全 文 ：◇ 基础研究 ◇
中国临床药理学与治疗学
中国药理学会主办
ＣＮ ３４－１２０６／Ｒ，ＩＳＳＮ １００９－２５０１
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｐｔ．ｃｏｍ
２０１２Ａｕｇ；１７（８）：８６０－８６７
２０１２－０２－０３收稿 ２０１２－０５－１０修回
陈良金，男，副教授，研究方向：中医内科基础与临床。
Ｔｅｌ：１５５７２７６１１０６ Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｌｊｃｙ＠１２６．ｃｏｍ
石孟琼，通信作者，女，实验师，研究方向：心脑血管药理。
Ｔｅｌ：１３６８７２２０９０２ Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｍｑ０２１２＠１２６．ｃｏｍ
珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２诱导
新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用
陈良金１，石孟琼１，贺海波２，熊兴军３，卢训丛１
１三峡大学医学院，宜昌４４３００２，湖北；２三峡大学天然产物研究与利用湖北省
重点实验室，宜昌４４３００２，湖北；３长阳县中医院，长阳４４３００６，湖北
摘要 目的：观察珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 诱导新
生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用，并探讨其作用
机制。方法：Ｗｉｓｔａｒ乳鼠心肌细胞原代培养，用
Ｈ２Ｏ２ 建立氧化应激损伤模型，然后用珠子参总
皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）孵育２４ｈ后，ＭＴＴ法检
测珠子参总皂苷对细胞活力的影响，流式细胞仪
和 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色检测珠子参总皂苷对氧化
应激诱导细胞凋亡及胞内ＲＯＳ含量的影响，比色
法测定心肌细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９的活性，荧
光定量ＰＣＲ测定心肌细胞Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ ｍＲＮＡ
表达，并计算Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ的比值。结果：珠子参
总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）能显著改善心肌细胞
活性，有效保护线粒体膜电位的稳定，抑制心肌细
胞凋亡和改善细胞形态，降低细胞内活性氧
（ＲＯＳ）含量；下调Ｂａｘ ｍＲＮＡ 表达，上调Ｂｃｌ－２
ｍＲＮＡ表达及Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ的比值；降低 Ｈ２Ｏ２
所致新生大鼠心肌细胞中 Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９
的活性。结论：珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 诱导心肌
细胞凋亡有显著的抑制作用，其机制可能与其稳
定心肌细胞膜、清除ＲＯＳ及调节心肌细胞Ｂｃｌ－２、
Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９表达有关。
关键词 珠子参总皂苷；Ｈ２Ｏ２；心肌细胞；凋亡；
Ｂｃｌ－２；Ｂａｘ；Ｃａｓｐａｓｅ－３；Ｃａｓｐａｓｅ－９
中图分类号：Ｒ９６５．２
文献标识码：Ａ
文 章 编 号：１００９－２５０１（２０１２）０８－０８６０－０８
活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）是心
脏疾病发生及诱导心肌细胞死亡的主要因素之
一。正常情况下，它在心肌细胞内氧化代谢中产
