全 文 ：收稿日期: 2012 － 05 － 17
基金项目:广西植物研究所基本业务费支持项目 ( 合同编号: 桂植业
11010) ; 中国科学院知识创新工程重要方向项目 ( 编号:
KSCX 2-YW-Z-1030)
作者简介:史艳财( 1984 － ) ，男，硕士，助理研究员，研究方向: 分子生物
与药用植物; E-mail: shiyancainan@ 163． com。
通讯作者: 韦 霄，男，博士，研究员，研究方向: 保育生物学; E-mail:
weixiao@ gxib． cn。
广西特有植物小花异裂菊 ISSR-PCR反应体系的建立
史艳财1，2， 邹 蓉2， 骆文华2， 韦 霄1，2， 陈宗游2， 熊忠臣2
( 1．中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室， 广西 桂林 541006;
2．广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所， 广西 桂林 541006)
摘要:以小花异裂菊的叶片为材料，采用正交和单因素试验研究 Mg2 +、dNTP、TaqDNA 聚合酶、引物、模板 DNA 浓度对
ISSR-PCR扩增效果的影响。建立了适宜于小花异裂菊的 ISSR-PCR 反应体系，即 25 μL 的体系中含 Mg2 + 1． 5 mmol /L，
dNTP 0． 20 mmol /L，TaqDNA聚合酶 1． 5 U，引物 0． 8 μmol /L，模板 DNA 50 ng，10 × Buffer 2． 5 μL。该体系稳定、可靠，为利
用 ISSR分析小花异裂菊遗传多样性等工作奠定了良好的基础。
关键词: 小花异裂菊; ISSR; 优化
中图分类号: S 682． 1 + 1 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705( 2012) 09-0034-04
Establishment and Optimization of the ISSR Reaction System for
Heteroplexis sericophylla Y． L． Chen．
SHI Yan-cai1，2，ZOU Rong2，LUO Wen-hua2，WEI Xiao1，2，CHEN Zong-you2，XIONG Zhong-chen2
( 1． Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，
Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China;
2． Guangxi Institute of Botany，the Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China)
Abstract: Through orthogonal design and single factor test，to establish ISSR-PCR program for Heteroplexis
sericophylla． Five factors were tested by orthogonal design and single factor test，including Mg2 + concentration，
dNTP concentration，Taq DNA polymerase concentration，primer concentration and template DNA concentra-
tion． ISSR-PCR reaction system of Heteroplexis sericophylla contained 1． 5 mmol /L Mg2 +，0． 20 mmol /L dNTP，
1． 5 U Taq DNA polymerase，0． 8 μmol /L primer，50 ng template DNA． The optimized reaction system was
suitable for the study of genetic diversity．
Key words: Heteroplexis sericophylla Y． L． Chen． ; ISSR; optimization
菊科异裂菊属是广西的特有属，1937 年张肇謇教
授作为一个单种属发表［1］，现仅有 5 种［2］。小花异裂
菊( Heteroplexis sericophylla Y． L． Chen． ) 是其中的一
种，分布于广西阳朔、融安县的石灰岩石山灌丛或向阳
处［3］，分布区域狭窄，种群个体数量很少，已被列为国
家二级保护植物。民间常用其治疗消化不良、浮肿和
小便不利［2］。目前，关于小花异裂菊的研究较少，仅
有关于其核型［4］、萜类成分及其活性［2］、迁地保护适
应性［5］方面的研究。
ISSR是 Zietkiewicz 等［6］于 1994 年提出的一种分
子标记技术。ISSR集 RAPD、SSR技术的优点于一身，
