全 文 ：Protective Effects of Dracocephalum moldavica L. Flavonoids on Cultured
Cardiomyocytes in Vitro Hypoxia/Reoxygenation
WANG Sheng1,YAO Jiaming1,GUO Xinhong1,XING Jianguo2,WANG Xinchun1，3
(1 School of Pharmacy, Shihezi University,Shihezi 832002，China; 2 Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China;
3 The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832002,China)
Abstract:To explore the protective effect of Dracocephalum Moldavica L.Flavonoids on cultured cardiomyocytes in vitro hypoxia
/reoxygenation (H/R).Primary culture of Wistar Rat cardiomyocytes in vitro and randomized to normal group, model group,
dracocephalum moldavica flavonoids groups with high, middle, and low dose, and positive drug group, according to different
interventions.MTT assay was used to detect the toxic effect of Dracocephalum Moldavica L. Flavonoids on myocardial viability.
Cell supernatant was collected and determinated the Super oxides differences of enzyme (SOD),Malondialdehyde (MDA),lactate
dehydrogenase (LDH),and creatine kinase (CK).Cell modality was detected by HE staining, Bcl- 2,and Bax protein expression
were determined through immunohistochemisty.All groups of Dracocephalum Moldavica L.Flavonoids could reduce the degree of
cardiomyocytes injury compared with the model groups.High and middle dosage of a Dracocephalum Moldavica L.Flavonoids
significantly reduced MDA concentration (P<0.01,P<0.05),reduced LDH level (P<0.01，P<0.05),increased the expression of Bcl- 2
and decreased the expression of Bax protein expression compared with the model group.High dosage of Dracocephalum
moldavica L.Flavonoids increased SOD activity (P<0.01),and reduced CK level (P<0.05).Dracocephalum Moldavica L.Flavonoids
could protect rats cardiomyocytes from hypoxia- reoxygenation injury,the mechanism may relate to influence the expression of
apoptotic protein and remove oxygen free radicals.
Key words：cardiomyocytes；hypoxia/reoxygenation；Dracocephalum moldavica flavonoids
收稿日期：2014-03-13
基金项目：国家自然基金项目（81160525），国家重大新药创制“科技重大专项”（2012ZX09102201-009）
作者简介：王盛（1989-），男，硕士研究生，专业方向为药理学研究。
通信作者：王新春（1969-），女，教授，从事中药民族药研究，e-mail:cwjwxc@163.com。
文章编号：1007-7383（2014）05-0568-05
香青兰总黄酮抗心肌细胞缺氧 /复氧损伤作用的研究
王盛 1，姚佳茗 1，郭新红 1，邢建国 2，王新春 3
（1 石河子大学药学院，石河子 832008；2 新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004；