生和消除是平衡的，但是在氧化应激情况下会导
致ＲＯＳ在心肌细胞内过量聚集，引起细胞毒性。
研究表明它的大量堆积可造成心肌细胞能量代谢
障碍，最终导致细胞凋亡和坏死，当前其已成为心
肌缺血损伤的重要原因之一［１］。因此，清除心肌
组织内过量产生和蓄积的ＲＯＳ，抑制心肌细胞凋
亡将是有效防治心肌缺血性损伤的重要手段。珠
子参（Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉｚｏｍａ）是土家族、苗族民
间传统习用的益气活血中药，具补肺养阴、祛瘀止
痛、止血之功，主要用于气阴两虚、烦热口渴，虚劳
咳嗽、跌扑损伤、关节痹痛、咳血、吐血、衄血、崩
漏、外伤出血、心悸等症［２－３］。实验研究表明，其
主要成分珠子参总皂苷对心肌缺血再灌损伤具有
较好的保护作用［４］，我们在前期研究中也观察到
珠子参总皂苷对小鼠局灶性脑缺血损伤有明显保
护作用，并初步证实了抗氧化损伤可能是其作用
机制之一［５］，但珠子参总皂苷对氧化应激引起离
体心肌细胞凋亡的影响未见报道。本实验利用
Ｈ２Ｏ２ 诱导乳大鼠心肌细胞损伤模型，观察珠子
参总皂苷是否对 Ｈ２Ｏ２ 诱导的新生大鼠心肌细胞
凋亡具有抑制作用，并探讨其可能的作用机制。
·０６８·
１ 材料与方法
１．１ 药品 珠子参总皂苷的制备参见我们前期
发表的文章［５］，其为淡黄色粉末，实验时以培养液
配制成所需浓度，经过０．２２μｍ 孔径滤膜过滤除
菌后使用。
１．２ 动物 出生１～３ｄ的 Ｗｉｓｔａｒ大鼠，ＳＰＦ
级，雌雄不拘，由湖北省疾病控制中心实验动物中
心提供，合格证：ＳＣＸＫ（鄂）２００８－０００５。
１．３ 试剂与仪器 Ｈ２Ｏ２（国药集团）；ＤＭＥＭ 培
养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ）；ＤＭＳＯ、四氮
唑蓝（ＭＴＴ）、２＇－７＇－二氯荧光乙酰乙酸盐（ＤＣＦＨ－
ＤＡ）和线粒体膜电位检测试剂盒（ＪＣ－１）（Ｓｉｇｍａ）；
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（凯基生物）；Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＦＩＴＣ（晶
美生物）；Ｃａｓｐａｓｅ－３及Ｃａｓｐａｓｅ－９活性检测试剂
盒（碧云天）；Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ以及 ＧＡＰＤＨ 引物合成
（上海生工）；Ｔｒｉｚｏｌ裂解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）；Ｐｒｉｍｅ
ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 （大
连宝生物）；其他试剂均为市售分析纯。ＧＥＮｉｏｓ
酶标仪（瑞士 Ｔｅｃａｎ公司）；ＥＰＩＣＳ ＸＬ－４流式细
胞仪、荧光检测仪（美国Ｂａｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；
ＣＫＸ４１倒置显微镜（日本，奥林巴斯）；ＮＵ－４７５０Ｅ
型ＣＯ２ 培养箱（Ｎｕ Ａｉｒｅ公司）；ＳＷ－４Ｔ－２Ｆ洁净
工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；
ＬＳ－Ｂ５０Ｌ立式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核
子仪器有限公司）；ＣＤＦ－３２２０多元定量ＰＣＲ仪
（美国 ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司）；Ｇｅｎｅ Ｇｅｎｉｕｓ凝胶分
析系统（英国ＳＹＮＧＮＥ公司）。
１．４ 新生大鼠心肌细胞的分离培养［６］ 取１～
３ｄ龄的 Ｗｉｓｔａｒ大鼠乳鼠，在无菌条件下取出心
脏，剪刀破碎至１ｍｍ３大小，加入约心脏１０倍体
积用的胰酶和胶原酶的混合酶（胰酶终浓度为
０．０８％，胶原酶终浓度是０．０１％）分次消化，收集
消化液至离心管中，加入１５％胎牛血清终止消
化，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，细胞沉淀用
