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应用高效液相色谱法测定中药奇蒿中异泽兰黄素和奇蒿黄酮的含量



全 文 :·论著·
应用高效液相色谱法测定中药奇蒿中异泽兰黄素和奇蒿黄酮的含量
邱智泉a,曹青青b,谭蔚锋a,周 瑾b,吕 磊b(第二军医大学附属东方肝胆外科医院 a.胆道一科,b.药材科,上海
200438)
[作者简介] 邱智泉,主治医师,讲师.研究方向:普外科疾病治疗.
Tel:(021)81875582;E-mail:qzhq423@126.com
[通讯作者] 吕 磊,硕士,主管药师.研究方向:中药质量标准研
究.Tel:(021)81875578;E-mail:k_owen2002@126.com
  [摘要] 目的 采用高效液相色谱(HPLC)法测定中药奇蒿中异泽兰黄素和奇蒿黄酮的含量。方法 奇蒿药材以10倍
体积甲醇超声60min提取。色谱分离采用资生堂 MG-C18色谱柱(3.0mm×100mm,3μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸
(40∶60,V/V),等度洗脱,流速0.5ml/min,检测波长350nm,柱温25℃,进样量5μl。结果 异泽兰黄素和奇蒿黄酮在
15min内基线分离,线性良好。方法学验证表明,日内、日间精密度,重复性和稳定性的范围均符合相关标准。异泽兰黄素的
低、中、高加样回收率分别为100.26%,99.58%和102.24%;奇蒿黄酮的低、中、高加样回收率分别为99.09%,101.12%和
101.43%。结论 该方法快捷简单,稳定可靠,可用于对奇蒿药材进行质量控制。
  [关键词] 奇蒿;异泽兰黄素;奇蒿黄酮;高效液相色谱;含量测定
[中图分类号] R93   [文献标志码] A   [文章编号] 1006-0111(2016)02-0163-04
[DOI] 10.3969/j.issn.1006-0111.2016.02.016
Assay of eupatilin and arteanoflavone in Artemisia anomala by HPLC
QIU Zhiquana,CAO Qingqingb,TAN Weifenga,ZHOU Jinb,LLei b(a.Derpartment of Biliary Tract Surgery,b.Derpart-
ment of Pharmacy,Eastern Hepatobiliary Hospital Affiliated to Second Military Medical University,Shanghai 200438,China)
[Abstract] Objective To determine the concentration of eupatilin and arteanoflavone in Artemisia anomala by high per-
formance liquid chromatography(HPLC).Methods Artemisia anomala was extracted by ultrasonic for 60minutes with 10
times volume of methanol.The HPLC was performed on a SHISEIDO MG-C18column(3.0mm×100mm,3μm).The mobile
phase was a mixture of acetonitrile(ACN)and 0.1%formic acid(40∶60,V/V).The detection wavelength was 350nm,the
column temperature was 25℃and the injection volumn was 5μl.Results Eupatilin and arteanoflavone were separated at base-
line within 15min with good linearity.The method validation results show that the precisions,repeatability and stability were
al in the normal range.The low,medium and high level recoveries of eupatilin were 100.26%,99.58%,102.24%,and those of
arteanoflavone were 99.09%,101.12%,101.43%,respectively.Conclusion The method was rapid,simple,reproductive and
accurate.It can be used to control the quality of Artemisia anomala.
