全 文 ：收稿日期:2012-06-11; 修订日期:2012-07-18
基金项目:国家自然科学基金(No． 30860374)
作者简介:迟 艳(1962-) ，女(汉族) ，吉林敦化人，现为延边大学附属医
院主管药师，学士学位，主要从事中药开发和临床药学工作．
* 通讯作者简介:张学武(1973-) ，男(汉族) ，吉林大安人，现为延边大学
医学院教授，博士学位，主要从事分子肿瘤学与中药开发研究工作．
珍珠梅醋酸乙酯提取物对荷瘤小鼠免疫功能影响
迟 艳1，马冬杰2，张学武2* ，林冬岩3
(1．延边大学附属医院，吉林 延吉 133000; 2．延边大学医学院，吉林 延吉 133000;
3．中国人民解放军空军 93011 部队，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 观察珍珠梅醋酸乙酯提取物对荷瘤小鼠免疫功能影响。方法 45 只 H22荷瘤小鼠随机分为珍珠梅醋酸乙酯
提取物大、中、小剂量组、对照组和环磷酰胺组，共 5 组。观察珍珠梅醋酸乙酯提取物对荷瘤小鼠体质量的影响，计算抑
瘤率，测定胸腺、脾脏指数及吞噬百分率及吞噬指数;MTT比色法测定脾淋巴细胞增殖能力及 NK 细胞活性。结果 珍珠
梅醋酸乙酯提取物组小鼠体重无明显变化，对肿瘤的抑制率分别为 49． 0%、45． 0%、36． 2%。胸腺、脾脏指数，吞噬功能，
脾淋巴细胞增殖能力及 NK细胞活性明显增强，与对照组比较有显著性差异(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)。结论 珍珠梅醋酸
乙酯提取物可以抑制肿瘤的生长，提高荷瘤小鼠免疫功能可能是作用机制之一。
关键词:珍珠梅; 荷瘤小鼠; 免疫功能
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 10． 013
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)10-2413-02
Effect of Sorbaria sorbifolia Ethyl Acetate Extract on the Immune Function of H22 Tumor
－ bearing Mice
CHI Yan1，MA Dong-jie2，ZHANG Xue-wu2* ，LIN Dong-yan3
(1． Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji 133000，China;2． College of Medicine，Yanbian University ，
Yanji 133000，China;3． 93011 Air Force，Yanji 133000，China)
Abstract:Objective To investigate the effect of Sorbaria sorbifolia ethyl acetate extract on the immune functions in H22 tumor －
bearing mice．Methods H22 tumor cells were subcutaneously injected to the right armpit of the mice to establish the H22 tumor －
bearing model，and fortyfive mice were randomly divided into five groups． The influence of Sorbaria sorbifolia ethyl acetate extract
on the body weight was observed． The tumor control ratio，the indexes of thymus gland and spleen，phagocytic percentage and
phagocytic index were calculated． MTT assay was used to detect spleen lymphocyte proliferation and NK cell activity． Result-
s There had no significant change in body weight of mice in Sorbaria sorbifolia ethyl acetate extract，and the tumor inhibition rates
were 49． 0%，45． 0% and 36． 2%，respectively． There were significant differences in the indexes of thymus gland and spleen，