含１５％血清的ＤＭＥＭ 培养液重悬，接种于培养
瓶中，在ＣＯ２ 孵箱中（３７℃，９５％空气－５％ ＣＯ２
条件下）培养１．５ｈ，用差速贴壁法出除成纤维细
胞等非心肌细胞。心肌细胞悬液计数，用含１５％
胎牛血清的ＤＭＥＭ 培养液稀释至所需的细胞密
度，接种到９６孔培养板（细胞密度５×１０４ 个／
ｍＬ，每孔１００μＬ）或６孔培养板（细胞密度３×
１０５ 个／ｍＬ，每 孔 １ ｍＬ）中，于 ＣＯ２ 孵 箱 中
（３７℃，９５％空气－５％ＣＯ２ 条件）培养。隔日更换
培养基，生长３～４ｄ，待细胞融合贴满瓶底，且有
节律同步搏动时，然后进行分组和给药实验。
１．５ 珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞的影
响［７］ 为了考查珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细
胞活性是否存在潜在的影响，我们先进行珠子参
总皂苷对新生大鼠心肌细胞活力的潜在影响测
试。取在９６孔板中培养的原代心肌细胞，贴壁
后，分别加入不同浓度（０、２５、５０、１００、２５０、５００、
１０００μｇ／ｍＬ）珠子参总皂苷，孵育２４ｈ，测定细
胞活力。具体方法如下：孵育完毕后，向各孔细胞
中加入２０μＬ ＭＴＴ（５ｇ／Ｌ），继续培养４ｈ，弃去
培养液，加入１５０μＬ ＤＭＳＯ溶液，振荡１０ｍｉｎ，
然后用酶标仪测定５７０ｎｍ 的光密度值，按下式
求得心肌细胞的存活率：存活率＝（各组细胞光密
度值／正常组细胞光密度值）×１００％。
１．６ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致氧化损伤的影响
１．６．１ 分组及给药 新生大鼠心肌细胞培养参
照文献［７］的方法，并略加改进。将接种于９６孔或
６孔培养板中的各组心肌细胞采用完全随机设计
分组法分为正常组、模型组、珠子参总皂苷低和高
剂量组；模型组和珠子参总皂苷治疗组先用
５００μｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ２Ｏ２ 浓度作用２ｈ，更换培养液
后，珠子参总皂苷低、高剂量分别加入 １００、
２００μｇ／ｍＬ珠子参总皂苷，孵育２４ｈ，然后进行
相应的实验。
１．６．２ 心肌细胞存活率 接种于９６孔培养板中
的各组心肌细胞经过相应处理后，进行心肌细胞
活力测定，具体方法检测方法同“１．５”。
１．６．３ 心肌细胞内ＲＯＳ含量检测［８］ 各组心肌
细胞经过相应处理后，收集细胞，用０．０２％ＥＤ－
ＴＡ消化细胞，用无血清培养基重悬，终浓度
１０μｍｏｌ／Ｌ的ＤＣＦＨ－ＤＡ ３７℃ 孵育１ｈ，用ＰＢＳ
清洗２遍，流式细胞仪（激发光波长４８８ｎｍ）检
测，每个样品收集１×１０４ 个细胞，用Ｃｅｌ Ｑｕｅｓｔ
软件分析结果。
１．６．４ 心肌细胞凋亡形态观察［９］ 将上述各组
处理过的细胞用０．１２５％胰蛋白酶消化后收集，
用３７℃ 的ＰＢＳ冲洗２４孔板２次，加入１ｍＬ的
４％的多聚甲醛于４℃ 固定１０ｍｉｎ，自然晾干，
每孔加入终浓度为１０ｍｇ／Ｌ的 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染
·１６８·中国临床药理学与治疗学２０１２Ａｕｇ；１７（８）
液１００μＬ，室温避光染色１０ｍｉｎ，水冲净晾干，
激发光波长４５０ｎｍ，发射光波长４９０ｎｍ。荧光
显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。
１．６．５ 细胞凋亡检测［１０］ 各组心肌细胞经过相
应处理后，收集细胞，用０．０２％ＥＤＴＡ消化，制备
细胞悬液，１０００ｒ／ｍｉｎ 离心 ７ｍｉｎ，弃上清液，
ＰＢＳ洗涤，收集细胞，在冰水浴中进行下述操作：
用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ试剂盒中ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ悬
浮细胞，调节细胞浓度为１×１０６／ｍＬ，取１００μＬ
上述细胞，分别按试剂盒说明加入ＰＩ和Ａｎｎｅｘｉｎ
