全 文 ：波 谱 学 杂 志第 16卷第 5期
1999年 10月　 Chinese Journal of M agnetic Resonance
Vol.16 No.5
　Oct.1999
四川九节龙中新五糖三萜皂苷
结构的 NMR研究
缪振春 , 冯　锐■ , 周永新 , 李光玉■
(军事医学科学院毒物药物研究所 , 　■国家生物医学分析中心 ,北京 100850)
张清华
(华西医科大学药学院 ,成都 610064)
摘　要　从四川九节龙(Ardisia pusilla A.DC)的正丁醇提取物中分得一个三萜皂苷.经过测
定 ,它为:3-O-[ β-D-吡喃木糖(1※2)-β-D-吡喃葡萄糖(1※4)] [ β-D-吡喃葡萄糖(1※2)-β-D-吡喃
葡萄糖(1※2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-仙客来亭 A , 为一新五糖皂苷(1).糖体间和糖体与苷元间
的连接顺序和连接位置采用一维 SEMDY 和旋转坐标系 NOE 差谱核磁共振新技术相结合的
方法进行了研究.结果表明 , 这一方法用于测定寡糖链结构具有准确 、简便 、快速等特点 ,对化
合物不需要进行化学降解或衍生化 ,糖基的重叠1H NMR信号可以分辨和正确指定.
关键词　九节龙 , 五糖皂苷 , 糖链结构测定 , 旋转坐标系 NOE差谱 , 一维 SEM DY谱
1　引言
九节龙(Ardisia pusi lla A.DC)系紫金牛科紫金牛属植物的全草.我们从四川九节龙
的正丁醇提取物中分得一个皂苷.药理实验表明 ,它有明显增强巨噬细胞的吞噬活力和增
加SREC数目 ,提高免疫功能和对 S180和 ESC 以及 B16黑色素瘤有抑制生长的作用.经
过测定 ,它为一新的五糖皂苷 ,其结构为:3-O-[ β-D-吡喃木糖(1※2)-β-D-吡喃葡萄糖(1※
4)] [ β-D-吡喃葡萄糖(1※2)-β-D-吡喃葡萄糖(1※2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖-仙客来亭 A ,如
图 1所示.该化合物的糖链具有分枝 ,糖体的 NMR信号大多相互重叠 ,采用一般方法测
定难以得到满意的结果.本文报道一维 SEMDY[ 1]和旋转坐标系 NOE差谱[ 2]核磁共振新
技术在该化合物化学结构研究中的应用.其余有关研究内容另外报道.
　　收稿日期　1999-04-29　　收修改稿日期　1999-06-18
　　缪振春 ,男 , 1940年出生 ,高工
图 1　化合物 1的结构
Fig.1　The st ructure of compound 1
2　实验
2.1　仪器和方法
熔点测定用 Kofler型显微熔点仪 ,旋光度测定用 Perkin-Elmer 241型旋光仪 ,质谱测
定用 MAT 711型质谱仪.红外光谱测定用 Nicolet FT-IR 20S×B 型红外光谱仪 ,KBr压
片法测定.