phagocytic percentage，phagocytic index，lymphocyte proliferation and NK cell activity as compared to control group (P ＜ 0． 05 or
P ＜ 0． 01)． Conclusion Sorbaria sorbifolia ethyl acetate extract can inhibit tumor growth，and the mechanism may be related with
the enhancement of the immune function of tumor － bearing mice．
Key words:Sorbaria sorbifolia; Tumor － bearing mice; Immune function
珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)属蔷薇科植物，广泛分布于云南、
贵州、四川、甘肃、宁夏及东北，有活血化瘀、消肿止痛，治骨折及
跌打损伤的作用［1］。我们曾研究报道长白山珍珠梅醋酸乙酯提
取物对人肝癌 HepG － 2 细胞生长有抑制作用［2］。本实验研究了
珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及免疫
功能的影响，为进一步开发珍珠梅提供实验依据。
1 材料与仪器
1． 1 药物 珍珠梅醋酸乙酯提取物:珍珠梅采自吉林省延吉市市
郊，经延边大学药学院刘永镇教授鉴定为真品。取干燥的珍珠梅
1 000 g，适度粉碎，置于三角烧杯中加入 80%乙醇浸泡 24 h，
85℃水浴加热回流提取，第一次加热 3 h，后两次均加热 2 h，提取
液趁热过滤，将 3 次提取液合并，回收乙醇，水层用醋酸乙酯萃取
4次，合并滤液，回收醋酸乙酯，浓缩、干燥，得 40 g粉末。干燥提
取物，配成所需浓度，贮存备用。
1． 2 药品与试剂 环磷酰胺(CTX，山西泰盛制药有限公司) ;
MTT(美国 Sigma公司) ;RPMI － 1640 培养液(美国 Sigma公司) ;
DMSO(美国 Sigma公司)。
1． 3 动物及瘤株 昆明种小鼠，雄性，体质量 18 ～ 22 g，由延边大
学实验动物中心提供，合格证号:SCXK 吉 2011 － 0007;H22细胞
株由南京凯基生物科技发展有限公司提供。
1． 4 仪器 CO2 培养箱，日本 HITACHI 公司产品;酶标仪，日本
岛津公司产品。
2 方法
2． 1 荷瘤小鼠模型的建立及分组 无菌条件下取传代第 5 天的
H22小鼠腹水，用 0． 9%生理盐水以 1∶ 3 稀释至含瘤细胞 1 × 10
7
个 /ml，分别取 0． 1 ml 接种于小鼠前肢外侧皮下，制成荷瘤小鼠
模型。将 45 只小鼠随机分为 A、B、C、D、E 5 组，每组 9 只。A、B、
C分别为 0． 5，0． 25，0． 125 mg /kg 大、中、小剂量组，D 组为对照
组，E组为 CTX组。
2． 2 给药方法 接种后于第 2 天给药，A、B、C 组每天按 0． 5，
0． 25，0． 125 mg /kg珍珠梅醋酸乙酯提取物灌胃，D 组:每天灌胃
生理盐水 0． 2 ml /只，E组:按 0． 02 g /kg剂量隔天腹腔注射 CTX，
各组小鼠连续给药 10 d。
2． 3 对小鼠瘤重、胸腺和脾脏指数的影响 停药后第 2 天称量小
鼠体重;取小鼠肿瘤，胸腺，脾脏，并分别称其湿重。抑瘤率 =
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(对照组瘤重 －实验组瘤重)/对照组瘤重 × 100%;脾指数 =脾
重 /体质量(mg /g) ;胸腺指数 =胸腺质量 /体质量(mg /g)。
2． 4 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响［3］ 取小鼠 45 只，按
照“2． 1”项随机分组，给药方式同“2． 2”项。给药 10 d后，每只小
鼠 i． p． 5%鸡红细胞 0． 4 ml，6 h后将小鼠脱颈处死，仰卧固定，消
毒腹部，i． p． Alsever 溶液 2 ml，1 min后，抽取腹腔液 0． 2 ml滴于
载玻片上，置于 37℃培养箱中 30 min 后，取出载玻片，放入生理
盐水中漂洗，晾干，丙酮 －甲醇(1∶ 1)固定 10 min，用蒸馏水漂
洗、晾干。在油镜下分别计数 200 个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的
巨噬细胞数、每个巨噬细胞中被吞噬的鸡红细胞数目。按照下式
计算其吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率 =吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 /200 个巨噬细胞 ×