Ⅴ－ＦＩＴＣ，混匀后室温避光１５ｍｉｎ后，用流式细
胞仪检测细胞凋亡。
１．６．６ 线粒体功能检测［１１］ 各组心肌细胞经过
相应 处 理 后，用 ０．１２５％ 胰 蛋 白 酶 消 化 后，
１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，ＰＢＳ洗涤，收
集细胞，用不含血清的ＤＭＥＭ 培养基悬浮细胞，
调节细胞浓度为１×１０６／ｍＬ，取１００μＬ 上述细
胞，加入ＪＣ－１（１ｍｇ／Ｌ）１０μＬ，３７℃ 避光孵育
１０ｍｉｎ，上机检测。
１．６．７ Ｃａｓｐａｓｅ活性检测 各组心肌细胞经过
相应处理后，用０．１２５％胰蛋白酶消化后，离心
（６００ ｇ，４℃，５ｍｉｎ），吸除上清，ＰＢＳ洗１次，收
集细胞每份样品加入５０μＬ细胞裂解液，冰上孵
育１５ｍｉｎ，离心（２００００ ｇ，４℃，１５ｍｉｎ），进行
Ｃａｓｐａｓｅ活性检测。具体方法按照试剂盒说明书
进行。按下式求得Ｃａｓｐａｓｅ活性：Ｃａｓｐａｓｅ活性＝
ＯＤ４０５ｎｍ／ＯＤ５９５ｎｍ。
１．６．８ 荧光定量ＰＣＲ测定Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ ｍＲＮＡ表
达 用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取心肌细胞总ＲＮＡ，按说明
书操作，整个过程在冰浴中进行；总ＲＮＡ经紫外
分光光度计测定２６０ｎｍ 与２８０ｎｍ 处光密度比
值 （Ａ２６０／Ａ２８０）为１．８～２．０。采用逆转录酶及随
机引物进行逆转录反应，严格按逆转录试剂盒说
明书操作实时荧光定量ＰＣＲ引物表达序列信息
来源于 Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ，使用Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软
件设计，由上海生工生物工程有限公司合成Ｂｃｌ－２
序 列 （２０２ｂｐ）：上 游 引 物 ＣＧＡＣＴＴＴＧ－
ＣＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡ，下 游 引 物 ＣＡＴＣＣＡＣＡ－
ＧＡＧＣＧＡＴＧＴＴＧＴ；Ｂａｘ序列（２０７ｂｐ）：上游引
物 ＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＧＣＴＧＡ，下游引物
ＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣ；ＧＡＰＤＨ 序列
（３４３ｂｐ）：上 游 引 物 ＧＣＴＧＧＧＧＣＴ ＣＡＣＣＴ－
ＧＡＡＧＧ ；下游引物 ＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡ－
ＣＡＧＣＣ采用高温启动法进行实时荧光定量ＰＣＲ
循环，扩增的每个标准均设内参对照，每个指标均
有正常组作对照进行ＰＣＲ循环扩增，循环条件：
９５℃ 预变性 ３０ｓ、９５℃ 变性 ５ｓ、６０℃ 退火
３０ｓ、７２℃ 延伸４０ｓ，扩增４０次。实时荧光定量
ＰＣＲ仪汇出扩增曲线图，从而进行结果分析，根
据公式 ΔΔＣｔ＝（Ｃｔ，ｔａｒｇｅｔ－Ｃｔ，ａｃｔｉｎ）ＴｉｍｅＸ－ （
Ｃｔ，ｔａｒｇｅｔ－Ｃｔ，ａｃｔｉｎ）Ｔｉｍｅ０，应用公式２－ΔΔＣｔ计算
并分析各基因表达的差异性。
１．７ 统计学分析 每项试验至少重复３次，所有
实验结果的数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，所
有数据分析在ＳＰＳＳ １３．０统计软件包上进行单因
素方差分析及ＬＳＤ－ｔ检验，Ｐ＜０．０５认为差异有
统计学意义。
２ 结果
２．１ 珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活性的
影响 通过用 ＭＴＴ法进行珠子参总皂苷对新生
大鼠心肌细胞活性分析，我们发现在珠子参总皂
苷在２５～１０００μｇ／ｍＬ浓度范围内孵育２４ｈ，对
新生大鼠心肌细胞没有明显的细胞毒性，相反，珠
子参总皂苷还可以提高心肌细胞细胞活力，与珠
子参总皂苷０μｇ／ｍＬ组比较具有统计学差异（Ｐ
