全 文 ：— 10 —现代中药研究与实践2015年第29卷第6期Chin. Med. J. Res. Prac., 2015 Vol. 29 No.6
·资源与鉴定·
基金项目：内蒙古自然科学基金重大项目“基于血清化学和血清药理学的蒙药复方“查干汤”药效物质基础研究”（2011ZD13）；国家自然科学基金地区项目“基
于循证医学理念和血清药物学方法的蒙医瘟疫热病经典方剂‘查干汤’抗流感药效物质基础及其代谢规律研究”（81460651）
作者简介：任珊珊（1992-），女，在读研究生，研究方向为中药质量控制研究。E-mail: 1605654379@qq.com
通讯作者：张 屏（1977-），女，博士，副教授，从事中药药效物质基础及质量控制究。E-mail: pingzhang@vip.126.com
蒙药材悬钩子木中总黄酮含量测定方法研究
任珊珊 1，包保全 1, 2，昌妍希 1，毛 婷 1，张 屏 1*
(1. 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 内蒙古 010110 ；2. 内蒙古民族大学蒙医药学院，
通辽 内蒙古 028000)
摘 要：目的 建立蒙药材悬钩子木中总黄酮的含量测定方法，并测定不同产地该药材中总黄酮的含
量。方法 采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法、AlCl3显色法和盐酸 -镁粉显色法三种不同的显色方法测
定悬钩子木中总黄酮含量。结果 采用盐酸 -镁粉显色法，以槲皮素为对照品，在528 nm 波长处测定吸光度。
线性范围为 49.9 ~ 299.4 μg (r = 0.998)，平均回收率为 97.98%。赤峰市赛罕乌拉，呼和浩特市小井沟，乌
兰察布市九龙湾三个产地悬钩子木中总黄酮含量分别为 1.46%，2.84%和 2.58%。结论 NaNO2-A1(NO3)3-
NaOH法和 AlCl3显色法因专属性不好，不适用于该药材；盐酸 -镁粉显色法专属性好，重复性、准确度均
符合要求，可用于该药材总黄酮定量分析。
关键词：悬钩子木 ; 黄酮 ; 含量测定 ; 盐酸 -镁粉法 ; 蒙药材
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2015)06-10-04
doi:10.13728/j.1673-6427.2015.06.004
Content Determination of Total Flavonoids in Ramulus Rubi a Traditional Mongolian
Medicine
REN Shan-shan1, BAO Bao-quan1, 2, CHANG Yan-xi1, MAO Ting1, ZHANG Ping1*
(1. Department of Pharmacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China; 2. College of Mongolian
Medicine, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, China)
Abstract: Objective To establish a content determination method of total fl avonoids in a traditional Mongolian
medicine Ramulus rubi, and use it to determine fl avonoids in different samples. Methods Colorimetric determination
methods were used to determine fl avonoids in Ramulus rubi, and three chemical coloration were performed, such as
NaNO2-Al(NO3)3-NaOH, AlCl3 and HCl-Mg reaction. Results HCl-Mg coloration method was used in content
determination, with quercertin as reference substance, and measured at 528 nm. The linearity range was 49.9 ~
299.4 μg, with correlation coeffi cient as 0. 998, and average recovery as 97.98%. Total fl avonoids in three different
origins as Saihanwula Chifei, Xiaojinggou Hohhot, and Jiulongwan Ulanqab were 1.46%, 2.84% and 2.58%,
respectively. Conclusion NaNO2-Al(NO3)3-NaOH and AlCl3 methods showed low specifi city on Ramulus rubi,
and were not suitable to the test. HCl-Mg method showed high specifi city, repeatbility and accuracy, and could be
used for determination of fl avonoids in the herb medicine.
