全 文 ：华西药学杂志
W C J·P S 2013，28(2)∶156 ～ 159
作者简介:郭凤霞(1970—) ，女，副主任药剂师，硕士，从事药用植物资源的开发和研究工作。Email:winddown_gfx72@ 163． com
丝毛飞廉总黄酮对小鼠肝损伤中氧化应激介质生成的影响
郭凤霞1，2，曾 阳1，2，陈振宁1，路 朋1
(1．青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁 810008;2．青藏高原环境与资源教育部重点实验室，青海 西宁 810008)
摘要:目的 研究丝毛飞廉总黄酮(FGC)对绵羊红细胞(SRBC)诱发迟发型变态反应致小鼠肝损伤中氧化应激介质生成的
影响。方法 预给予小鼠不同剂量的 FGC(14、28、56 g·kg －1) ，连续 ig 7 d，第 7 日 ip SRBC(红细胞个数为 1． 0 × 109·mL －1，剂
量为 10 mL·kg －1)致敏，12 d后用 SRBC再次致敏，22 d后用 SRBC 肝穿刺攻击，诱发免疫性肝损伤，24 h 后测定小鼠脏器指
数，紫外分光光度法测定血清转氨酶(ALT、AST)水平，氧化应激介质丙二醛(MDA)的含量及小鼠肝微粒体中超氧化物歧化酶
(SOD)活性，单细胞凝胶电泳法检测肝细胞中 DNA氧化损伤水平。结果 模型组脏器指数及血清 ALT、AST与空白组比较均
有显著性差异(P ＜ 0． 05) ，表明 SRBC诱发迟发型变态反应致小鼠肝损伤实验模型建立成功;FGC预给药组与造模组比较，小
鼠脏器指数、血清中 AST、ALT水平、SOD活性、MDA含量及彗星扫尾细胞的百分率均有显著性差异(P ＜ 0. 05)。结论 预先
给予 FGC(14、28、56 g·kg －1)可使 SRBC诱发迟发型变态反应致小鼠肝损伤肝损伤中氧化应激反应减轻，并可显著降低肝细
胞核 DNA单链断裂氧化损伤水平，对免疫性肝损伤有保护作用。
关键词:丝毛飞廉总黄酮;绵羊红细胞;免疫性肝损伤;DNA氧化性损伤
中图分类号:R96 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2013)02 － 0156 － 04
Effect of general flavonoids from Garduus crispus on the late allergy in SRBC induced acute
liver injury modle
GUO Feng － xia1，2，ZENG Yang1，2，CHEN Zhen － ning1，LU Peng1
(1． Biological and Geographical Science College，Qinghai Normal University，Xining，Qinghai，810008 P． R． China;2． Key Laboratory
of Environment and Resources of Qinghai － Tibet Plateau，National Education Ministry，Xining，Qinghai，810008 P． R． China)
Abstract:OBJECTIVE To investigate the effect of general flavonoids from Garduus crispus L． (FGC)on generation of oxidative
stress medium in mice liver injury caused by delayed allergy induced by SRBC．METHODS The mice were successively administered
with different doses(14，28，56 g·kg －1)of FGC by ig method for 7 days，sensitized by intraperitoneal injection of SRBC(the number of
red cells is 1． 0 × 109·mL －1，dosage is 10 mL·kg －1)after 7 days，and re － sensitized by SRBC after 12 days． After 22 days，the mice
received liver puncture by SRBC (10 mL·kg －1) ，inducing the Immunological liver injury． After 24 hours，the indices of mice’s viscera