3 石河子大学医学院第一附属医院，石河子 832002）
摘要：为研究香青兰总黄酮对体外培养心肌细胞缺氧 / 复氧（H/R）损伤的保护作用及其机制。采用体外原代培养
Wistar 大鼠乳鼠心肌细胞建立 H /R 损伤模型，实验分为正常组、模型组、香青兰总黄酮高、中、低剂量组及丹参滴
丸阳性药物对照组。采用 MTT 法测定香青兰总黄酮对心肌细胞的毒性作用；比色法测定培养液中超氧化物歧化酶
（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）的含量；HE 染色法检测细胞形态；免疫组化法测定
Bcl-2、Bax 蛋白表达。结果表明，香青兰总黄酮各给药组均能降低心肌细胞损伤程度，与模型组比较，香青兰总黄酮
高、中剂量组均能够明显降低 MDA 含量（P＜0.01，P＜0.05），降低 LDH 释放量（P＜0.01，P＜0.05），增加 Bcl-2 表
达，减少 Bax 表达；香青兰总黄酮高剂量组可以提高 SOD 活性（P＜0.01），降低 CK 释放量（P＜0.05）。香青兰总黄
酮对大鼠心肌细胞 H/R 损伤有保护作用，其作用机制可能与清除氧自由基和调节凋亡蛋白的表达有关。
关键词：心肌细胞；缺氧 / 复氧；香青兰总黄酮
中图分类号：R284 文献标志码：A
第 32 卷 第 5 期
2014 年 10 月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science)
Vol.32 No.5
Oct. 2014
DOI:10.13880/j.cnki.65-1174/n.2014.05.011
第 5 期
香青兰（Dracocephalum moldovica L.）为唇形科
青兰属一年生草本植物 [1]，又名巴德尔吉布亚，是一
种维吾尔民族药，主要用于治疗冠心病及心绞痛、
高血压、心肌缺血、动脉粥样硬化等疾病 [2]。其化学
成分主要有黄酮类、挥发油、萜类、氨基酸、微量元
素及多肽等 [3]。香青兰总黄酮是香青兰化学成分中
保护心肌最主要的活性成分 [4- 5]，但是香青兰总黄酮
对心肌细胞缺氧 / 复氧损伤（H/R）的保护作用及其
作用机制鲜有文献报道。
本实验通过体外原代培养大鼠心肌细胞，建立
缺氧 / 复氧（H/R）模型，模拟在体心肌缺血再灌注损
伤，旨在探讨香青兰总黄酮预处理对大鼠心肌缺血
再灌损伤的保护作用及其可能的机制 [6]，研究香青
兰总黄酮对缺血再灌注心肌的保护作用，为临床治
疗冠心病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器
倒置显微镜（日本 OLYMPUS公司）；CO2 培养箱
（美国 Thermo公司）；
三气培养箱（美国 Thermo公司）；酶标仪（美国
BIO- RAD公司）。
1.1.2 药物与试剂
香青兰总黄酮提取物（石河子大学自制，批号
20100708）。抗体、免疫组化试剂盒均由武汉博士德
生物公司代理。缺氧缺糖溶液（NaH2PO4、NaHCO3、
CaCl2、MgSO4、乳酸钠、HEPES、NaCl、KCl）；模拟再灌
注溶液 （NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、葡萄糖、
HEPES、NaCl、KCl）。
1.1.3 实验动物
1- 3 日龄 Wistar 大鼠（由新疆医科大学实验动
物中心提供，合格证号：新医动字第 2003- 0001 号）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
取 10- 15 只 1- 3 日龄的 Wistar 大鼠，并将冷的
PBS（4℃）放入三个培养皿中（编为 1、2、3 号），酒精
浸泡乳鼠消毒，放入超净台，从胸部中线打开胸腔，
取出心脏，放于 1 号培养皿中，剪下心脏 1/2- 2/3，转
移到 2 号培养皿中，沿心脏中轴剪两下，轻轻旋动
培养皿，再将 2 号培养皿中的心脏放入 3 号培养皿
中洗净残留血液，放入 PBS/ 胰蛋白酶的离心管中，4
℃摇床过夜。将 DMEM培养基（20% FBS）于 1∶1
的比例加入离心管中，终止消化，再放入 37 ℃水浴
箱中振荡 4- 10 min，吸取离心管中的培养基和胰蛋
白酶，再加入 10 mL PBS/ 胶原酶Ⅱ，于 37 ℃水浴
振荡 15 min，吸取上清液至离心管中，加入 DMEM
培养基（20% FBS），放入 CO2 培养箱，重复 3次，胶
原酶消化后，室温离心（1500 r/min，5 min），弃去上清，
加入 5 mL DMEM培养基（20% FBS）重悬细胞，室
温离心（1500 r/min，5 min）收集细胞，以 5×105/ 孔
的密度接种于 6 孔板中，CO2 培养箱培养，隔天换
培养液，前 3 d 加入终浓度为 0.1 mmol/L Brdu 抑
制纤维细胞生长。
1.2.2 缺氧复氧（H/R）模型的建立
取培养 3 d 的心肌细胞，换用模拟缺氧缺糖溶
液，于持续 95% N2和 5% CO2 平衡的三气培养箱
（37 ℃）中缺氧孵育 3 h 后，再换用模拟再灌注溶
液于 CO2培养箱中复氧孵育 2 h，建立心肌细胞缺
氧 / 复氧损伤模型。
1.2.3 细胞分组与处理
将培养好的心肌细胞随机分为 6 组：正常对照
组：每 24 h 更换正常培养基培养；模型对照组：建
