全 文 ：波 谱 学 杂 志第 16卷第 4期
1999年 8月　 Chinese Journal of M agnetic Resonance
Vol.16 No.4
　Aug.1999
日本续断中新五糖常春藤皂苷
的结构和 NMR研究
缪振春1 , 冯　锐2 , 周永新1
(军事医学科学院毒物药物研究所1 ,国家生物医学分析中心2 ,北京 100850)
魏　锋
(北京江中药物研究所 ,北京 100050)
摘　要　从日本续断根部的乙醇提取物中分得一个新的三萜皂苷.经过测定 ,它为:3-O-[ β-D-
吡喃葡萄糖(1※4)] [α-L-吡喃鼠李糖(1※3)]-β-D-吡喃葡萄糖(1※3)-α-L-吡喃鼠李糖(1※2)-
α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤甙元.结果表明 , 采用一维 SEMDY 和旋转坐标 NOE 差谱核磁共振
新技术相结合的方法测定这一类化合物的糖链结构不需要对化合物进行化学降解或衍生化 ,
方法简便 、快速 , 测定结果可靠 ,每个糖基的1H NMR信号可以分辨和明确归属.
关键词　日本续断 , 五糖皂苷 , 糖链结构测定 , 旋转坐标 NOE差谱 , 一维 SEM DY谱
1　引言
续断为一传统中药 ,具有补肝肾 、强筋骨 、续折伤等功效.我们从日本续断(Dipsacus
japonicus M iq)根部的乙醇提取物中分得一个含有五个糖的新三萜皂苷.经过测定 ,其结
构式如图式 1所示.该化合物糖体的1H 和13C NMR谱比较复杂 ,多数谱峰互相发生重
叠 ,致使其糖链结构采用一般方法测定比较困难 ,研究表明 ,一维 SEMDY技术[ 1]可以使
重叠的1H NMR谱图按一定规律分离 ,不经过 Z-滤波就能够得到每个糖体的吸收形1H
NMR亚谱 ,为糖体的重叠1H NMR信号和 NOE差谱信号的归属困难提供了有效的解决
办法.旋转坐标系 NOE差谱实验[ 2]不涉及饱和照射 ,不受分子相关时间的影响 ,因此测
定时间比较短 ,不产生选择性粒子转移(SPT)[ 3] 和 Bloch-Siegert位移[ 4] , NOE信号为吸
收形 ,容易辨认 ,可以测定其大小 ,结果可靠.本文主要报道一维 SEMDY 和旋转坐标系
NOE差谱新技术在化合物 1的糖链结构测定中应用 ,有关其他研究内容将另文报道.
　　收稿日期　1999-02-08
　　缪振春 ,男 , 1940年出生 ,高级工程师
图式 1　化合物 1的结构
S cheme 1　The st ructu re of compound 1
2　实验
所有 NMR 实验均在 JEOL JNM-GX-
400型核磁共振谱仪上进行.1H NMR 的工
作频率为 400MHz , 13C NMR的工作频率为
100MHz.样品浓度约为 15mg/0.5mL ,以氘
代吡啶为溶剂 ,并兼作化学位移内标(δ8.7).
使用 5mm NMR探头 , NMR 实验均在室温
下进行.1H NMR和13C NMR的谱宽分别为
4和 25kHz ,数据点为 16384 ,弛豫延迟为 1s.