Key words: Ramulus rubi; fl avonoids; content determination; HCl-Mg colorimetric determination method;
traditional Mongolian medicine
蒙药悬钩子木，又名珍珠杆，为蔷薇科库页悬钩
子 Rubus sachalinensis Leveille的干燥茎枝。具有解
表、调元、止咳之功效 [1]，用于未成熟热，“赫伊”
热，蒙医临床上用于治疗流感、肺热咳嗽、气喘和
瘟疫等 [2]。课题组前期研究发现该药材具有抗菌、
抗炎、抗氧化等生物活性，并从中分离鉴定出 30余
个化合物，主要包括黄酮苷类、三萜苷类、酚酸类
及鞣质类化合物；其中黄酮类主要为槲皮素、山柰
酚及其糖苷，黄酮苷的糖链部分常通过酯键连有其
它基团 [3, 4]。悬钩子木中的黄酮类成分具有明确的抗
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氧化活性 [5]，为该药的有效成分。建立悬钩子木中总
黄酮的含量方法，有助于该药材及其制剂的质量控制
和药效物质基础的研究。本文考察了三种显色方法，
NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AICl3法和盐酸 -镁粉法，
最终建立了盐酸 -镁粉显色法测定该药中总黄酮，采
集并测定了赤峰市赛罕乌拉，呼和浩特市小井沟，乌
兰察布市九龙湾三个产地样品中总黄酮含量，为药材
质量控制和进一步开发利用提供了参考。
1 仪器与试药
TU1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析
仪器有限责任公司 )；AB135-S十万分之一电子天平
（梅特勒 -托利多仪器有限公司）；HHS11-2B电热
恒温水浴锅 (上海医疗器械五厂 )；悬钩子木药材 3
批，为课题组 2014年野外采集、阴干。采集地为赤
峰市赛罕乌拉、呼和浩特市小井沟、乌兰察布市九龙
湾，均由内蒙古医科大学药学院包保全教授进行原
植物鉴定；槲皮素对照品（沈阳泷浦科技有限公司，
批号：LPS005），所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
取槲皮素约 5 mg，精密称定，置 50 ml量瓶中，
70％乙醇溶解，定容，制得 0.1 mg·ml-1对照品溶液 (实
际浓度为 0.099 8 mg·ml-1)。
2.2 供试品溶液制备
取悬钩子木粉末（过 40目筛）2.0 g，精密称定，
置 150 ml圆底烧瓶中，加入 70%乙醇 80 ml，称重，
回流提取 2 h，提取液冷却，补足减失重量，滤过，
取续滤液，即得。
2.3 测定方法及测定波长的选择
2.3.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显 色 法 [6] 精 密
吸取对照品溶液和供试品溶液各 2.0 ml，分别置于
10ml量瓶中，加 5％ NaNO2溶液 0.3 ml，摇匀，放
置 6 min；加 10％ Al(NO3)3溶液 0.3 ml，摇匀，放置
6 min；加 4％ NaOH试液 4 ml，加 70％乙醇定容至
刻度，摇匀，显色 15 min，以相应试剂为空白，于
400 ~ 700 nm进行全波长扫描，结果该方法对照品在
显色前后未发生明显红移，供试品显色后最大吸收波
长在 494 nm，显示此方法受其它含邻二酚羟基的化
合物干扰较大。
2.3.2 AlCl3显色法 [7] 精密吸取对照品溶液 2.0
ml和供试品溶液 2.0 ml，分别置于 10 ml量瓶中，各
加入 4% AlCl3 1.0 ml，加 70％乙醇定容，摇匀，显
色 15 min，以相应试剂为空白，在 400 ~ 700 nm范
围内进行紫外扫描，结果显色后对照品在 528 nm呈
现最大吸收峰，而供试品溶液在 400 ~ 500 nm波长
处未出现吸收峰。
2.3.3 盐酸 -镁粉显色法 [8, 9] 供试品溶液稀释 5
倍，精密吸取供试品稀释液 2.0 ml、对照品溶液 1.5
ml，分别置加有镁粉 200 mg的具塞刻度试管中。将
试管置冷水浴中（10 ~ 15℃），缓慢滴加浓盐酸 2
ml，并不时振摇试管。摇匀，称重，置沸水浴中加
热 60 min，迅速冷却至室温，加 70%乙醇补足重量。
在 400 ~ 700 nm范围内扫描测定吸收光谱。结果对
照品与供试品在 528 nm有最大吸收，且未显色的对
照品、供试品及空白溶液在此处无干扰（图 1）。
图 1 不同显色方法下供试品与对照品紫外扫描图
Fig. 1 The UV scans of test and reference substance under different