立 H/R 模型；香青兰总黄酮高、中、低剂量组：香青
兰总黄酮 +H/R （给药剂量分别为 200、100、50
μg/mL）；丹参滴丸阳性药物对照组：丹参滴丸（剂量
50 μg/mL）+H/R。
1.2.4 观测指标
1 .2.4 .1 台盼蓝染色
取少量心肌细胞悬液以 0.4%的台盼蓝染料染
色，着色细胞为死细胞，活细胞拒染，在倒置显微镜
下，用血球计数板分别计活细胞数和死细胞数。根
据下式求算细胞活力：
细胞活力 = 活细胞总数 /(活细胞总数 + 死细胞
总数)×100%。
1 .2.4 .2 MTT细胞毒理实验
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方
法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶
能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲
瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联
免疫检测仪在 490 nm 波长处测定其光吸收值，可
间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT
结晶形成的量与细胞数成正比。吸光度 A值即反应
心肌细胞的存活情况。以 MTT实验检测香青兰总黄
酮对心肌细胞的毒性，并以此确定给药量。将在 96
孔板中培养 3 d 的心肌细胞加入含有不同浓度的
香青兰总黄酮的 DMEM培养液，调零组和对照组加
入等体积的培养液（均含 1% DMSO，3%乙醇）。继
续培养 44 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT20 μL，培
养 4 h，弃上清，加 DMSO 150μL/ 孔，震荡 10 min。
待 Formazan 溶解后，酶标仪 490 nm处调零后读取
吸光度（OD）值。按公式计算细胞存活率：细胞存活
率 = 实验孔 A值 / 对照组 A值×100%。
王盛，等：香青兰总黄酮抗心肌细胞缺氧 / 复氧损伤作用的研究 569
石河子大学学报（自然科学版） 第 32 卷
1 .2.4 .3 SOD、MDA、LDH、CK的检测
H/R 结束后，吸取细胞培养液静置后离心（4000
r/min，15 min），取上清培养液置于 - 80 ℃冰箱备
用。按照试剂盒说明书的方法进行检测。
1 .2.4 .4 HE染色观察细胞形态
将心肌细胞接种于盖玻片上，建立 H/R 模型，
取出盖玻片，4 ℃晾干，样品固定（95%乙醇固定 20
min，PBS 洗涤 2 次，每次 1 min），HE 染色，乙醇梯
度脱水，封片，置于倒置显微镜下观察。
1 .2.4 .5 免疫组化法检测 Bcl- 2、Bax 蛋白表达
将心肌细胞接种于盖玻片上，建立 H/R 模型，
取出盖玻片，4 ℃晾干，加 Bcl- 2 及 Bax的一抗，37
℃过夜孵育，PBS冲洗 5 min，加二抗处理 40 min，
染色封片。显示棕黄色颗粒细胞为阳性细胞，将玻
片于光学显微镜下放大 200 倍，根据阳性细胞分布
情况，每片随机选择 5 个阳性视野，每视野计数
Bcl- 2 蛋白阳性表达的细胞数，以平均计算阳性细
胞数所占百分比作为 Bcl- 2 蛋白阳性表达指数
(PEI)。
1.2.5 统计学处理
采用 SPSS 17.0 统计学软件处理，所有实验数
据均以 X±S表示，组间比较用 t 检验，P＜0.05 为
差异有显著性。
2 结果与分析
2.1 细胞培养
成功培养了心肌细胞，细胞自律性搏动良好，趴
足清晰可见，可用于建立 H/R 损伤模型。
2.2 台盼蓝染色
通过计数，每 1000 个细胞中，拒染活细胞超过
900 个，细胞活力达到 90%。
2.3 香青兰总黄酮对心肌细胞的毒性作用
使用 MTT 细胞毒理实验检测不同浓度的香青
兰总黄酮对心肌细胞的存活率的影响，结果（表 1）显
示，香青兰总黄酮 0- 200 μg/mL浓度，心肌细胞存活
率大于 80%，可以将给药浓度定为 0- 200μg/mL。
表 1 香青兰总黄酮对心肌细胞存活率的影响
X±S，n=6
Tab.1 Effects of tatoal flavones from Dracocephalum
moldavica on the Cardiomyocytes living rate
2.4 香青兰总黄酮对 H/R 心肌细胞 MDA
含量及 SOD、LDH、CK活性的影响
与模型组相比较，丹参滴丸组 SOD活性显著
升高（P＜0.05），心肌酶（LDH、CK）释放量显著降低
（P＜0.05），MDA 含量显著降低（P＜0.01）；香青兰
总黄酮高、中剂量组 MDA含量显著降低（P＜0.01，
P＜0.05），心肌酶 LDH 释放量显著降低（P＜0.01，
P＜0.05）；香青兰总黄酮高剂量组 SOD活性显著升
高（P＜0.01），心肌酶 CK释放量显著降低（P＜0.05），
而低剂量组均无显著性差异（表 2）。
表 2 香青兰总黄酮对 H/R 心肌细胞 SOD、M A、LDH、CK 的影响 X±S，n=6
Tab.2 Effects of tatoal flavones fromDracocephaum m ldavicaon the SOD,MDA,LDH,CK