已广泛应用于作物遗传多样性分析、种群亲缘关系分
析等方面，尚未见 ISSR技术应用于小花异裂菊的相关
研究报道。ISSR-PCR 扩增反应的最适条件需要一定
时间的摸索［7］。本试验对影响小花异裂菊 ISSR-PCR
扩增效果的主要因素 Mg2 +、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、
引物、模板 DNA浓度进行了研究，建立最佳反应体系，
为小花异裂菊的种质资源和分子生物学研究奠定
基础。
1 材料与方法
1． 1 材 料
试验材料于 2012 年 2 月采自广西植物研究所种
质资源圃，采集幼嫩叶片，置于冰盒中带回实验室后即
提取植物总 DNA。
引物 ( 引物 848 序列为 CACACACACACACA-
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第 31 卷 第 9 期 2012 年 9 月 种 子 ( Seed) Vol． 31 No． 9 Sep． 2012
CARg) 、Mg2 +、dNTP、10 × PCR buffer、Taq DNA 聚合酶
( 上海生工生物工程技术服务有限公司) ; Markers( 华
美生物工程公司) 。
TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计( 北京普
析通用仪器有限责任公司) ; PCR 仪 ( 美国 BIO-RAD
伯乐公司) ; DYCP-34 型电泳槽( 北京市六一仪器厂) ;
离心机( 珠海黑马医学仪器有限公司) ; CDYY-6C 型电
泳仪( 北京市六一仪器厂) ; UVP凝胶成像系统。
1． 2 方 法
1． 2． 1 植物总 DNA提取
采用改良后的 CTAB 法提取小花异裂菊总 DNA。
用 1%琼脂糖凝胶电泳法检验 DNA 质量，紫外分光光
度计检测 DNA浓度，－ 20 ℃冰箱中保存。
1． 2． 2 PCR预扩增程序
94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 40 s; 53 ℃退火 45 s;
72 ℃延伸 1． 5 min; 40 个循环; 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保
存。扩增产物用 1． 5%的琼脂糖凝胶电泳 1 h 左右，
EB液( 0． 5 μg /mL) 染色 20 min，然后置于 UVP凝胶成
像系统中拍照。
1． 2． 3 ISSR-PCR反应体系正交试验
采用 L9 ( 3
4 ) 正交试验设计，4 因素为: Mg2 +、
dNTP、TaqDNA聚合酶、引物，每因素设置 3 水平，见表
1。除表中变化因素外，每个体系还含有 2． 5 μL 的
10 × PCR buffe，30 ng模板 DNA，超纯水补至 25 μL，重
复 2 次。引物为 848。
表 1 ISSR-PCR正交试验 L9 ( 3
4 )
序号
因素
Mg2 +
( mmol /L)
dNTP
( mmol /L)
引物
( μmol /L)
TaqDNA
聚合酶( U)
1 0． 5 0． 1 0． 6 0． 5
2 0． 5 0． 2 1． 0 1． 0
3 0． 5 0． 3 1． 4 1． 5
4 1． 0 0． 1 1． 0 1． 5
5 1． 0 0． 2 1． 4 0． 5
6 1． 0 0． 3 0． 6 1． 0
7 2． 0 0． 1 1． 4 1． 0
8 2． 0 0． 2 0． 6 1． 5
9 2． 0 0． 3 1． 0 0． 5
1． 2． 4 ISSR-PCR单因素试验
根据正交试验结果选择扩增效果较好的组合进行
单因素试验，其他因素不变，变化单一因素，每个条件
确定后作为后续研究的一个条件。每因素设置 6 个水
平，Mg2 +为 0． 25、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 mmol /L，dNTP
为 0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30 mmol /L，TaqDNA
聚合酶为 0． 25、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U，引物为 0． 3、
0． 6、0． 8、1． 0、1． 2、1． 4 μmol /L，模板 DNA为 5、10、30、
50、70、90 ng。
2 结果与讨论
2． 1 正交试验结果
正交试验结果如图 1 所示。各组合间扩增效果有
明显的差异。组合 1、2、3、6 扩增效果最差，基本无扩
增产物。组合 4、5 有较多扩增产物，但条带强度过弱、
弥散难辨。组合 7、8、9 的效果相对较好，其中组合 8
的条带多，分离度好，较易辨认，效果最好。综上所述，
初步选用组合 8，即在 2． 5 μL 体系中含: Mg2 + 2． 0
mmol /L ，dNTP 0． 2 mmol /L，Taq DNA聚合酶 1． 5 U，引