  [Key words] Artemisia anomala;eupatilin;arteanoflavone;HPLC;determination
  奇蒿又名南刘寄奴、六月霜、九牛草、野马兰头
等,为菊科多年生草本植物奇蒿(Artemisia anoma-
la S.Moore)的全草[1]。主要分布于我国华东、中南
及西南各省区,主产于江苏、浙江、广西、湖南等地。
奇蒿始载于《雷公炮制论》,其性温味苦[2]。全草入
药有清热解暑、破血通经、散瘀止痛、消食化积的功
效,主治血漏经闭、产后阏阻腹痛、食积不化等症[3]。
现代药理学研究表明,奇蒿可以影响血液系统和内
分泌功能,亦具有抗菌、抗缺氧、抑制亚硝化反应、抗
氧化、镇痛、保肝等作用[4]。近期有学者研究发现,
奇蒿中的黄酮具有调节多靶点发挥抗血管炎症的功
效[5],奇蒿的乙酸乙酯提取部位具有强大的抗炎活
性[6]。
  奇蒿全草具有黄酮苷反应,经植物化学研究发
现,黄酮类化合物是奇蒿的重要成分之一[7]。因此,
研究奇蒿黄酮类化合物对奇蒿的药理活性机制探索
具有重要意义。据文献报道,异泽兰黄素主要存在
于艾科植物中[8],奇蒿黄酮仅存在于蒿属奇蒿中,以
上两种特征性黄酮化合物可以作为奇蒿药材鉴定的
参考依据。目前,有关奇蒿中黄酮类化合物的研究
较少,尤其是特征黄酮类化合物的提取和含量测定
未见报道。因此,建立简单、高效的方法测定奇蒿中
特征化合物,对药材的开发应用具有重要意义。本
实验采用正交设计法对奇蒿中异泽兰黄素和奇蒿黄
酮的提取条件进行优化,并采用高效液相色谱
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(HPLC)法测定两者的含量,为奇蒿中特征化合物
的研究和质量控制提供依据。
1 仪器和试药
1.1 仪器 Agilent 1100系列HPLC仪(美国安捷
伦公司),配有 G1379A真空脱气机、G1311A 四元
泵、G1367A 自 动 进 样 器、G1316A 柱 温 箱 和
G1315BDAD检测器;KUDOS-SK2200H 超声发生
器(上海科导超声仪器公司);METTLER AE240型
十万分之一电子天平(德国梅特勒公司);DJ-04药
材粉碎机(上海淀久公司)。
1.2 药品和试剂 异泽兰黄素和奇蒿黄酮对照品
购自上海诗丹德生物技术有限公司(纯度>98%),
奇蒿药材购自亳州市中药材饮片公司,共5个批次,
产地分别为:浙江(批号:20140517)、江西(批号:
20140712)、广西(批号:20140621)、湖北(批号:
20140704)、江苏(批号:20140813)。经第二军医大
学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定为菊科植物
奇蒿(Artemisia anomala S.Moore)的全草。乙腈
和甲酸为色谱纯,购自Fisher公司;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液 分别精密称取异泽兰黄素和
奇蒿黄酮对照品10.40、10.34mg,置10ml量瓶
中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得浓度分别
为1.040、1.034mg/ml的母液。精密量取上述对
照品溶液10、20、50、100、200μl,分别至10ml量瓶
中,加甲醇至刻度,摇匀,即得系列浓度的混合对照
品溶液,置于4℃冰箱中保存。
2.1.2 样品溶液 精密称取奇蒿药材粉末约2.0g
(过40目筛),置具塞锥形瓶中,加甲醇20ml,超声
提取1h,降至室温,补足失重,摇匀,过0.45μm微
孔滤膜,取续滤液,即得,置于4℃冰箱中保存。
2.2 色谱条件 色谱柱:资生堂 MG-C18色谱柱
(3.0mm×100mm,3.0μm);流动相为乙腈-0.1%
甲酸(40∶60,V/V),等度洗脱;流速0.5ml/min;
检测波长350nm,柱温25℃;进样量5μl。
2.3 方法学验证
2.3.1 系统适用性 按出峰顺序,异泽兰黄素和奇
蒿黄酮的保留时间分别为6.129、7.762min。根据
对照品溶液的色谱图中2个峰的相关参数,计算系
统适用性,其理论塔板数分别为8 852、8 345;分离
度为5.43;拖尾因子分别为1.012、1.034。空白、奇
蒿对照品及样品溶液的色谱图见图1。
2.3.2 线性关系 分别将“2.1.1”项下制备的不同
浓度的混合对照品溶液按“2.2”项下色谱条件依次
连续进样,重复3次,以对照品溶液浓度(X,μg/ml)
对峰面积(Y)进行线性回归,呈良好的线性关系,如