were measured;Ultraviolet spectrophotometry was used to measure the level of ALT and AST，the content of MDA and the activity of
SOD in mouse liver microsomes;Single cell gel electropheresis(SCGE)was used to detect DNA oxidative damage in the liver cells．
RESULTS The obvious difference between model group and blank group existed in the indices of viscera as well as ALT and AST in
serums(P ＜ 0． 05) ，showing the successful setting up of experimental model of mice liver injury caused by delayed allergy induced by
SRBC;the obvious difference between FGC － administered group and model group were shown in the indices of viscera，the level of
ALT and AST in serums，the activity of SOD，the content of MDA and the percentage of DNA cell injury(P ＜ 0． 05)． CONCLUSION
Beforehand administration of FGC(14，28，56 g·kg －1)may reduce oxidative stress response in the mice liver injury caused by
delayed allergy induced by SRBC，and obviously lowers oxidative injury of DNA’s single － cell standard broken in liver cell and pro-
duces a good protective effect on the immunological livery injury．
Key words:General flavonoids from Garduus crispus L．;SRBC;Immunological liver injury;DNA’s oxidative injury
CLC number:R96 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2013)02 － 0156 － 04
菊科飞廉属植物丝毛飞廉 Carduus crispus L．为
二年生草本植物，遍布中国，是常用中药。西藏以同
属植物利刺飞廉 Carduus acanthoides L． 作飞廉入
药，具有祛风、清热、利湿、凉血散淤之功效［1］。已
从丝毛飞廉植物中分离出 5，7，4’－ 三羟基 － 黄
酮 － 3 －鼠李糖甙、7，4’－二羟基 － 5 －黄酮和 5，8，
3’，4’－四羟基 －黄酮［2］。黄酮类化合物是很强的
活性氧自由基清除剂。现采用乙醇提取法从丝毛飞
廉种子中提取出有效组分丝毛飞廉总黄酮(FGC)
(初步鉴定均含上述 3 种黄酮类化合物) ，以小鼠绵
羊红细胞(SRBC)诱发迟发型变态反应致肝损伤模
型为对象，考察 FGC 对 SRBC 诱发迟发型变态反应
致氧化应激介质生成及对肝细胞 DNA 链氧化断裂
水平的影响，探讨其可能的作用机制。
DOI:10.13375/j.cnki.wcjps.2013.02.013
1 实验部分
1． 1 试药与动物
丝毛飞廉总黄酮(FGC，自制［3］，临用时加蒸馏
水配制，给药剂量相当于总黄酮含量分别为 56、28、
14 g·kg －1，于 4 ℃下保存) ;联苯双酯滴丸(德州德
药制药有限公司，批号:090505，每丸 1． 5 mg) ;超氧
化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(批号:20090526)、
丙二醛(MDA)检测试剂盒(批号:20090526)、丙氨
酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号:20090526)、天
门冬氨酸氨基转移酶 (AST)试剂盒 (批号:
20090526) (南京建成生物工程研究所)。6 ～ 8 周龄
昆明种小鼠(青海省地方病研究所，许可证:青医动
字第 01 号)60 只，♀♂兼用，体重 20 ± 2 g，实验前
正常分笼喂养一周，以适应实验室环境。
1． 2 方法与结果
1． 2． 1 FGC的提取［4］ 用乙醇提取法提取。精确
称取 1． 1 kg烘干粉碎后的丝毛飞廉种子，加入 6 倍
量的 95%乙醇，置恒温震荡器加热震荡提取 3 h，抽
虑，滤渣再加入 6 倍量的 95%乙醇提取，连续 3 ～ 4
次，合并滤液，弃药渣，将所得虑液减压回流分离出
酒精至无醇味，再将所得的浓缩液用乙酸乙酯萃取
2 ～ 3 次，得乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，蒸干浸
液得到浅黄色松散粉末，再用 3 倍量的石油醚浸提
24 h，过滤，干燥，得到 14． 60 g FGC。
1． 2． 2 绵羊红细胞的制备 选择母绵羊颈静脉无
菌采血。将 40 mL 血与 60 mL 阿氏液混匀，冷藏备
用。将 10 mL阿氏液保存的绵羊血通过纱布过滤倒
入 40 mL刻度离心管中，另加 30 mL 巴比妥缓冲液
(VBS) ，混匀，于 3 × 103 r·min －1离心 10 min。吸弃
上清液，加 VBS至原来的量，再次离心，如此离心洗
涤 3 次，吸弃上清液。每管约加 10 mL VBS，混匀。
将悬液倒入 15 mL 的离心管中，于 3 × 103 r·min －1
离心 10 min，采用血球计数板将红细胞配成1 × 109·
mL －1，于 4 ～ 8 ℃冰箱中保存。
1． 2． 3 细胞免疫性肝损伤模型的制备 小鼠经 ip
10 mL·kg －1 SRBC(含 10 × 109 个红细胞)致敏，5 d
后 ip 10 mL·kg －1 SRBC 再次致敏，10 d 后用 SRBC
10 mL·kg －1肝穿刺攻击［6］造模。空白组给予同体积
的生理盐水。
1． 2． 4 小鼠的分组及给药 将 60 只小鼠随机均分
为对照组、模型组、联苯双酯组及高、中、低 FGC 剂
量组。实验期间小鼠均正常饮水、饮食。FGC 各组
分别 ig 14、28、56 g·kg －1 FGC，qd;对照组和模型组
给予同体积的生理盐水;联苯双酯组给予 150 mg·
kg －1联苯双酯。第 7 日，用 SRBC 按小鼠体重
10 mL·kg －1致敏，对照组 ip 生理盐水 10 mL·kg －1，
12 d后再次用 SRBC10 mL·kg －1 ip 致敏，第 22 日后
用 SRBC10 mL·kg －1肝穿刺攻击。
1． 2． 5 DNA氧化性损伤的测定［5 － 6］ 将肝脏置于
Hanks’液中，研磨制备成单个细胞悬液，用 Hanks’
液稀释 10 倍，置 37 ℃水浴中待用。另设阳性对照
组，在正常肝细胞悬液中，加入 40 nmol·mL －1重铬
酸钾，于 37 ℃水浴 30 min。0. 5%普通熔点琼脂糖
于 56 ℃水浴中保温 1． 5 h后，取 35 μL琼脂糖铺于
磨砂载玻片上，于 4 ℃下冷凝形成底胶;再取 130
μL上述琼脂糖加在底胶上，于 4 ℃冷凝 10 min 形
成第 1 层胶;另取 37 ℃水浴中保温的 1% 低熔点琼
脂糖与细胞悬液吹打混匀，取 100 μL 混匀液铺片，
于 4 ℃下冷凝 10 min形成第 2 层胶;另取 70 μL于
37 ℃水浴中保温的 0． 5% 低熔点琼脂糖铺片，于
4 ℃下冷凝 10 min形成第 3 层胶。将制备好的胶板
浸入细胞裂解液，于 4 ℃裂解 50 min 后，置电泳槽
中，加入电泳液于 4 ℃解旋 20 min;4 ℃电泳 20 min
(25 V，300 mA) ;电泳结束后，加入中和液，并中和
2 次。每片胶板滴入 2 滴碘化丙碇(PI) ，镜下观察
细胞形态变化(10 × 10、10 × 20) ，并计数 100 个细
胞核，计算其中的彗星发生率。
1． 2． 6 标本采集及处理 肝穿刺攻击 24 h 后进行
称重，眼眶采血，脱颈处死小鼠，并摘取肝脏、脾脏、
胸腺快速称重，计算脏器指数(每 10 g 体重的肝脏
毫克数)。分离血清，按试剂盒说明书测定 ALT、
AST指标。取部分肝组织，用冷生理盐水漂洗后制
成 1%和 10%的肝匀浆，按照剂盒说明书测定肝匀