物 0． 6 μmol /L，模板 DNA 30 ng，10 × Buffer 2． 5 μL。
图 1 ISSR-PCR正交试验结果
2． 2 Mg2 +浓度对 ISSR-PCR的影响
Taq DNA 聚合酶是 Mg2 +依赖性酶，dNTP 分子中
的磷酸基团能定量地与 Mg2 +结合，对 Mg2 +产生拮抗
作用，使实际反应中的 Mg2 +浓度下降。因此，反应体
系中的Mg2 +浓度十分重要［8］。如图 2 所示，ISSR-PCR
对 Mg2 +较为敏感。低浓度 Mg2 + ( 0． 25 ～ 0． 5 mmol /L)
时无条带扩出。随着 Mg2 +浓度升高，扩增效果逐渐改
善，条带数目增加且更加清晰易辨。当浓度为 1． 5
mmol /L时，扩增效果最好。继续提高 Mg2 +浓度，扩增
效果变化不大。故确定 Mg2 +浓度为 1． 5 mmol /L。
图 2 Mg2 +浓度对 ISSR-PCR的影响
2． 3 dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响
dNTP作为 PCR 反应的原料之一，合适的浓度对
扩增结果非常重要。dNTP浓度的变化主要影响 ISSR
带的数量和强弱［9］。由图 3 可知，低浓度的 dNTP
( 0． 05 ～ 0． 15 mmol /L) 间扩增效果差异不大，扩增条
带较少。dNTP浓度为 0． 2 ～ 0． 3 mmol /L时，条带强度
渐强、清晰度提高。选择 0． 20 mmol /L为 dNTP的最佳
浓度。
·53·
研究报告 史艳财 等: 广西特有植物小花异裂菊 ISSR － PCR反应体系的建立
图 3 dNTP浓度对 ISSR-PCR的影响
2． 4 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR的影响
Taq DNA聚合酶浓度太高，会相应增加非特异性
扩增产物，电泳图谱弥散。浓度太低，则无扩增产物或
产物不稳定［8］。如图 4 所示，低浓度的 Taq DNA 聚合
酶( 0． 25 ～ 1． 0 U) 扩增产物较少。随着 Taq DNA聚合
酶浓度的升高，扩增条带的清晰度逐渐增强且趋于稳
定，1． 5 ～ 2． 5 U扩增效果基本一致，考虑实验成本，确
定选用 TaqDNA聚合酶的浓度为 1． 5 U。
图 4 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR的影响
2． 5 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
反应体系中引物浓度过高，易引起碱基错配和产
生非特异性扩增，还易形成引物二聚体。引物浓度过
低，与模板结合位点少，扩增产量下降［10］。如图 5 所
示，除 0． 3 μmol /L外，其余浓度( 0． 6 ～ 1． 4 μmol /L) 的
引物均可扩增出相同数目的条带，且各条带的清晰度
基本一致，选择 0． 8 μmol /L为引物的最佳浓度。
图 5 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
2． 6 模板 DNA对 ISSR-PCR的影响
ISSR反应对模板 DNA 适宜浓度有较大范围。其
对扩增产物的影响与模板 DNA 类似［11］。如图 6 所
示，ISSR-PCR反应对模板 DNA含量的许可范围较大，
模板浓度为 10 ～ 90 ng 时均扩增出基本相同的带型。
50 ng扩增出的条带强度较高，故选择 50 ng 为最佳模
板浓度。
图 6 模板 DNA对 ISSR-PCR的影响
3 结 论
本研究建立小花异裂菊 ISSR-PCR 反应体系，即
25 μL 的体系中含 Mg2 + 1． 5 mmol /L，dNTP 0． 20
mmol /L，TaqDNA聚合酶 1． 5 U，引物 0． 8 μmol /L，模板
DNA 50 ng，10 × Buffer 2． 5 μL。
ISSR是基于 PCR 反应的分子标记技术［12］，扩增
效果受到诸多因素的影响。影响 PCR 扩增的各个因
素，如模板 DNA、Mg2 +、dNTP、引物以及 Taq DNA 聚合
酶浓度等因素亦会影响到 ISSR-PCR 的扩增结果。因
此，将该技术应用于一个新的植物材料时，首先建立一
个合适的 ISSR-PCR 反应体系，才能在后续研究中获
得可靠的结果［13］。正交试验可有效分析不同因素间
的相互作用，但所获得的只能是试验所用水平的某种
组合，优选结果不会超越所取水平的范围，也不能给进
一步试验提供明确的指向性。单因素试验可对各个主
要因子进行系统的研究，但无法探讨不同因素间的相
互作用［12］。本试验先通过正交试验对 PCR 反应体系
进行初步筛选，再采用单因素试验进一步优化，可快速
建立小花异裂菊 ISSR-PCR反应体系。
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收稿日期: 2012 － 05 － 17