100%;吞噬指数 = 被吞噬的鸡红细胞数 /200 个巨噬细胞 ×
100%。
2． 5 对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响［4］ 取小鼠 45 只，按照
“2． 1”项随机分组，给药方式同“2． 2”项。停药后第 2 天，处死小
鼠，无菌取出脾脏，制备脾细胞悬浮液，ConA 刺激脾淋巴细胞分
化增殖，采用 MTT比色法测定脾淋巴细胞增殖能力。
2． 6 对小鼠 NK细胞活性的影响［5］ 取小鼠 45 只，按照“2． 1”项
随机分组，给药方式同2． 2项。停药后第 2 天，处死小鼠，无菌
取出脾脏，制备脾细胞悬浮液，以 YAC － 1(小鼠 T 淋巴细胞瘤)
为靶细胞，采用 MTT 比色法测定 NK 细胞活性。按照下式计算
NK细胞活性，以杀伤率表示。NK细胞杀伤率(%)=［1 －(实验
孔 OD值 －效应细胞对照孔 OD 值)/靶细胞对照孔 OD 值］ ×
100%。
2． 7 统计学方法 数据采用 珋x ± s表示，应用 SPSS 11． 5 统计软件
进行方差分析。
3 结果
3． 1 对 H22荷瘤小鼠体质量的影响 珍珠梅醋酸乙酯提取物大、
中、小剂量组及 CTX组与对照组小鼠的体质量比较，无显著性差
异。结果见表 1。
表 1 珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤
小鼠体质量及瘤重的影响(珋x ± s) g
组别 体质量(始) 体质量(末)
A 21． 1 ± 1． 5 25． 5 ± 2． 4
B 22． 0 ± 1． 7 26． 3 ± 2． 5
C 21． 4 ± 1． 6 26． 4 ± 2． 4
D 22． 1 ± 1． 8 27． 8 ± 2． 8
E 22． 0 ± 1． 5 25． 4 ± 2． 0
n = 1
3． 2 对 H22荷瘤小鼠瘤重的影响 珍珠梅醋酸乙酯提取物组及
CTX组对肿瘤生长的抑制率分别为 49． 0%，45． 0%，36． 2%及
52． 0%。结果见表 2。
表 2 珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤小鼠瘤重的影响(珋x ± s)
组别 瘤重 m / g 抑制率(%)
A 1． 52 ± 0． 91* 49． 0
B 1． 64 ± 0． 83* 45． 0
C 1． 90 ± 0． 95* 36． 2
D 2． 98 ± 1． 20 －
E 1． 43 ± 0． 71* 52． 0
与 D组比较，* P ＜ 0． 05;n = 9
3． 3 对 H22荷瘤小鼠胸腺和脾脏指数的影响 珍珠梅醋酸乙酯
提取物各剂量组及 CTX 组与对照组小鼠的胸腺和脾脏指数比
较，有显著性差异，且有一定的量效关系。结果见表 3。
3． 4 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 表 4 结果显示，珍珠
梅醋酸乙酯提取物各剂量组及 CTX 组与对照组小鼠比较，吞噬
功能明显增强。
表 3 珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤
小鼠胸腺和脾脏指数的影响(珋x ± s) mg·g － 1
组别 胸腺指数 脾脏指数
A 3． 45 ± 0． 69* 8． 27 ± 1． 31＊＊
B 3． 00 ± 0． 58* 7． 01 ± 1． 42*
C 2． 35 ± 0． 42* 6． 21 ± 1． 85
D 1． 53 ± 0． 34 4． 13 ± 0． 98*
E 3． 58 ± 0． 74* 8． 54 ± 1． 24＊＊
与 D组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 9
表 4 珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(珋x ± s)
组别 吞噬百分率 吞噬指数
A 82． 00 ± 5． 21* 0． 40 ± 0． 11*
B 78． 75 ± 10． 41* 0． 40 ± 0． 12*
C 78． 00 ± 8． 38* 0． 50 ± 0． 14*
D 66． 50 ± 13． 69 0． 14 ± 0． 04
E 72． 90 ± 8． 01* 0． 47 ± 0． 07*
与 D组比较，* P ＜ 0． 05;n = 9
3． 5 对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 由表 5 可知，珍珠梅醋
酸乙酯提取物各剂量组及 CTX组均可以促进小鼠脾淋巴细胞增
殖，且有一定的量效关系。
表 5 珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤
小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(珋x ± s)