非取样脉冲数目为 2 ,载频置于谱的中央 ,采
用正交检测的方法.一维 SEMDY 和旋转坐
标系 NOE差谱实验的脉冲序列分别如图 1A
和 B所示.其中 SV 是由去偶道产生的 180°
选择性翻转脉冲 , 前者为 120ms , 后者为
140ms.观察通道的所有脉冲均为弱脉冲 ,通
过调节衰减器使 90°脉冲宽度为 45μs.MDY为混合脉冲 ,其组成为:
235°y-Δ-410°-y-Δ-290°y-Δ-285-y-Δ-30°y-Δ-245°-y-Δ-375°y-Δ-265°-y-Δ-370°y-Δ-60°-y-Δ-300°y ,
其中 Δ为 36.6μs.其他实验细节见前文报道[ 1 , 2]
图 1　脉冲序列:(A)一维 SEM DY 实验 ,(B)旋转坐标系 NOE差谱实验
Fig.1　Pulse sequences of 1D SEMDY(A)and ROE difference spect roscopy (B)
3　结果与讨论
一维 SEMDY实验是基于 MDY混合脉冲的同核相干转移原理 ,不经过 Z-滤波就能
够得到吸收形的糖体1H NMR亚谱[ 1] .180°选择性翻转脉冲可作用在糖环体任何一个可
分辨的质子信号上 ,所得到的糖体的1H NMR亚谱的基本特征与相应单糖的1H NMR谱
相似.由于它可使重叠的糖体1H NMR谱有规律地分离 ,为 NOE增益信号归属提供了可
靠依据 ,因此它在糖链结构测定中起到了重要的作用.图 2是化合物 1的一维 SEMDY实
验结果 ,180°选择性翻转脉冲分别作用在δ6.23 、6.34 、5.35 、5.43和 5.00的糖体异头质
子信号上 ,总共得到了五个糖体的1H NMR亚谱.它表明 ,化合物1中有五个糖体.它们的
类型根据糖体1H NMR亚谱中信号的数目 、自旋裂分结构和偶合常数可确定为:2个鼠李
290 波　　谱　　学　　杂　　志　　　　　　　　　第 16卷
糖 、2个葡萄糖和 1个阿拉伯糖 ,见表 1.其中 2个葡萄糖体根据异头质子信号的典型偶合
常数(8.3 ～ 8.7Hz)确定为 β-构型.2个鼠李糖的构型是根据旋转坐标系 NOE差谱实验结
果确定:当分别对它们的异头质子信号施加 180°选择性翻转脉冲时 ,2个糖体内都只有 2-
H 产生 4.9%NOE增益 ,表明它们均为α-构型.L-阿拉伯糖体根据 NOE实验确定为α-构
型:在旋转坐标系 NOE差谱实验中 ,对其异头质子信号施加 180°选择性翻转脉冲时 ,糖
体内 3-H和 5-H 分别产生 6.2%和 8.4%NOE增益.
表 1　化合物 1 的糖体1H NM R化学位移和偶合常数
Tab.1　1H NMR chemical shif ts(δ)and coupling constants(Hz)of sugar moieties of compound 1
糖体 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5a H-5b H-6a H-6b
α-鼠李糖 6.34s 4.77d 4.76dd 4.19t 5.33m CH3:1.49d
(2.0) (9.0;2.0) (9.0) (6.6)
α-鼠李糖 6.23s 4.85d 4.72dd 4.38t 4.64m CH3:1.48d
(1.8) (9.9;2.0) (8.9) (6.4)
β-葡萄糖 5.43d 4.06t 4.24t 4.52t 3.78dd 4.25dd 4.81d
(8.6) (8.6) (8.6) (8.6) (8.6;1.8) (13.2;1.8) (13.2)
β-葡萄糖 5.35d 4.09t 4.46t 4.63t 3.76dd 4.41dd 4.81d
(8.7) (8.7) (8.7) (8.7) (8.7;1.7) (12.8;1.7) (12.8)
β-阿拉伯糖 5.00d 4.50t 3.97dd 4.10d 3.66d 4.22d
(7.0) (7.0) (7.0;2.1) (2.1) (11.4) (11.4)
　＊(in pyridine-d5), ＊＊括号内数值为偶合常数
糖体1H NMR亚谱中的大多数信号归属根据自旋多重峰结构和偶合常数就能够确
定.对于少数信号的归属困难利用下面将要讨论的 NOE 效应与核间距关系一般可以得
到解决.