＜０．０５，Ｐ＜０．０１），而且随着剂量的增加，其作用
增强（图１）。
图１ 珠子参总皂苷对新生大鼠心肌细胞活性的影响（ｘ
±ｓ，ｎ＝３）
与珠子参总皂苷０μｇ／ｍＬ组相比较ｂ Ｐ＜０．０５，ｃ Ｐ＜０．０１
２．２ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤的影响 模型组心肌细胞经 Ｈ２Ｏ２ 氧化损
伤后细胞活性明显下降，与正常组比较极具有统
·２６８· Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２Ａｕｇ；１７（８）
计学差异（Ｐ＜０．０１）；用珠子参总皂苷（１００，
２００μｇ／ｍＬ）处理后，心肌细胞活性分别提高了
４４．２％和５１．６％，与模型组比较极具有统计学差
异（Ｐ＜０．０１，图２）。
图２ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞损伤细胞活性的
影响（ｘ±ｓ，ｎ＝５）
与正常组比较ｃ Ｐ＜０．０１；与模型组比较ｆ Ｐ＜０．０１
２．３ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤细胞内 ＲＯＳ的影响 心肌细胞经 Ｈ２Ｏ２
处理后，模型组细胞内的ＲＯＳ急剧增加（平均荧
光强度为５６．３２±３．１７），与正常组（平均荧光强
度为１１．５７±２．８２）比较，极具有统计学差异（Ｐ＜
０．０１）；用珠子参总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）处理
后，平均荧光强度分别降为３０．１６±２．１９、２７．３９±
１．９６，与模型组比较极具有统计学差异（Ｐ＜
０．０１）。实验结果表明珠子参总皂苷具有清除
ＲＯＳ的能力。
２．４ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤细胞形态的影响 各组心肌细胞经 Ｈｏ－
ｅｃｈｓｔ ３３２５８染色之后，于荧光显微镜下观察，正
常组细胞核为细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，形
状规则的椭圆形核；模型组细胞核或细胞质皱缩
成致密的颗粒块状，蓝色荧光比正常细胞要强，
见到凋亡细胞中分散着较多的 ＤＮＡ 荧光碎片。
用珠子参总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）处理后凋亡细
胞数量少于模型组，大部分细胞染色质呈弥漫均
匀低强度荧光，核固缩细胞数目显著减少，染色质
边聚和核碎片减少，大多数细胞核形态趋于正常
（图３）。研究证实珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌
细胞氧化应激损伤较好的保护作用。
图３ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应激损伤细胞形态的影响
Ａ：正常组；Ｂ：模型组；Ｃ：珠子参总皂苷低剂量组；Ｄ：珠子参总皂苷高剂量组
２．５ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞凋亡的
影响 由表１可知：模型组心肌细胞凋亡率显著
高于正常组，实验结果表明 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞细
胞凋亡发生；经珠子参总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）
处理后，观察到珠子参总皂苷能有效地减少细胞
凋亡，与模型组比较极具有统计学差异（Ｐ＜
０．０１）。
２．６ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤线粒体膜电位的影响 如表１所示，Ｈ２Ｏ２
致心肌细胞氧化应激损伤线粒体膜电位快速下
降，与正常组比较极具有统计学差异（Ｐ＜０．０１）。
珠子参总皂苷处理组（１００，２００μｇ／ｍＬ）心肌细胞
线粒体膜电位均有改善作用，其中以珠子参总皂
苷高剂量疗效更为显著，与模型组比较极具有统
计学差异（Ｐ＜０．０１）。提示珠子参总皂苷具有保