图 2　脉冲序列:(A)一维 SEMDY 实验 ,(B)旋转坐标系 NOE差谱实验
Fig.2　Pulses sequences of 1D SEMDY(A)and ROE difference spect roscopy (B)
NMR实验在 JEOL JNM-GX-400 型核磁共振谱仪上进行.1H NMR的工作频率为
400MHz , 13C NMR的工作频率为 100MHz.样品浓度约为 15mg/0.5mL ,以氘代吡啶为溶
剂并兼作化学位移内标(δ8.7).使用 5mm NMR探头 , NMR 实验均在室温下进行.1H
NMR和13C NMR的谱宽分别为 4kHz和 25kHz ,数据点为 16384 ,弛豫延迟为 1s.非取样
脉冲数目为 2 ,载频置于谱的中央 ,采用正交检测的方法.一维 SEMDY 和旋转坐标系
NOE差谱实验的脉冲序列分别如图 2A和 B所示.其中 SV 是由去偶道产生的 180°选择
性翻转脉冲 ,前者为 120ms ,后者为 140ms.观察通道的所有脉冲均为弱脉冲 ,通过调节衰
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减器使 90°脉冲宽度为 45μs.MDY 为混合脉冲 , 其组成为:235°y-Δ-410°-y-Δ-290°y-Δ-
285-y-Δ-30°y-Δ-245°-y-Δ-375°y-Δ-265°-y-Δ-370°y-Δ-60°-y-Δ-300°y ,其中 Δ为 36.6μs ,混
合时间(MT)为 180ms.SL 为自旋锁定脉冲 , 由等间距脉冲列(θ-τ)n 组成 ,其中θ为
30μs ,τ为 300μs ,自旋锁定时间为 250ms.其它实验细节见前文报道[ 1 ,2]
2.2　实验数据
化合物 1为白色粉末 ,mp279 ～ 281℃(MeOH), [ α] 22.4D -21.91°(C3H5N 0.79).FD-
MS m/ z:1245(M+Na)+ ,分子量 1222 ,分子式为 C58H94O27·4H2O.经酸水解后得到的苷
元为白色棱晶 , mp 225 ～ 227℃(MeOH), HREEI-MS m/z:472.3554(M+),分子式为 C30
H48O4.与标准品对照证明其苷元为仙客来亭A(Cyclamiretin A),其13C NMR数据见表1 ,
与文献报道结果相一致[ 3] .
表 1　化合物 1 苷元的13C NM R化学位移(δ, C5D5N)
Tab.1　13C NMR chemical shif ts(δ)of agly cone moiety in C5D5N
C 化合物 1皂苷元 Cyclamiret in A C 化合物 1皂苷元 Cyclamiret in A
1 39.6t 39.5 t 16 76.9t 76.8 t
2 26.6t 28.3 t 17 48.3s 48.2s
3 89.1d 78.1d 18 50.4d 50.4d
4 39.2s 39.5s 19 24.2t 24.1 t
5 55.6d 55.7d 20 36.9s 37.0s
6 18.1t 18.2 t 21 36.8t 36.8 t
7 32.8t 32.7 t 22 32.4t 32.3 t
8 44.1s 44.0s 23 28.1t 28.6 t
9 53.4d 52.3d 24 16.4q 16.3q
10 42.6s 42.6s 25 16.5q 16.5q
11 19.2t 19.2 t 26 19.8q 19.8q
12 30.5t 30.7 t 27 18.6q 18.6q
13 86.5s 86.4s 28 77.7s 77.7s
14 44.6s 44.6s 29 24.4q 24.1q
15 33.4t 33.4 t 30 207.9s 207.3s
在高效硅胶薄层板上用酸蒸气水解[ 4] ,检出 D-葡萄糖 、L-阿拉伯糖和 D-木糖.13C
NMR谱显示 ,该化合物有 5个糖体的C-1信号:δ104.1 ,104.4 ,104.8 ,104.9和 106.1.一
维SEMDY 1H NMR实验结果表明 ,该化合物的 5个糖体是:一个吡喃阿拉伯糖:一个吡
喃木糖和三个吡喃葡萄糖 ,见表 2.
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表 2　化合物 1 的糖体1H NM R化学位移(ppm)和偶合常数(Hz)
Tab.2　1H NMR chemical shif ts(δ)and coupling constants(Hz)of sugar moieties of compound 1
糖体 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5a H-5b H-6a H-6b
Ara 4.80d 4.55bt 4.32bs 4.25bs 3.69d 4.32d
(6.8) (6.8) (6.8) (11.4) (11.4)
Glu3 4.91d 4.07t 4.08# 4.10# 3.71m 4.18dd 4.35d
(7.3) (7.3) (10.2;2.9) (10.2)
Xyl 5.17d 4.01# 3.70 t 4.01# 4.20m 4.49dd
(7.3) (7.3) (7.3) (10.4;1.7)
Glu1 5.45d 4.06t 4.26 t 4.20t 4.05m 4.37dd 4.55d
(8.1) (8.1) (8.1) (8.1) (10.4;2.9) (10.4)
Glu2 5.22d 4.02t 4.10 t 4.21t 4.02m 4.23dd 4.55d
(8.3) (8.3) (8.3) (8.3) (10.8;5.4) (10.8)
　　＊(in pyridine-d5), 　＊＊括号内数值为偶合常数 , 　#重叠信号
3　结果与讨论
化合物 1 经酸水解后得到的苷元为白色棱晶 ,与标准品对照证明它为仙客来亭 A
(Cyclamiret in A),其13C NMR实验数据见表 1.