浆 MDA 含量和 SOD 活性，离心，取上清液，作单细
胞凝胶电泳实验。其余肝脏样本于 － 80 ℃冻存。
1． 2． 7 对小鼠肝损伤脏器指数和血清指数的影响
表 1 表明:与对照组相比较，模型组小鼠的肝脏、
脾脏指数均显著升高(P ＜ 0． 05) ;与模型组比较，
FGC各给药预处理组能显著降低肝脏指数(P ＜
0. 05) ;胸腺指数与模型组比较，FGC 高剂量组有显
著性差异(P ＜ 0． 05) ;对于肾脏指数和脾脏指数，
FGC各剂量给药组与模型组比较，差异均无显著
性。血清转氨酶 ALT、AST水平的测定，目前被认为
是反映肝细胞损害程度的标准试验指标［5］，常用来
反应肝细胞功能和损伤的程度。模型组小鼠 ALT、
AST活性较对照组明显升高(P ＜ 0． 05) ，说明造模
成功;FGC 高、低剂量组血清 ALT、AST 含量均明显
低于模型组(P ＜ 0． 05) ;FGC 中剂量组的 ALT、AST
水平均未见变化。
751第 2 期 郭凤霞，等。丝毛飞廉总黄酮对小鼠肝损伤中氧化应激介质生成的影响
表 1 FGC对 SRBC诱发迟发型变态反应致肝损伤脏器指数和血清指数 ALT、AST的影响(珔x ± s，n =10)
Table 1 The effects of FGC on visceral index and ALT，AST in serum of liver injury by delayed allergy induced by SRBC(珔x ± s，n =10)
Groups Dose /g·kg －1 肝脏指数 /mg·g － 1 脾脏指数 /mg·g － 1 胸腺指数 /mg·g － 1 AST(OD) ALT(OD)
Control － 51． 73 ± 5． 59△ 4． 66 ± 1． 49 3． 08 ± 0． 69△ 0． 312 ± 0． 013△ 0． 405 ± 0． 040△
Model － 73． 21 ± 4． 62* 4． 63 ± 0． 95 2． 24 ± 0． 11* 0． 517 ± 0． 044* 0． 527 ± 0． 039*
Bifendate 0． 15 51． 28 ± 8． 98△ 4． 68 ± 1． 31 2． 78 ± 1． 00△ 0． 397 ± 0． 038△ 0． 415 ± 0． 036△
FGC 56 55． 78 ± 6． 46△ 4． 98 ± 0． 96 3． 86 ± 1． 29＊△ 0． 458 ± 0． 058△ 0． 442 ± 0． 034△
28 56． 36 ± 5． 71△ 4． 83 ± 0． 86 3． 46 ± 1． 16△ 0． 456 ± 0． 056△ 0． 391 ± 0． 035△
14 57． 49 ± 5． 58△ 4． 70 ± 0． 82 2． 10 ± 1． 35 0． 451 ± 0． 026△ 0． 433 ± 0． 036△
Compared with control group:* P ＜ 0． 05;compared with model group:△P ＜ 0． 05
1． 2． 8 对肝损伤小鼠肝组织中 SOD、MDA 含量和
肝细胞 DNA 氧化性损伤的影响 SOD 和 MDA 含
量是细胞氧化损伤的一个重要检测指标［6］。表 2 表
明:模型组小鼠肝组织中的 SOD含量与对照组小鼠
比较有显著降低(P ＜ 0． 05) ;模型组小鼠的 MDA含
量与对照组比较有显著升高(P ＜ 0． 05) ，说明造模
成功。与模型组比较，FGC高剂量组 SOD含量有极
显著升高(P ＜ 0． 01) ;与模型组比较，FGC 低剂量组
MDA 含量有极显著降低(P ＜ 0． 01)。单细胞凝胶
电泳实验可在单个细胞水平上检测 DNA 损伤和修
复，细胞彗星拖尾发生率的变化可近似反映肝脏细
胞 DNA 的损伤及修复状况。表 2 表明:模型阻与对
照组相比，肝细胞拖尾细胞百分率有显著增高，而
预先给予 FGC 56、28、14 g·kg －1可使拖尾细胞百分
率显著性降低。
表 2 FGC对 SRBC所致免疫性肝损伤组织中 SOD活性、MDA含量和肝细胞 DNA氧化性损伤的影响(珔x ± s，n =10)
Table 2 The effect of FGC on activities of SOD，contents of MDA and DNA oxidative injury in the mechanism of immunological liver injury
induced by SRBC(珔x ± s，n =10)