护线粒体，减轻过 Ｈ２Ｏ２ 对心肌细胞线粒体的毒
性作用。
２．７ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９活性的影响
由表 ２ 可知，模型组心肌细胞中 Ｃａｓｐａｓｅ－３、
·３６８·中国临床药理学与治疗学２０１２Ａｕｇ；１７（８）
Ｃａｓｐａｓｅ－９活性分别升高了８２．３％和８５．０％，与
正常组比较具有统计学差异（Ｐ＜０．０１）。用珠子
参总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）处理后可使心肌细胞
中Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９活性分别降低１６．２％、
２９．６％和１１．９％、２１．０％，与模型组比较，除珠子
参总皂苷低剂量组Ｃａｓｐａｓｅ－９无统计学差异外，
其它均具有统计学差异（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），其
中以珠子参总皂苷高剂量更为显著。
表１ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞凋亡率、线粒体膜电位的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 剂量（μｇ／ｍＬ） 凋亡率（％） 膜电位（ｍＶ）
正常组 － ４．７±１．２ １７３±１３
模型组 － ３２．３±２．５ｃ １１７±１２ｃ
珠子参总皂苷低剂量组 １００ ２１．６±１．６ｆ １３４±１０
珠子参总皂苷高剂量组 ２００ ２０．０±１．０ｆ １４５±１２ｆ
与正常组相比较ｃ Ｐ＜０．０１；与模型组比较ｆ Ｐ＜０．０１
表２ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应激损伤细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９活性的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 剂量（μｇ／ｍＬ） Ｃａｓｐａｓｅ－３（Ｕ／ｍＬ） Ｃａｓｐａｓｅ－９（Ｕ／ｍＬ）
正常组 － ５７±６ ６９±８
模型组 － １０５±９ｃ １２８±１１ｃ
珠子参总皂苷低剂量组 １００ ８８±９ｅ １１３±９
珠子参总皂苷高剂量组 ２００ ７４±７ｆ １０１±９ｆ
与正常组相比较ｃ Ｐ＜０．０１；与模型组比较ｅ Ｐ＜０．０５，ｆ Ｐ＜０．０１
２．８ 珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应
激损伤细胞Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达的影响 如表
３和图４所示，模型组心肌细胞中Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ
表达量降低，Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达量增加，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ
的比值降低，与正常组比较极具有统计学差异（Ｐ
＜０．０１）。用珠子参总皂苷（１００，２００μｇ／ｍＬ）处
理后可使心肌细胞中Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达量升高，
Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达量降低，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ的比值升高，
与模型组比较具有统计学差异（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜
０．０１），其中以珠子参总皂苷高剂量更为显著。