组别 淋巴细胞增殖能力 (OD570 nm)
A 0． 453 ± 0． 054＊＊
B 0． 388 ± 0． 046＊＊
C 0． 257 ± 0． 026*
D 0． 175 ± 0． 015
E 0． 475 ± 0． 056＊＊
与 D组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 9
3． 6 对小鼠 NK细胞活性的影响 珍珠梅醋酸乙酯提取物大、中
组与对照组小鼠的 NK 细胞活性比较，有显著性差异，且有一定
的量效关系。结果见表 6。
表 6 珍珠梅醋酸乙酯提取物
对 H22荷瘤小鼠 NK细胞活性的影响(珋x ± s) %
组别 NK细胞活性
A 31． 2 ± 3． 5＊＊
B 24． 5 ± 3． 1*
C 19． 7 ± 2． 2*
D 12． 5 ± 1． 8
E 25． 7 ± 2． 6*
与 D组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 9
4 讨论
本实验研究结果显示，珍珠梅醋酸乙酯提取物对 H22荷瘤小
鼠肿瘤的生长被显著抑制，随着珍珠梅醋酸乙酯提取物浓度的增
加，抑制作用有增强的趋势，说明珍珠梅醋酸乙酯提取物具有一
定的抗肿瘤作用。
胸腺和脾脏分别是机体重要的中枢免疫器官和外周免疫器
官之一，免疫器官重量指数可以客观地反应机体免疫功能的状
况，当机免疫功能增强时，免疫器官重量指数有所增强。本实验
结果显示珍珠梅醋酸乙酯提取物可以增强 H22荷瘤小鼠的脾指
数和胸腺指数，表明珍珠梅醋酸乙酯提取物可以增强其免疫功
能。
T细胞产生的淋巴因子参与机体免疫，是抗体参与的特异性
免疫。T淋巴细胞转化实验是测定机体细胞免疫功能的重要指
标。本实验结果表明珍珠梅醋酸乙酯提取物能促进 H22荷瘤小
鼠 T淋巴细胞转化率，进而增强小鼠的免疫功能。
NK细胞是机体的重要免疫监视细胞，对肿瘤细胞具有天然
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杀伤作用，主要存在于外周血、脾脏、淋巴结和骨髓细胞中，在体
内发挥重要的免疫监视功能。NK 细胞活性的高低可以反映机
体非特异性免疫功能状况。本实验结果显示，珍珠梅醋酸乙酯提
取物可以增加 H22荷瘤小鼠 NK 细胞的活性，表明轮珍珠梅醋酸
乙酯提取物可以改善小鼠的免疫功能。
本研究初步研究结果表明珍珠梅醋酸乙酯提取物对小鼠的
免疫器官、非特异性免疫和特异性免疫均有一定的促进作用，今
后应对其有效部位和单体成分的免疫作用进行深入研究。
参考文献:
［1］ 江苏新医学院． 中药大辞典［M］． 上海:上海科学技术出版社，
1994:1147．
［2］ 张学武，崔长旭，陈丽艳．珍珠梅提取物抑制肝癌 HepG － 2 细胞增
殖的实验研究［J］．中药材，2007，30(6) :681．
［3］ 蔡 琨，冯 泳，何前松，等．小半夏加茯苓汤对 H22荷瘤小鼠的抑
瘤及免疫调节作用［J］．中医中药，2011，27(7) :1290．
［4］ 景 明，蔺兴遥，刘俊田，等．贞芪扶正分散片对荷瘤小鼠免疫功能
的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2008，14(4) :66．
［5］ 艾金霞，崔焕波． SBHL对 S 180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影
响［J］．中国免疫学学杂志，2010，26(10) :895．
收稿日期:2012-04-23; 修订日期:2012-07-30
基金项目:国家自然科学基金(No． 81001703) ;
安徽省教育厅重点项目(No． KJ 2011A192)。
作者简介:马 丽(1987-) ，女(汉族) ，安徽太湖人，现为安徽中医学院在
读硕士研究生，主要从事纳米制剂研究工作．
* 通讯作者简介:鲁传华(1956-) ，男(汉族) ，安徽无为人，现任安徽中医
学院教授，硕士学位，主要从事纳米制剂和药用材料研究工作．
川芎嗪油基纳米混悬剂在小鼠体内的组织分布研究
马 丽，吴鸿飞，鲁传华* ，那 莎，刘子荣，袁 媛
(安徽中医学院，安徽 合肥 230038)
摘要:目的 研究川芎嗪纳米混悬剂在小鼠体内的组织分布。方法 采用高效液相色谱法测定小鼠血浆和组织中的川芎
嗪浓度，计算药代动力学参数。结果 与川芎嗪片剂混悬液比，川芎嗪在小鼠脾肺脑组织中脑组织药时曲线下面积
(AUC)和平均滞留时间(MRT)有显著性差异。结论 小鼠口服川芎嗪纳米混悬剂后在组织中有较高的药物含量，且维持
时间较长，具有一定的脑靶向性。
关键词:川芎嗪油基纳米混悬剂; 高效液相色谱法; 组织分布; 靶向性
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 10． 014
中图分类号:R62 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)10-2415-02