Groups Dose /g·kg －1 SOD /U·mg －1 MDA /nmol·mg －1 Tail DNA /%
Control － 127． 1 ± 6． 5△ 0． 96 ± 0． 09△ 14． 00 ± 7． 48
Model － 79． 8 ± 5． 3* 1． 61 ± 0． 03* 41． 95 ± 28． 28*
Bifendate 0． 15 100． 2 ± 6． 2＊△ 1． 11 ± 0． 06△ 6． 04 ± 2． 18
FGC 56 105． 9 ± 6． 7△△ 0． 92 ± 0． 02△△ 6． 01 ± 6． 07△△
28 93． 8 ± 5． 5△△ 1． 15 ± 0． 34△△ 7． 89 ± 8． 67△△
14 82． 7 ± 4． 0* 1． 46 ± 0． 05* 7． 98 ± 9． 78△△
Compared with control group:* P ＜ 0． 05;compared with model group:△P ＜ 0． 05，△△P ＜ 0． 01
1． 2． 9 数据统计处理 数据均用 珋x ± s 表示，采用
SPSS13． 0 统计软件包中的 ANOVA法进行单因素方
差分析处理，组间比较采用 t 检验处理，P ＜ 0． 05 认
为有显著性差异。
2 讨论
迟发型变态反应(DTH)是一种典型的细胞免
疫反应，以单核细胞和淋巴细胞等的浸润为特征的
炎症反应。为模拟临床肝炎的细胞免疫病理过程，
将 DTH反应导入肝脏，诱发肝内的炎症反应。此试
验利用绵羊红细胞(SRBC)肝脏内攻击造模，导致
肝脏局部炎症而诱发 DTH，继而造成肝损伤，此损
伤很可能与 TNF － α 和 IFN － γ 等细胞因子的作用
有关，同时推测其能破坏线粒体内膜上的呼吸链，
使得超氧化阴离子(O －2·)等活性氧簇(ROS)积聚，
与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生氧化反应，以共
价键结合蛋白质、核酸等，致细胞膜破裂、细胞核内
碱基发生羟基化、甲基化修饰，DNA突变甚至断裂，
导致细胞死亡，致使细胞内 ALT 等标志酶大量释
出。在文中实验中，模型组小鼠的脏器指数，血清
ALT、AST的含量，肝组织中 SOD、MDA 的含量相对
对照组都有显著差异，说明肝损伤造模成功;模型组
ALT、AST的含量显著上升，而肝匀浆氧化应激介质
MDA水平显著上升，抗氧化剂 SOD 活性显著下降，
提示机体内有氧化应激反应的发生。连续 7 d FGC
预处理后，肝匀浆中 SOD 活性在 FGC 高剂量组呈
现恢复上升趋势，同时，SRBC所致彗星细胞数量及
细胞核 DNA断裂片段显著减少，提示 FGC 具有一
定的抗氧化应激及对抗 DNA 单链断裂氧化损伤的
作用，此外，还说明 FGC 对绵羊红细胞诱发的迟发
型变态反应所致的免疫性肝损伤有较好的保护作
用。FGC中含有的 3 种黄酮均属于多酚类化合物，
其结构中含有的羟基向 ROS 提供氢后，自由基被
还原，柚皮素自身获得稳定结构，因此，可促成对
自由基的清除，保护细胞中的核酸、蛋白质、脂肪等
的正常形态和功能［7］。在氧化损伤 DNA 单链并使
有机过氧化物自由基断裂时，需要铁离子参与，而
黄酮类化合物则具有铁离子螯合剂的性质［8］;但
FGC在对抗 SRBC 免疫性肝损伤所致 DNA 氧化损
伤过程中的作用机制有待研究。
851 华 西 药 学 杂 志 第 28 卷
华西药学杂志
W C J·P S 2013，28(2)∶159 ～ 162
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收稿日期:2012 － 04 － 05
作者简介:白瑞霞，副主任药师，从事临床药学工作。
* 通信作者(Correspondent author) ，Email:wangxueqin2008@ 126． com
LC － MS /MS法同时测定人血浆中的辛伐他汀和辛伐他汀酸
白瑞霞1，杨东菁2*
(1．郑州市第一人民医院，河南 郑州 450000;2．河南大学医学院，河南 开封 475001)
摘要:目的 采用 LC － MS /MS法同时测定人血浆中的辛伐他汀和辛伐他汀酸。方法 采用 BEH C18色谱柱(50 mm × 2． 1
mm，1． 7 μm) ，流动相为乙腈 － 0． 01 mol·L －1醋酸铵(72∶28) ，流速 0． 15 mL·min －1，柱温 40 ℃，进样量 8 μL。辛伐他汀、辛伐
