙腈 -体积分数为
0.5%的乙酸溶液洗脱系统。并采用梯度洗脱以
提高分离效果 ,缩短分析时间 ,在 45 min内能完
成 1次分离操作 , 每次分析结束后平衡流动相
10 min。
c.实验结果表明田基黄药材中所含黄酮类
成分以槲皮苷和异槲皮苷为主 ,在所收集的 16个
产地的药材中 ,各黄酮含量存在较大的差异 ,其中
安徽芜湖产地药材中各黄酮含量均较高 ,可能是
由气候 、生长环境 、采收期和储藏方法等不同引起
的 。
参考文献:
[ 1] 肖培根.新编中药志:第三卷 [ M] .北京:化学工业
出版社 , 2001:90.
[ 2] 李沛波 ,唐西 , 杨立伟 , 等.田基黄对大鼠急性肝损
伤的保护作用 [ J] .中草药 , 2006, 9(1):55-56.
[ 3] 金辉喜 ,李金荣.田基黄对人舌癌细胞株 TSCCa细
胞毒作用的研究 [ J] .临床口腔医学杂志 , 1997, 13
(1):19-20.
[ 4] 周小玲 ,柯美珍 , 宋志军.田基黄对大鼠呼吸道及全
身免疫功能的影响 [ J] .广西医科大学学报 , 2001,
18(2):211-222.
[ 5] 李沛波 ,王永刚 , 吴钉红 , 等.田基黄中三个黄酮类
化合物保肝退黄作用的试验研究 [ J] .中山大学学
报(医学科学版), 2007, 28(1):40-43.
[ 6] 田刚 ,彭国平.高效液相色谱法测定地耳草中槲皮
素的含量 [ J] .中国中药杂志 , 2004, 29(5):476 -
478.
[ 7] 彭维 ,吴钉红 , 杨立伟 , 等.田基黄药材的质量研究
[ J] .中南药学 , 2006, 4(5):340-342.
[ 8] 张园园 ,陈晓辉 , 孙艳艳 , 等.反相高效液相色谱法
测定普通鹿蹄草中的黄酮苷类成分 [ J] .色谱 ,
2007, 25(3):367-370.
[ 9] 王晓辉 ,刘涛 , 李清 , 等.高效液相色谱法同时测定
黄芪中的五种异黄酮成分 [ J] .色谱 , 2006, 24(5):
486-488.
[ 10] 王晓英 , 原红霞 , 赵云丽 , 等.RP-HPLC法同时测定
地锦草片中 3种黄酮苷元的含量 [ J] .沈阳药科大
学学报 , 2007, 24(9):564-567.
(下转至第 668页)
642 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷　
Abstract:ObjectiveToevaluatethemechanismthatbacteriagrowinginbiofilmalwaysresisttoantimicro-
bialagents, andinvestigatetheefectofazithromycinontheAmpCandESBLsproducedinthebiofilm.
MethodsModelofEscherichiacolibacterialbiofilmwasbuiltupwiththemodifiedflat-boardmethodandi-
dentifiedwithconfocalscanninglasermicroscopy.ESBLsandAmpCweredetectedbyimprovedthreedi-
mensionaltest.ResultsThedetectionratesofAmpC, ESBLsandAmpC+ESBLsinisolatedEscherichiacoli
(groupA)were5.0%(2 /40), 20.0%(8/40), 5.0%(2 /40), respectively;ThedetectionratesofAmpC,
ESBLsandAmpC+ESBLsinBFEscherichiacoli(groupB)were15.0%(6/40), 47.5%(19 /40), 22.5%
(9/40), respectively;ThedetectionratesofAmpC, ESBLsandAmpC+ESBLsinBFEscherichiacolitrea-
tedwithazithromycin(groupC)were7.5%(3/40), 25%(10/40), 12.5%(5 /40), respectively.Conclu-
sionsAzithromycincaninhibittheformationoftheAmpCandESBLsproducedinthebiofilm.
Keywords:Escherichiacoli;biofilm;ESBLs;AmpCenzyme;azithromycin
(上接第 642页)
Simultaneousdeterminationofcontentsoffourfla-
vonoidsinHerbaHypericiJaponicibyRP-HPLC
XIONGLi1 , CHENXiao-hui2 , LIANGJian2
(1.Library, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;2.SchoolofPharmacy, Sheny-
angPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China)
Abstract:ObjectiveTodevelopareversed-phasehighperformanceliquidchromatographicmethod(RP-
HPLC)forsimultaneousdeterminationoffourflavonoids, includingisoquercitrin, quercitrin, quercetin-7-O-
α-L-rhamnosideandquercetininHerbaHypericiJaponici.MethodsTheseparationwasperformedonanAg-
ilentZorbaxSB-C18 column(250 mm ×4.6 mm, 5 μm)withthemobilephaseconsistingofacetontrile-
0.5%(φ)aqueousaceticacidwithgradientelutionmodeattheflowrateof1.0 mL·min-1.Thedetection
wavelengthwassetat360 nmandthecolumntemperaturewassetat35 ℃.ResultsAlanalytesshowed
goodlinearitywithintherangesandtherecoverieswere97.5%-102.6%.Satisfactoryprecisionswereob-
tainedwithrelativestandarddeviationslessthan3%.ConclusionsThemethodissimple, accurateandrepro-
ducible, itcanbeusedforthequalitycontrolofHerbaHypericiJaponici
Keywords:flavonoid;HerbaHypericiJaponici;RP-HPLC
668 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 27卷