在高效硅胶薄层板上用酸蒸气水解后检出的糖体为 D-葡萄糖 、L-阿拉伯糖和 D-木
糖.一维 SEMDY 1H NMR实验结果表明 ,该化合物的 5个糖体是:一个吡喃阿拉伯糖 ,一
个吡喃木糖和三个吡喃葡萄糖 ,见表 2.其中 3个葡萄糖和木糖根据异头质子信号的典型
偶合常数(7.3 ～ 8.7Hz)确定为 β-构型 , L-阿拉伯糖体的构型根据 NOE 实验确定为α-构
型:在旋转坐标系 NOE差谱实验中 ,对其异头质子信号施加 180°选择性脉冲 ,糖体内 5-H
产生 20.3%NOE 增益.在实验条件下 ,3-H 的 NOE增益被 HOHAHA信号抵消 ,但是通
过移动频率偏置可以观测 3-H 的 NOE信号.
一维 SEMDY技术的脉冲序列在图 2A中已经作了介绍.该技术有两个主要优点:一
是磁信号相干转移的效果比较好 ,容易得到糖基的全相关谱 ,特别是可以得到用现有其它
技术难以测定的存在弱偶合体系的阿拉伯糖和鼠李糖的全相关谱.;二是不经过 Z-滤波
可得到吸收形的高分辨1H NMR亚谱.图 3是化合物 1的一维 SEMDY实验结果.180°选
择性翻转脉冲分别作用在δ4.80 、4.91 、5.17 、5.45 和 5.22 的糖体异头质子的信号上 ,使
图 3A 中用传统方法测定的 ,多数谱峰相互重叠而难以分辨的1H NMR谱按偶合体系进
行分离 ,共得到了五个糖体的1H NMR亚谱 ,分别如图 3B 、C 、D 、E 和 F 所示.这种糖体亚
谱的基本特征与相应单糖的1H NMR谱相似 ,可解决糖体重叠1H NMR信号的解析困难 ,
为NOE差谱信号的正确归属创造了条件.因此一维 SEMDY技术在寡糖链结构测定中起
到了十分重要的作用.
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图 3　化合物 1的 400MHz 1H NMR谱:常规谱[ A] ,用 1D SEMDY 技术得到的α-Ara[ B] , β-Glu3
[ C] 、β-Xyl[ D] 、β-Glu1[ E] 和 β-Glu2[ F] 亚谱
Fig.3　400MHz 1H NM R spect ra of compound 1:normal spect rum [ A] , subspect ra of α-Ara[ B] , β-
Glu3[ C] 、β-Xyl[ D] 、β-Glu1[ E] and β-Glu2[ F] obtained by 1D SEMDY , w here anomeric proton of each
sugar component w as select ively inverted
糖体的类型根据图 3中糖体1H NMR亚谱中信号的数目 、自旋裂分结构和偶合常数
可确定为:[ B] α-阿拉伯糖;[ C] β-葡萄糖 3;[ D] β-木糖;[ E] β-葡萄糖 1和[ F] β-葡萄糖 2
体1H NMR亚谱中的大多数信号归属根据自旋多重峰结构和偶合常数就能够进行正确指
定.对于少数重叠的信号归属和葡萄糖的 3-H 和 4-H 信号的区分所遇到的困难利用下列
方法可以解决:一是利用下面将要讨论的 NOE 效应与核间距关系;二是调整一维
SEMDY实验中的混合时间[ 1] .五个糖体1H NMR亚谱的信号指定结果见表 2 ,并且在图
3 B ～ F 中各糖体1H NMR亚谱信号上面也有归属标记.
NOE信号是来自相隔 0.5nm 以内的质子之间的空间效应并且 NOE 信号的强度一
般是随核间距的增加而减弱.糖链中的 NOE 可分为两类:一是糖基内的 NOE;二是糖基
间的 NOE.由于吡喃糖在溶液中都以椅式的构象存在 ,因此 NOE谱的特征与糖基的构型
有关.例如 ,在对葡萄糖异头质子进行选择激发的实验中 , β-构型异构体的 H-3和 H-5可
产生 NOE 增益信号(H-2的 NOE 增益信号一般也能观测 ,但强度较弱)而α-构型异构体
只有 H-2产生 NOE 增益信号 ,分别如图 4 A和 B所示.糖基内的 NOE信号可用于测定
糖的构型和谱峰归属.而糖基间的 NOE 信号则可用于测定糖链中各糖基或糖基与苷元
相连接的位置 ,如图 4C 所示.