coloration method
A. NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供试品溶液显色后 ;
B. AlCl3 供试品溶液显色后 ;
C. HCl-Mg 法槲皮素显色后 ;
D. HCl-Mg 法供试品溶液显色后
A. The method of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH after test solution coloration;
B. The method of AlCl3 after test solution coloration;
C. The method of HCl-Mg after quercertin solution coloration;
D. The method of HCl-Mg after test solution coloration
比较上述 3种显色方法，用盐酸 -镁粉反应显色
后，槲皮素对照品、供试品 λmax基本一致，最大吸
收波长为 528 nm，该法更适合悬钩子木的总黄酮含
量测定。
2.4 显色条件的考察
2.4.1 精密度考察 吸取对照品溶液 1.5 ml，按显
色方法显色，显色后连续测定 6次吸光度值。计算吸
光度的 RSD为 0.22%，表明仪器精密度良好。结果
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见表 1。
表 1 精密度试验结果
Tab. 1 Results of precision tests
序号 1 2 3 4 5 6
吸光度 A 0.542 0.543 0.544 0.542 0.541 0.541
2.4.2 加热时间的考察 吸取对照品溶液 3份各
1.0 ml，分别置加有 200 mg镁粉的具塞刻度试管中，
按 “2.3.3”项下操作，沸水浴时间分别为 0.5、l、1.5 h，
显色后测定 528 nm处吸光度，见表 2。结果显示 1 h
> l.5 h > 0.5 h，因此选择加热 1 h。
表 2 加热时间的考察试验结果
Tab. 2 Investigation results of heating time tests
显色时间（h） 0.5 1.0 1.5
吸光度 A 0.229 0.311 0.307
2.4.3 镁粉用量的考察 吸取对照品溶液 3份各
1.0 ml，分别置于加有镁粉 100、200、300 mg的具
塞刻度比色管中，按 “2.3.3”项下操作，显色后于
528 nm处测定吸光度，见表 3。结果显示镁粉用量
为 200 mg时的吸光度最大。
表 3 镁粉用量的考察试验结果
Tab. 3 Invetigation results of magnesium dosage tests
镁粉用量（mg） 100 200 300
吸光度 A 0.120 0.321 0.275
2.4.4 显色稳定性考察 吸取对照品溶液 1.0 ml，
供试品溶液（No.1）2.0 ml，分别在显色后 10、20、
30、40、50、60、70 min时测定吸光度，见表 4。结
果表明对照品显色后吸光度 1 h以内稳定。供试品溶
液显色后 20 ~ 60 min吸光度稳定。
表 4 显色稳定性试验结果
Tab. 4 Results of coloration stability tests
显色时间 (min) 10 20 30 40 50 60 70
A 供试品 0.525 0.624 0.626 0.629 0.628 0.629 0.632
A 标准品 0.406 0.406 0.405 0.405 0.406 0.407 0.407
2.4.5 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液
0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，置加有 200 mg镁
粉的具塞比色管中，按 “2.3.3”项下操作，测定 528
nm处吸光度。以对照品用量 (mg)为横坐标、吸光度
为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程：
Y = 3. 820X - 0.037 5 (r = 0. 998)，槲皮素在 0.049 9 ~
0.299 4 mg范围内与吸光度呈线性关系。
表 5 标准曲线测定结果
Tab. 5 Results of the standard curve measurement
对照品用量 (mg) 0.049 9 0.099 8 0.149 7 0.199 6 0.249 5 0.299 4
吸光度 A 0.129 0.373 0.542 0.725 0.896 1.113