   

  

  

  

  
 
   !  #$
 % &! % %
 ’ ’% $
 % % % %(

) *
  (# !  +$ % + % %$ & %’% &% % & % %’
%% + # ’ #+  % #& % (#  ’ #!% ’  % (& % %& 
(%% ’ &  #’ % +’ % %  ’ +% #  % ($ % %’,-./01

#% ($  ’ ’( % ++ % ( ’ !!% ’& % ( % %’
2345
 #% +  ’ &(  % #+ % %!  ’ &!%   % (’ % %# 
注：与模型组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。

    
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
!
#$
 

2.5 香青兰总黄酮对 H/R 心肌细胞形态的
影响
HE 染色后在倒置显微镜下观察，正常组细胞呈
不规则三角形或梭形趴足较多突起较长，细胞核完
整，胞浆着色均匀，模型组细胞膜破裂，胞浆外流，
细胞形态完全消失，香青兰总黄酮高剂量组细胞变
圆、趴足消失，但仍保留细胞基本形态，中剂量组细
胞膜出现皱缩，胞浆着色不匀，低剂量组细胞完全
皱缩，无法分清细胞核与胞浆（图 1）。
570
第 5 期
A B C
D



E




F
图 1 缺氧 / 复氧心肌细胞模型 HE 染色结果（×100）
Fig.1 HE staining results of H/R cardiomyocytes model
A：正常组；B：丹参滴丸组；C：香青兰总黄酮高剂量组；D：香青兰总黄酮中剂量组；E：香青兰总黄酮低剂量组；F：模型组
王盛，等：香青兰总黄酮抗心肌细胞缺氧 / 复氧损伤作用的研究
2.6 香青兰总黄酮对 H/R 心肌细胞 Bcl- 2
蛋白和 Bax 蛋白表达的影响
在光镜下观察，细胞浆被染为棕黄色为阳性细
胞，与模型组相比，丹参滴丸组抗凋亡蛋白 Bcl- 2 蛋
白表达明显高于模型组（P＜0.01），香青兰总黄酮
高、中剂量组抗凋亡蛋白 Bcl- 2 蛋白表达高于模型
组（P＜0.05，P＜0.01），香青兰总黄酮低剂量组没有
显著性差异；与模型组相比，丹参滴丸组促凋亡蛋
白 Bax蛋白表达低于模型组（P＜0.01），香青兰总黄
酮高、中剂量组促凋亡蛋白 Bax蛋白表达低于模型
组（P＜0.05，P＜0.01），而低剂量组无显著性差异
（表 3）。
表 3 香青兰总黄酮对 H/R 心肌细胞 Bcl- 2 蛋白
和 Bax 蛋白表达的影响 X±S，n=6
Tab.3 Effects of tatoal flavones from Dracocephalum
moldavica on the Bcl- 2 and Bax expression
注：与模型组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。
3 讨论
心肌细胞是构成心脏的主要细胞，其功能状态
基本上反映了心脏的功能状态，离体细胞培养作为
基础研究技术之一，不仅可以排除肌体内各种神经
和体液因子调节或干扰，还以其简单、经济、可靠和
便于控制等优点，被广泛用于医学和生物学的各个
领域 [7]。本实验改进了心肌细胞的培养方法，改用胰
蛋白酶和胶原酶Ⅱ分次消化，从而缩短了消化时
间，减轻酶对心肌细胞的损伤，细胞数量增多，细胞
活力显著优于使用传统方法培养的心肌细胞。
心肌细胞 H/R 损伤之后，心肌细胞明显受损。
主要表现为：心肌细胞爬足皱缩，细胞变圆，搏动减
弱，搏动次数明显减少，细胞膜破裂，胞浆外流。心
肌细胞 H/R 损伤的机制可能与氧自由基的大量产
生，促凋亡蛋白的表达及细胞膜通透性增加有关。
HE 染色结果可以看出模型组细胞损伤严重，细胞
膜破裂，完全失去细胞形态，香青兰总黄酮高剂量
组明显改善，细胞形态完整，细胞核与胞浆染色均
匀，中剂量组细胞形态发生变化，细胞皱缩，但仍保
持完整。
心肌细胞 H/R 损伤模型是模拟在体心肌缺血再
灌注损伤，细胞内自由基的生成和堆积与心肌缺血再
灌注损伤密切相关 [8]，MDA是生物膜发生脂质过氧化
反应的代谢产物其含量的变化间接反应了组织中
自由基含量及肌体内环境中氧化应激状态 [9]，SOD
可直接清除超氧阴离子，是维持机体氧化还原平衡
状态的重要抗氧化酶之一 [10]，心肌细胞膜的完整结
构是其正常行使生理功能的基础，细胞膜的完整结
构被破坏，通透性增加，导致细胞内 LDH 和 CK 的
渗漏 [11- 12]本研究使用体外培养的心肌细胞缺氧复氧
H/R 模拟再灌注损伤，对自由基清除酶 SOD，脂质过
氧化产物 MDA以及影响细胞膜的酶以及影响心肌
酶 LDH、CK进行检测。香青兰总黄酮高、中剂量组
相对于模型组 SOD活力提高，MDA 释放减少，LDH
与 CK含量降低，证明香青兰总黄酮对心肌酶的释
放有抑制作用，可以提高 SOD的活性，减轻 H/R 对
心肌细胞的损伤。由此可见，香青兰总黄酮抗心肌
细胞缺氧复氧损伤的机制可能与提高 SOD 活性来