基金项目:国家自科学基金( 编号: 81274016) ; 江苏省中医药管理局资助项目( 编号: LZ 11193) ; 江苏高校优势学科建设工程资助项目( 编号:
ysxk-2010) ; 江苏省常州市科技支撑计划( 编号: CE 20112019) ; 江苏省高等学校“中药资源化学研究”优秀科技创新团队( 2011) 。
作者简介:韩 怡( 1988 － ) ，女，江苏张家港人;硕士研究生，研究方向: 中药资源与品质评价。
通讯作者:巢建国，男，教授; E-mail: jgchao1016@ yahoo． com． cn
太子参花粉活力和柱头可授性研究
韩 怡， 巢建国， 谷 巍， 张 莹， 孙亚昕
( 南京中医药大学， 江苏 南京 210046)
摘要:目的:研究太子参的花粉活力、柱头可授性及花粉贮藏。方法:采用离体萌发法、染色法测定花粉活力，用联苯胺-
过氧化氢法测定柱头可授性，并检测不同贮藏条件下花粉的活力。结果:离体萌发法适用于太子参花粉活力测定，最适
培养基为 0． 04%硼酸 + 15%蔗糖 + 11%聚乙二醇，萌发率达 92． 44% ;太子参花药开裂期柱头可授性较强; 花粉的短期
保存以 4 ℃效果较好，长期保存以 － 80 ℃效果最佳。结论:在进行杂交授粉时，应选花药开裂期的花粉，对开花第 2 天的
柱头进行人工授粉，本研究为太子参的良种选育及种质资源保护提供了科学依据。
关键词: 太子参; 花粉活力; 柱头可授性; 贮藏
中图分类号: S 567． 2 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705( 2012) 09-0037-04
Pollen Viability and Stigma Receptivity of Pseudostellaria heterophylla
HAN Yi，CHAO Jian-guo，GU Wei，ZHANG Ying，SUN Ya-xin
( Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing Jiangsu 210046，China)
Abstract: Objective: To study the pollen viability，the stigma receptivity and storage character of Pseudostellar-
ia heterophylla．Methods: The pollen viability was evaluated by the methods of in vitro pollen germination and
pollen staining，the stigma receptivity was estimated by benzidine-H2O2 method，and the pollen viability in dif-
ferent storage conditions were detected． Results: In vitro pollen germination method was suitable for the deter-
mination of pollen germination of Pseudostellaria heterophylla，the optimal medium was 0． 04% H3BO3 + 15%
sucrose + 11% PEG 4000，in which the pollen germination capacity reached to 92． 44% ; The stigma receptivity
of Pseudostellaria heterophylla was higher when the pollen anther opening; The results showed that short-term
pollen storage at － 4 ℃was the most suitable while the long-term pollen storage was at － 80 ℃ ． Conclusion:
The optimum cross pollination times of Pseudostellaria heterophylla was 2 days after blooming and choose the
pollen in anther opening． This study provides a foundation for the breeding and germplasm resources protection
of Pseudostellaria heterophylla．
Key words: Pseudostellaria heterophylla; pollen viability; stigma receptivity; storage
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研究报告 韩 怡 等:太子参花粉活力和柱头可授性研究