表1所示。
图1 奇蒿的HPLC图
A.空白溶液;B.对照品溶液;C.样品溶液;1.异泽兰黄素;2.奇蒿黄酮
表1 异泽兰黄素、奇蒿黄酮的线性关系(n=3)
成分
浓度
(ρB/μg·
ml-1)

面积
线性方程
线性范围
(ρB/μg·ml-1)

异泽兰黄素 1.04  18.55
2.08  34.59
5.20  89.70
Y=16.41 X+
2.394
1.04~
20.80
0.999 5
10.40  175.38
20.80  342.38
奇蒿黄酮  1.034  7.73
2.068  15.66
5.170  38.77
Y=7.369 X+
0.581
1.034~
20.68
0.999 5
10.34  77.83
20.68  152.47
2.3.3 定量限和检测限 将混合对照品溶液进行
逐级稀释,以信噪比10∶1时,确定其最低定量限;以
信噪比3∶1时,确定其最低检测限。异泽兰黄素和
奇蒿黄酮的最低定量限分别为1.04和1.03μg/ml,
最低检测限分别为0.64和0.86μg/ml。
2.3.4 精密度试验 取“2.1.1”项下制备的不同浓
度的混合对照品溶液中的第2、3、5个点作为低、中、
高浓度点,在1d以内连续进样3次,以及连续3d
分别进样,根据所得峰面积分别考察日内精密度和
日间精密度(n=3)。结果异泽兰黄素和奇蒿黄酮的
日内精密度低浓度点 RSD<2.0%,中、高浓度点
RSD<1.5%,日间精密度低、中浓度点 RSD<
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2.0%,高浓度点RSD<1.5%,表明本方法的精密
度良好。
2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一批次奇蒿
样品1g(产地:浙江,批号:20140517),共9份,每3
份为1组,按低、中、高3个浓度分别加入对照品一
定量(样品中各成分含量的50%、100%、150%)。
按“2.1.2”项下制备,进样分析,结果异泽兰黄素低、
中、高浓度的回收率 (n=3)分别为 100.26%
(RSD=1.81%)、99.58% (RSD=1.45%)和
102.24%(RSD=1.26%);奇蒿黄酮低、中、高浓度
的回收率(n=3)分别为99.09%(RSD=1.91%)、
101.12%(RSD=1.12%)和 101.43%(RSD=
1.49%)。结果表明,以本法同时测定奇蒿中异泽兰
黄素和奇蒿黄酮的含量回收率结果良好。
2.3.6 重复性试验 精密称取同一批次奇蒿样品
2g(批号:20140517),共5份。按“2.1.2”项下方法
分别制成样品溶液,进样分析。结果显示,异泽兰黄
素和 奇 蒿 黄 酮 (n=5)的 平 均 含 量 分 别 为
70.49μg/g(RSD=1.25%)和56.70μg/g(RSD=
1.75%)。结果表明,本方法的重复性良好。
2.3.7 稳定性试验 同法制备奇蒿药材样品提取
溶液(批号:20140517),分别在0、2、4、8、12、24h测
定2种奇蒿黄酮类化合物的峰面积,考察其稳定性。
异泽兰黄素和奇蒿黄酮的峰面积RSD(n=6)分别
为1.74%、1.45%,表明供试品溶液在24h内稳定。
2.4 样品测定 按“2.1.2”项下方法制备5个不同
产地(浙江、江西、广西、湖北、江苏)的奇蒿药材样品
溶液,各样品溶液按“2.2”项下色谱条件分析,计算
样品含量,结果见表2。
表2 各产地奇蒿药材中异泽兰黄素和
奇蒿黄酮的含量测定结果(n=3)
产地 异泽兰黄素(μg/g) 奇蒿黄酮 (μg/g)
浙江 70.63  56.43
江西 79.98  69.64
广西 44.85  34.31
湖北 117.19  85.84
江苏 80.90  57.77
3 讨论
3.1 提取方法的优化 对于奇蒿中黄酮类化合物
的含量测定方法,文献[9]报道了采用索氏回流法提
取总黄酮化合物,因操作过程烦琐,提取时间较长,
本实验采用正交设计法制订超声提取方案。以3因
素、3水平考察了对超声提取有影响的因素:物料
比、提取溶剂和提取时间。物料比(m/V)为1∶10、
1∶20、1∶30;提取时间为30、45、60min;提取溶
剂为70%乙醇、50%甲醇、甲醇,正交试验结果见表
3。根据表中2种黄酮总含量由高到低的顺序可判
断,以甲醇为提取溶剂,物料比1∶10,超声时间
60min时,异泽兰黄素和奇蒿黄酮的综合提取效率
最高,故采用2g奇蒿药材加入20ml甲醇溶剂,超
声60min作为最佳前处理条件。
表3 正交试验结果
No.