Tissue Distribution of Etramethylpyrazine Oil Base Nano － suspension in Mice
MA Li，WU Hong-fei，LU Chuan-hua* ，NA Sha，LIU Zi-rong，YUAN Yuan
(Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China)
Abstract:Objective To study the tissue distribution of tetramethylpyrazine lipid base nano － suspension in mice． Methods The
content of tetramethylpyrazine in mouse plasma and tissues were determined by HPLC． The pharmacokinetic parameters were meas-
ured． Results Compared with tetramethylpyrazine suspension water，tetramethylpyrazine lipid base nano － suspension had significant
differences in the tissues of spleen，lung and brain． Conclusion Mice have higher concentration in various tissues after oral adminis-
tration with tetramethylpyrazine nano － suspension． The drug can maintain for a long time，and also shows brain targeting．
Key words:Tetramethylpyrazine lipid base nano － suspension; HPLC; Tissue distribution; Targeting
纳米混悬剂(Nano － suspension NS)具备许多制剂没有的优
势如:增强药物的治疗作用、减少给药量，将药物包裹于内能有效
提高药物的稳定性，具有一定的靶向作用。川芎嗪(tetrameth-
ylpyrazine，TMP)是我国最先从川芎嗪根茎中提取出来的吡嗪类
生物碱，易升华，具有扩张血管、增加动脉血流、抑制血小板聚集
和降低血小板活性等作用，临床上用于治疗心脑血管疾病。但是
川芎嗪易升华，在体内代谢较快，生物利用度低［1］。本实验室研
究的川芎嗪油基纳米混悬剂(TMP NS)将 TMP包裹在大豆油中，
药物性质稳定，不易升华，且在小鼠体内吸收快，生物利用度高，
具有靶向性。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 LC － 10AD型高效液相色谱仪，日本岛津产品;Sarori-
us BP － 211D 电子天平:德国赛多利斯股份公司产品;移液器
100，1 000 μl，德国 Eppendorf 公司产品;TGL － 16C 高速离心机，
上海安亭科学仪器厂产品;WH －3 微型涡旋混合仪，上海沪西分
析仪器厂有限公司产品;Zetasizer Nano ZS90 型激光粒度仪，英国
马尔文公司产品。
1． 2 试剂 大豆卵磷脂(药用口服级) ;注射大豆油;乳酸乙酯
(食用级，国药集团化学试剂有限公司) ;川芎嗪原料药(南京朗
泽医药科技有限公司，纯度≥98%，批号:20100822) ;其他试剂均
为分析纯。
1． 3 动物 健康昆明种小鼠(20 ± 2 )g，雌雄各半(肥东长陵实
验动物科技有限公司提供)。
2 方法
2． 1 TMP NS的制备及粒径的测定 将 TMP溶于乙醇按文献［2］
配置成均匀透明的体系，将乙醇真空抽除，配置成 TMP含量为 10
mg·ml －1的纳米混悬剂。
精密称取 TMP NS 25． 5 mg 于 10 ml 容量瓶中，加入一定量
的环己烷，超声 1 h，用环己烷定容，经 0． 45 μm微孔滤膜滤过后
用 Zetasizer Nano ZS90 型激光粒度仪测定粒径。
2． 2 生物样品中药物浓度的测定 采用 HPLC，色谱条件:Agilent
ZORBAX SB － C18(PN880975 － 902)色谱柱;流动相为甲醇 －水
(40∶ 60) ;流速 1． 0 ml·min －1;柱温 27 ℃;检测波长 280 nm;进
样量 20 μl。
按文献［2］方法配制加入系列浓度标准品的空白生物组织匀浆
液的上清液，进行 HPLC分析。TMP峰形良好，出峰时间在 14 ～ 15
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