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图 4　用 NOE差谱技术观测的 NOE效应:(A , B)糖基内NOEs;(C)糖基间NOEs
Fig.4　NOEs observed by NOE dif ference spect ra:(A , B)in tra-reside NOEs;(C)inter-reside NOEs
图 5　化合物 1的 NM R谱:[ A] 常规1H 谱 , [ B 、C 、D、E和 F] 分别对δ4.80(A-1)、5.45(G1-1)、4.91
(G3-1)、5.17(X-1)和 5.22(G2-1)异头质子信号施加软脉冲的旋转坐标系 NOE差谱
Fig.5　NMR spect ra of compound 1:[ A] normal 1H NM R spect rum , [ B 、C 、D 、E and F] ROE dif ference
spect ra wi th selective excitat ion of the anomeric protonδ4.80(A-1)、5.45(G1-1)、4.91(G3-1)、5.17(X-1)
and 5.22(G2-1), respectivily
旋转坐标系 NOE差谱技术是基于自旋锁定原理 ,其脉冲序列在图 2B 中已介绍.由
于它不涉及饱和照射 ,因此测定时间比较短 ,应用范围不受分子相关运动时间的影响 ,可
观测重叠信号的 NOE ,不容易发生 Bloch-Siegert 位移[ 5] 和选择性极化转移(SPT)[ 6] ,
NOE信号为吸收形 ,容易辨认 ,可以正确测定其大小 ,结果可靠.苷类化合物的 NMR实
验一般在氘代吡啶或二甲亚砜中进行 ,由于糖体羟基与熔剂残余水峰交换而产生的宽峰
在旋转坐标系 NOE 差谱实验的自旋锁定脉冲作用下可得到有效消除 ,不影响测定结果.
图5 是化合物 1 的旋转坐标系 NOE 差谱实验结果.180°选择性翻转脉冲分别作用在
δ4.80 、5.45 、4.91 、5.17 、和 5.22的糖体异头质子的信号上 ,使图 3A 中用传统方法测定
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的多数谱峰相互重叠而难以分辨的1H NMR谱按空间效应进行分离 ,共得到了五个糖体
的 NOE差谱 ,分别如图 5 B 、C 、D 、E 和 F 所示.其中相位与 NOE 增益信号相反的是被选
择翻转信号.
化合物 1的糖基之间和糖基与苷元之间的连接方式利用图 3中糖基1H NMR亚谱和
图 5中NOE差谱可以确定如下.图 5 B是阿拉伯糖异头质子(A-1)信号被选择翻转 ,与图
3 B中阿拉伯糖亚谱相对照 ,可知δ3.69双峰为 H-5信号.H-3 和 H-2的 NOE 增益由于
HOHAHA 效应而被抵消 ,但不影响糖链结构测定 ,因为 δ3.12 双二重峰(J=12.2 和
5.6Hz)是糖基外部的 NOE增益信号 ,其强度为 34%,并且与苷元的 H-2有偶合关系 ,因
此它属于苷元 H-3(S-3).据此可确定α-阿拉伯糖与苷元 3-H 是以 1※3 形成苷键.图 5C
是葡萄糖 1异头质子(G1-1)信号被选择翻转 ,与其亚谱(图 3E)相对照 ,可知δ4.20和 4.