他汀酸及内标洛伐他汀的检测离子对分别为:m/z 419． 43→199． 12、437． 38→303． 26、405． 45→199． 14。结果 辛伐他汀、辛伐
他汀酸的线性范围分别为 0． 241 ～ 61． 76 ng·mL －1(r = 0． 999)、0． 344 ～ 88． 16 ng·mL －1(r = 0． 997)。在人血浆基质中，高、中、
低浓度(0． 482、3． 86、30． 88 ng·mL －1)的日内、日间 RSD均小于 15%，方法回收率分别为 95% ～ 104%、97% ～ 108%。样品预
处理方法对血浆中的辛伐他汀和辛伐他汀酸测定无干扰。结论 所用方法处理简单、灵敏、特异性高，定量准确，可为辛伐他
汀制剂的药动学研究提供方法。
关键词:辛伐他汀;辛伐他汀酸;高效液相串联质谱法;血药浓度
中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1006 － 0103(2013)02 － 0159 － 04
Determination of Simvastatin and Simvastatin hydroxy acid in human plasma by LC －MS/MS
BAI Rui － xia1，YANG Dong － jing2*
(1． First People’s Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou，Henan，450000 P． R． China;2． Medical Colllege of Henan University，Kaifeng，
Henan，475001 P． R． China)
Abstract:OBJECTIVE To establish a method for determination of Simvastatin(SV)and Simvastatin hydroxy acid(SVA)in human
plasma by LC － MS /MS．METHODS BEH C18(50 mm ×2． 1 mm，1． 7 μm)was used． The mobile phase is consisted of acetonitrile
－ 0． 01 mol·L －1 ammonium acetate(72∶28)and the flow rate was 0． 15 mL·min －1;column temperature was 40 ℃，and injection
volume was 8 μL． Positive ion MRM detection of SV and SVA was m/z 419． 43→199． 12，m/z 437． 38→303． 26，respectively． Lovasta-
tin(LV) (m/z 405． 45→199． 14)was used as internal standard． RESULTS A good linearity was shown in the range of 0． 241 －
61. 76 ng·mL －1(r = 0. 999，n = 5)for SV，and 0． 344 － 88． 16 ng·mL －1(r = 0． 997，n = 5)for SVA． SV and SVA’s intra － day RSD and
inter － day RSD were less than 15% ． The average recovery was within 95% － 104% and 97% － 108% ． Plasma matrix effect test
showed endogenous matrix had no effect on quantification of SV and SVA． CONCLUSION The method is rapid，sensitive and
accurate，to be used for determination of SV and SVA in human plasma．
Key words:Simvastatin;Simvastatin hydroxy acid;LC － MS /MS;Concentration
CLC number:R917 Document code:A Article ID:1006 － 0103(2013)02 － 0159 － 04
辛伐他汀(Simvastatin，SV)是 3 －羟基 － 3 －甲 基戊二酰 CoA还原酶(HMG － CoA)抑制剂，为不活