溶剂体积
(V/ml)
溶剂种类
超声时间
(t/min)
异泽兰黄
素含量
(μg/g)
奇蒿黄
酮含量
(μg/g)
2种黄酮
总含量
(μg/g)
1  20 甲醇 60  71.22  57.93  128.98
2  20  70%乙醇 30  83.39  37.00  120.21
3  40 甲醇 30  66.59  44.12  110.54
4  60  70%乙醇 60  78.73  10.47  88.98
5  60 甲醇 45  43.44  33.67  76.92
6  20  50%甲醇 45  41.32  33.72  74.85
7  40  50%甲醇 60  43.77  30.54  74.11
8  40  70%乙醇 45  22.89  39.79  62.50
9  60  50%甲醇 30  42.16  8.22  50.15
3.2 液相条件的选择
3.2.1 色谱柱 色谱柱的选择对能否形成良好分
离度具有重要影响,我们考察了250mm×4.6mm
(粒径5μm)、150mm×4.6mm(粒径5μm)以及
100mm×3.0mm(粒径3μm)3种规格的柱子。经
比较发现,长柱的分离度高,但分析时间较长;短柱
的粒径小,柱效高,分析时间短,故选用100mm×
3.0mm(粒径3μm)柱进行分析。
3.2.2 检测波长和流动相 异泽兰黄素是艾科艾
属植物艾叶中的有效成分之一,前期相关学者对艾
叶中异泽兰黄素的含量进行了研究[10,11]。在异泽
兰黄素含量测定研究条件的基础上,我们选择240、
275、350nm 3个吸收波长比较了异泽兰黄素和奇
蒿黄酮的吸收强弱,流动相比例设为乙腈-0.1%甲
酸溶液(40∶60,V/V),等度洗脱,结果表明,异泽兰
黄素和奇蒿黄酮在波长为350nm处吸收最强,且
在该流动相条件下,两者基线分离。本实验所选检
测波长和流动相条件能够准确测定奇蒿中异泽兰黄
素和奇蒿黄酮的含量。
3.2.3 温度和流速 温度和流速对样品的检测有
重要影响,降低温度能够提高样品的分离度,但会增
加流动相在柱子中的黏度,从而增加检测系统的压
力。一般情况下,柱温设为25℃。流速过高会降低
分离度,且出峰时间会过早。对于短柱,我们控制的
流速是0.5ml/min,该流速条件下,样品的分离度
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良好,且出峰时间合适,故选为分析条件。
3.3 测定结果分析 本实验对5个产地奇蒿药材
中的异泽兰黄素和奇蒿黄酮进行了含量测定。实验
结果表明,异泽兰黄素的含量依次为:湖北>江苏>
江西>浙江>广西;奇蒿黄酮的含量依次为:湖北>
江西>江苏>浙江>广西。其中,产地为湖北的药
材其目标成分的含量达到广西产的2倍。出现以上
含量差异的原因可能与药材生长的土壤成分、日照
时间、光照强弱等因素有关。此研究进一步确定了
各产地奇蒿中的特征黄酮成分的含量,通过后期系
统的统计学分析,可对不同产地的奇蒿药材质量进
行评价,也可为道地药材的鉴别提供依据。
4 小结
  本实验采用 HPLC法对奇蒿药材中的异泽兰
黄素和奇蒿黄酮进行含量测定,方法学验证表明,日
内及日间精密度、重复性、稳定性、加样回收率的范
围均符合相关标准,该方法成功运用于5个产地奇
蒿药材的含量测定。本实验建立的方法简单快速、
稳定可靠,可为奇蒿药材的质量控制提供依据。
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[收稿日期] 2015-02-10 [修回日期] 2015-06-08
[本文编辑] 李睿旻
(上接第141页)
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[本文编辑] 李睿旻
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药学实践杂志 2016年3月25日第34卷第2期
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