02三重峰为 G1-3和 G1-2 ,而δ4.05 多重峰则为 G1-5 ,据此δ4.54宽单峰是糖基外部的
NOE增益信号 ,其强度为 10.5%,在图 3B 中发现它属于阿拉伯糖 H-2(A-2).根据 NOE
与核间距关系 ,葡萄糖1与阿拉伯糖是以 1※2形成苷键.图 5D是葡萄糖 3异头质子(G3-
1)信号被选择翻转 , 与其亚谱(图 3)相对照 ,可知δ3.71 多重峰为 H-5 , H-3 和 H-2的
NOE增益由于HOHAHA效应而被抵消 ,而 X-1和 A-4则分别是图 3D中木糖的 H-1和
图 3B中阿拉伯糖的 H-4.这个实验结果显示 ,糖基外部的 NOE增益信号有时可以不止一
个.研究表明 ,通过测定它们的相对强度和考察与它们有关的其它 NOE 差谱就可以进行
正确指定.因为图 5E显示 ,木糖的 H-1(X-1)信号被选择翻转时 ,也出现两个糖基外部的
NOE信号 ,即 G3-1和 G3-2.因此决定糖基之间连接方式的 NOE 信号必然是 A-4和 G3-
2.根据 NOE与核间距关系 ,葡萄糖 3与阿拉伯糖是以 1※4形成苷键 ,而木糖与葡萄糖 3
则以 1※2形成苷键.图 5F 是葡萄糖 2异头质子(G2-1)信号被选择翻转 ,与其亚谱(图
3F)相对照 ,可知δ4.20的三重峰和 4.02多重峰为糖基内的 NOE增益信号 ,分别属于 H-
3和 H-5 ,而δ4.02三重峰则为糖基外部的 NOE增益信号 ,属于图 5E中葡萄糖 1的 H-2.
因此葡萄糖 2与葡萄糖 1是以 1※2形成苷键.以上结果与图 1中所示化合物 1的结构相
一致.
以上结果表明 ,采用一维 SEMDY和旋转坐标系 NOE 差谱核磁共振新技术相结合的
方法测定这类化合物中的糖体间和糖体与苷元间的连接顺序和连接位置是方便而有效的
途径 ,对化合物不需要进行化学降解或衍生化 ,糖链结构是通过每个糖基的1H NMR亚谱
和糖体外的 NOE增益信号进行表达.与传统方法相比 ,它具有简便 、快速和准确等特点.
参 考 文 献
1　缪振春 ,罗毅 ,杜泽涵 ,冯锐.波谱学杂志 , 1996 , 13(1):11
2　缪振春 ,冯锐 ,李光玉 ,杜泽涵.波谱学杂志 , 1997 , 14(1):83
3　关雄泰 ,汪茂田 ,赵天增 ,洪山海.中草药 , 1987 , 18(4):340
4　赵萍萍.药学学报 , 1997 , 22(1):70
5　Neuhaus D.J Magn Reson , 1983 , 53(2):109
6　Mersh J D , Sanders J K M.J M agn Reson , 1982 , 50(3):289
401第 5期　　　　缪振春等:四川九节龙中新五糖三萜皂苷结构的 NM R研究
NMR STUDYON A NEWTRITERPENOID GLYCOSIDE
OF ARDISIA PUSILLA
Miao Zhenchun , Feng Rui , Zhou Yongxin and Li Guangyi
(Inst itute of Pharmacology and Toxicology , Academy of M ilitary Medical Sciences , Beijing 100850)
Zhang Qinghua
(S chool of Pharmacy , West China University of Medical Sciences , Chengdu 610041)
Abstract
A new triterpenoid saponin w as isolated from Ardisia pusi lla A.DC.which has im-
proved immunological and antitumo r and its st ructure established as 3-O-[ β-D-xy lopy ranosyl
(1※2)-β-D-glucopy ranosyl(1※4)] [ β-D-glucopy ranosyl(1※2)-β-D-glucopy ranosyl(1※2)]-
α-L-arabinopyranosy l cyclamiretin A.The results show ed that the chemical st ructure of
oligosaccharide chains of the saponin could be elucidated by the combinat ion of 1D-SEMDY
and NOE difference spectroscopy in rotating f rame techniques , w ithout having recourse to
chemical deg ration or modification.Complete assignments of severely overlapping proton res-
onance of the sugar residues w ere obtained.
Key words　Ardisia pusilla A.DC , Structural detemination of saponin , NOE difference spectroscopy in
rotating frame , 1D-SEMDY
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