  
ⅡⅡ
Ⅱ
ⅡⅡ
Ⅱ
ⅡⅡ
 Ⅱ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ
 ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ 
ⅡⅡ
 Ⅱ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ
ⅡⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ  ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ 
ⅡⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ  ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ 
ⅡⅡⅡ
ⅡⅡⅡ

ⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ 
ⅡⅡⅡⅡ
 ⅡⅡ ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ  ⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡⅡ 

571
石河子大学学报（自然科学版） 第 32 卷
降低脂质过氧化损伤，同时减轻了了过氧化损伤对
细胞膜的损害有关。
Bcl- 2 蛋白与 Bax蛋白与细胞凋亡密切相关，其
中 Bcl- 2 蛋白为抗凋亡蛋白，Bax 蛋白为促凋亡蛋
白，Bcl- 2 蛋白高表达，证明凋亡指数低，Bcl- 2 蛋白
低表达或不表达，则证明凋亡指数高，Bax 蛋白与
Bcl- 2 蛋白相反，实验结果显示，香青兰总黄酮高、
中剂量组 Bcl- 2 蛋白表达均高于模型组，Bax蛋白表
达低于模型组，香青兰总黄酮保护心肌细胞的机制
还可能与影响凋亡蛋白的表达有关。
参考文献：
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］·1版.北京：化
学工业出版社，1979:416.
［2］ 国家药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准维吾
尔药分册［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1998:73.
［3］ 冯长根，李琼.香青兰化学成分与药理活性研究综述［J］.
中成药，2003，25(2:)155-157.
［4］ 曹文疆，邢建国，王新春，等.香青兰总黄酮对TNF-α诱
导的大鼠血管平肌细胞增殖的影响［J］.中国实验方剂学
杂志，2011，17(21):159-162.
［5］ 邢建国，康小龙，何承辉，等.香青兰有效部位滴丸对犬急
性实验性缺血心肌的保护作用［J］. 中国药学杂志，
2011，46(15):1162-1165.
［6］ 樊鑫梅，曹文江，邢建国，等.香青兰总黄酮对大鼠心肌缺
血再灌注损伤保护作用的研究［J］.中成药，2013，35（8）：1626
-1629.
［7］ Himpens B，Somlyo A P.Free calcium and force transients
during de-polarization and pharmacomechanical coupling
in guinea pig smoothmuscule［J］.Physio，1988，395(2):507
-530.
［8］ 许波华，许立.中药抗心肌缺血作用机制的研究进展［J］.
中国实验方剂学杂志，2011，17(15):265-269.
［9］ 于拔萃，曹国珍，田卉，等. 菟丝子醇提液对大鼠离体心缺
血再灌注损伤保护作用［J］.石河子大学学报：自然科学
版，2013，31（2）：213-216.
［10］付伟，刘彩玉，刘婷，等. 薰衣草花抗大鼠心肌缺血再灌注
损伤作用［J］. 石河子大学学报：自然科学版，2010，28
（6）：735-739.
［11］Woo A Y，Cheng C H，Waye M M. Baicalein protects rat
cardiomyo-cytes from hypoxia /reoxygenation damage via
a prooxidant mechanism ［J］.Cardiovasc Res，2005，65(1):
244-248.
［12］ Sharikabad M N，Ostbye K M，Brors O.Effect of hydrogen
peroxideon reoxygen ation-induced Ca2+accumulation in
rat cardiomyocytes［J］.Free Radic Biol Med，2004，37(4):
531-535.
572