2.4.6 重复性考察 取同一批悬钩子木药材
(No.1)6份，每份 2.0 g，精密称定，按 “2.2”项下制
备供试品溶液，按 “2.3.3”项下操作，显色后测定
528 nm处吸光度并计算含量。见表 6。结果 5次测
定平均含量为 14.58 mg·g-1，RSD为 1.97％，表明
该方法重复性良好。
表 6 重复性试验结果
Tab. 6 Results of repeatability tests
取样量（g） 吸光度 A 平均含量（mg·g-1） RSD（%）
2.045 0 0.622
14.58 1.97
2.050 0 0.633
2.049 8 0.628
2.049 6 0.626
2.048 5 0.630
2.049 0 0.616
2.4.7 加样回收率考察 加样回收率考察 取悬钩
子木药材 (No.1)6份，各约 1.0 g，精密称定，置 150
ml圆底烧瓶中，分别加入槲皮素对照品 14 mg，按
“2.2”项下制备供试品溶液，精密稀释供试品溶液 2.0
ml，按 “2.3.3”项下操作，显色后测定含量，计算平
均回收率，结果见表 7。
表 7 加样回收率试验结果（n = 6）
Tab. 7 Results of recovery test（n = 6）
序号 称样量（g）
样品中含量
（mg）
加入量
（mg）
实测量
（mg）
加样回收
（%）
平均加样
回收率（%）
RSD
（%）
1 1.000 4 14.585 13.99 28.413 98.84
97.98 1.72
2 1.000 3 14.583 14.02 28.302 97.85
3 0.999 7 14.575 14.07 28.041 95.71
4 1.000 5 14.586 14.05 28.673 100.26
5 1.000 2 14.582 14.10 28.176 96.41
6 0.999 8 14.576 14.04 28.451 98.82
2.5 悬钩子木样品中总黄酮含量测定
分别取 3批样品，按 “2.2”项下方法制备样品溶
液，按 “2.3.3”项下方法，测定 528 nm处吸光度，计
算总黄酮含量，结果见表 8。
表 8 含量测定结果（n = 3）
Tab. 8 Results of content determination of samples（n = 3）
序号 产地 总黄酮含量 (mg·g-1) RSD(%)
1 赤峰市赛罕乌拉 14.6 0.97
2 呼和浩特市小井沟 28.4 0.18
3 乌兰察布市九龙湾 25.8 0.61
3 讨论
3.1 显色方法的考察与盐酸 -镁粉法的确定 本
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实验采用 3种显色方法，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法
和 AlCl3法供试品未在测定波长处（510 nm左右）
出现最大吸收峰，表明有其它含有邻二酚羟基的化
合物干扰其测定，该方法的专属性不好 [10]。悬钩子
木中含有大量的酚酸类化合物 [3]，其 3, 4-邻二酚羟
基结构也与显色剂反应，并在 400 ~ 500 nm处有紫
外吸收，出现假阳性结果，干扰总黄酮的含量测定。
NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法中对照品槲皮素在未在 510
nm处呈现最大吸收，原因可能是，NaNO2-Al(NO3)3-
NaOH法的对照品应选用芦丁，槲皮素与 Al3+的配位
位点较芦丁多，应对显色体系的 pH值严格控制。盐
酸 -镁粉法常用于黄酮类的鉴别反应，可将黄酮、黄
酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇还原，并与Mg生成有
色物质。近年来，该方法开始用于黄酮类含量测定的
研究 [11]。
3.2 盐酸 -镁粉法反应条件的控制
盐酸 -镁粉反应生成新生态的氢，还原黄酮C环4-
羰基，之后生成的Mg2+与黄酮形成配位化合物而显
色。该方法在生成氢的过程中，化学反应较剧烈，需
对实验条件加以控制。试验过程中要控制盐酸的滴加
速度，逐滴加入，并不时振摇，减少大量泡沫的生成，
同时，沸水浴时应避免温度过高，不能使液体喷出，
造成实验的误差。经反复实验证明，该方法条件可
控，测定结果准确可靠。
3.3 槲皮素作为对照品的依据
化学研究表明，悬钩子木中主要黄酮类成分为槲
皮素、山柰酚及其糖苷类，其糖链部分多有酯键。实
验证实 70%乙醇回流提取最完全，而回流提取方法
易造成酯键水解，因此，选用槲皮素苷元作为对照品。
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收稿日期：2015-05-01