NOE增益信号是来自相隔 0.5nm 以内的质子之间的空间效应并且 NOE 信号强度
一般是随核间距的增加而减弱.两个糖体之间的 NOE 关系可用图式 2加以说明.
图式 2　用NOE差谱观测到的 NOE增益信号
Scheme 2　NOEs observed by NOE di fference spectra
291第 4期　　　　缪振春等:日本续断中新五糖常春藤皂苷的结构和 NM R研究
　　在图式 2中 β-葡萄糖与α-鼠李糖是以 1※3糖苷键相连接.NOE 差谱实验中 ,对 β-葡
萄糖异头质子施加 180°选择性翻转脉冲可产生两种 NOE信号:一种来自糖体内 ,就是 β-
葡萄糖本身的 3-H 、5-H 和 2-H;另外一种来自糖体外 ,就是鼠李糖的 3-H.糖体内的 NOE
信号主要用于鉴别糖体的构型和确定亚谱中一些信号的归属.而糖体外的 NOE 信号是
确定糖体之间和糖体与甙之间的连接顺序和连接位置的重要依据.结果表明 ,糖体外的
NOE信号有时不止一个.根据 NOE与核间距关系 ,应当选用其中强度最大的一个信号.
显然 ,二维 NOE技术在这类化合物结构研究中的应用受到了很大限制.一方面 ,重叠信
号中的 NOE相关峰的归属不明确.另一方面 ,NOE相关峰的大小不能准确测定.此外 ,邻
位偶合相关峰很强 ,对 NOE相关峰的辨认增添了困难.
旋转坐标系 NOE差谱实验中的自旋锁定脉冲(SL)是由等间隔的脉冲列(θ-τ)组
成 ,其中θ为脉冲倾倒角 ,τ为脉冲间隔.由于不涉及饱和照射和不受分子相关时间的影
响 ,因此其测定时间比较短 ,应用范围比较广阔.图 3B 、C 、D 、E和 F 是分别对化合物 1的
δ6.34 、6.23 、5.43 、5.35和 5.00异头质子信号施加 180°选择性翻转脉冲的旋转坐标系
NOE差谱实验结果.其中相位与 NOE增益信号相反的是被选择翻转信号.有关该图中的
NOE信号归属问题与图 2中各个糖体的1H NMR亚谱相对照可得到满意解决.其中糖体
外的 NOE 增益信号在图 3中已经作了特别标示 ,据此可确定化合物 1中糖体之间和糖体
与苷元之间的连接顺序和连接位置.
对糖体异头质子施加 180°选择性翻转脉冲时 ,α构型糖体的 NOE 信号一般来自 2-
H ,而 β构型糖体内的 NOE 信号则来自3-H 和5-H(2-H有时也产生 NOE 信号 ,但是强度
比较弱),因此 ,糖体内的 NOE增益信号可用于鉴别糖体的类型和确定亚谱中一些信号
的归属.例如 ,对图 2E 中 β-葡萄糖亚谱异头质子(δ5.35)施加软脉冲 ,δ4.46三重峰产生
6.3%NOE增益信号 ,如图 3E所示.据此可确定 ,图 2E β-葡萄糖亚谱中δ4.46三重峰为
3-H ,而δ4.63三重峰则为 4-H.
对图 2C中鼠李糖亚谱的异头质子信号(δ6.34)加软脉冲 ,δ4.46和 4.63的三重峰产
生 NOE增益信号.通过与图 2糖体亚谱对照 ,可知它们都是糖体外的 NOE 增益信号 ,属
于图 2E β-葡萄糖亚谱的 3-H 和 4-H , 由于它们的强度不同 , 前者为 8.9%,后者只有
2.8%,因此该鼠李糖与葡萄糖是以 1※3糖苷键相连接.而不应该是以 1※4糖苷键相连
接.图 3D是对葡萄糖异头质子信号(δ5.43)加软脉冲的实验结果.同理 ,该葡萄糖与另外
一个葡萄糖是以1※4糖苷键相连接 ,而不应该是以 1※6糖苷键相连接.在图 3F 中 ,对α-
阿拉伯糖亚谱的异头质子信号(δ5.00)加软脉冲 ,在δ4.26产生强度为 26.6%的 NOE增
益信号 ,在图 2糖体亚谱中无此信号 ,它为双二重峰 ,并且与高场的苷元信号有偶合关系 ,
说明α-阿拉伯糖与苷元 3-H 是以 1※3形成苷键.
292 波　　谱　　学　　杂　　志　　　　　　　　　第 16卷
图 2　化合物 1的部分 400MHz 1H NM R谱:常规谱[ A] ,用 1D-SEMDY 技术得到的α-鼠李糖
体[ B] ,α-鼠李糖体[ C] , β-葡萄糖体[ D] , β-葡萄糖体[ E] 和α-阿拉伯糖体的亚谱[ F]
Fig.2　400MHz 1H NMR spectra of compound 1:normal spect rum [ A] , subspect ra of [ B] α-
Rha , [ C] α-Rha , [ D] β-Glc , [ E] β-Glc and [ F] α-Ara , obtained by 1D-SEMDY , where anomeric
proton of each sugar component w as select ively inverted
图 3　化合的 1的 NMR谱:[ A] 常规1H 谱 , [ B , C , D和 E] 分别对δ6.34 , 6.23 , 5.43 , 5.35和
5.00异头质子信号施加软脉冲的旋转坐标系NOE差谱
Fig.3　NM R spect ra of compound 1:[ A] normal 1H NM R spectrum , [ B ,C , D and E] ROE dif-
f erence spectra w ith selective excitation of the anomeric protonδ6.34 , 6.23 , 5.43 , 5.35 and 5.00 ,
respectivily.
293第 4期　　　　缪振春等:日本续断中新五糖常春藤皂苷的结构和 NM R研究
参 考 文 献
1　缪振春 ,罗毅 ,杜泽涵 ,冯锐.波谱学杂志 , 1996 , 13:11-17
2　缪振春 ,冯锐 ,李光玉 ,杜泽涵.波谱学杂志 , 1997 , 14:83-88
3　Neuhaus D.J Magn Reson , 1983 , 53:109-114
4　Mersh J D , Sanders J K M.J M agn Reson , 1982 , 50:289-295
STRUCTURAL ANALYSIS OF OLIGOSACCHARIDE CHAIN OF
ANEW GLYCOSIDE FROM DIPSOCUS JAPONICUS BY 1D-SEMDY
AND ROE DIFFERENCE SPECTROSCOPY TECHNIQUES
Miao Zhenchun1 , Feng Rui 2 and Zhou Yongx in1
(Institute of Pharmacology and Toxicology1 , National C enter of Biomedical Analysis2 ,
Academy of M ilitary Medical Sciences , Beijing 100850)
Wei Feng
(Beijing Jiangzhong Pharmaceutical Institute , Beijing 100050)
Abstract
A new triterpenoid saponin w as isolated from the ethanolic ext ract of the root of Dipso-
cus japonicus and its st ructure was established as 3-O-[ β-D-glucopy rano-syl(1※4)] [ α-L-
rhamnopyranosy l(1※3)]-β-D-glucopy ranosyl(1※3)-α-L-rhamnopy ranosyl(1※2)-α-L-ara-
binopy ranosyl-hederagenin.The results obtained show ed that the chemical structure of
oligosaccharide chain of the saponin could be elucidated by the combination of 1D-SEMDY
and NOE difference spectroscopy in rotating f rame techniques , w ithout having recourse to
chemical deg ration or modification.Complete assignments of severely overlapping proton res-
onance of the sugar residues w ere obtained.
Key words　Dipsocus japonicus , Structural determination of O ligosaccharide Chain , NOE difference
spectro scopy in rotating frame , 1D-SEMDY
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