表３ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应激损伤细胞Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 剂量（μｇ／ｍＬ） Ｂｃｌ－２／ＧＡＰＤＨ Ｂａｘ／ＧＡＰＤＨ Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ
正常组 － ０．７９±０．０５ ０．６２±０．０４ １．２７±０．０２
模型组 － ０．５１±０．０３ｃ １０．９３±０．０３ｃ ０．５５±０．０２ｃ
珠子参总皂苷低剂量组 １００ ０．６２±０．０４ｅ ０．８０±０．０５ｅ ０．７８±０．０６ｆ
珠子参总皂苷高剂量组 ２００ ０．７０±０．０３ｆ ０．７４±０．０２ｆ ０．９７±０．０７ｆ
与正常组相比较ｃ Ｐ＜０．０１；与模型组比较ｅ Ｐ＜０．０５，ｆ Ｐ＜０．０１
图４ 珠子参总皂苷对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞氧化应激损伤细
胞Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达的影响
３ 讨论
近年来，ＲＯＳ对心脏的损伤作用已引起广泛
重视。在正常情况下，心肌细胞在正常氧化代谢
中会产生少量的 ＲＯＳ，通过细胞内的防御机制
（内源性ＲＯＳ清除酶类和抗氧化剂）以维持ＲＯＳ
产生和清除的平衡，但在一些损伤因素（如缺血缺
氧或炎症等）的作用下，细胞内氧化代谢物增加，
或细胞中抗氧化保护机制不足时，ＲＯＳ产生堆积
会对细胞产生毒性，引起细胞死亡。Ｈ２Ｏ２是体内
氧化还原代谢的中间产物，同时又是一种ＲＯＳ，
·４６８· Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２Ａｕｇ；１７（８）
当它在体内积累到一定程度可对机体细胞产生损
伤作用。Ｈ２Ｏ２ 不仅能直接氧化细胞膜上的脂质
及蛋白，而且能自由穿过细胞膜和细胞内铁离子
反应生成ＯＨ－等活性更强的自由基，导致系列反
应。目前 Ｈ２Ｏ２ 可以诱导心肌细胞凋亡已为众多
的实验所证明［１２］。因此，本实验利用过 Ｈ２Ｏ２ 诱
导乳大鼠心肌细胞损伤模型，研究珠子参总皂苷
对Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞凋亡的抑制作用，在此基础
上探讨并探讨其可能的作用机制。
珠子参具有较广泛的药理作用，对消化系统、
中枢神经系统、心脑血管系统、免疫系统等具有广
泛的药理作用［１３－１４］。我们前期研究发现珠子参
及其主要成分珠子参总皂苷对心脑缺血性损伤具
有较好的保护作用，并初步证实了抗氧化损伤可
能是其作用机制之一［３，５］。本实验将在此基础上
进一步证实其对心肌细胞凋亡的抑制作用及可能
的作用机制，实验结果表明，珠子参总皂苷对
Ｈ２Ｏ２ 致心肌细胞凋亡具有显著的改善作用，能
有效地清除心肌细胞在 Ｈ２Ｏ２ 攻击下过量产生的
ＲＯＳ，提高心肌细胞活性；在受损的心肌细胞形态
学分析中，我们发现珠子参总皂苷能显著改善心
肌细胞折光率，减少胞浆空泡形成，抑制细胞脱
落、悬浮、溶解坏死的发生，显示出其对 Ｈ２Ｏ２ 所
致心肌细胞凋亡具有较好的抑制作用。
研究表明，ＲＯＳ与心肌细胞凋亡密切相关。
心肌细胞内过量产生的ＲＯＳ能够损害线粒体膜
并且减低线粒体膜电势，改变线粒体膜的通透性，
进而通过线粒体信号转导通路、Ｐ５３通路及 ＮＦ－
κＢ通路引起心肌细胞凋亡［１５］，而Ｂｃｌ－２家族参与
被认为是心肌细胞凋亡发生的主要机制［１６］。Ｂｃｌ－
２家族被分为抗凋亡蛋白（Ｂｃｌ－２、ＢＣＩ－ＸＬ、ＢＣＬ－Ｗ
等）和促凋亡蛋白（Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ等），促凋亡蛋
白转位到线粒体膜上，促进线粒体内的凋亡蛋白
释放。抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白结合，阻止其促
凋亡作用。在Ｂｃｌ－２家族中，Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ是其最
重要的成员，其比值直接决定了细胞在接受凋亡
信号的发展方向，Ｂｃｌ－２占优势则存活，Ｂａｘ占优
势则死亡。正常情况下，心肌细胞中有一定量的
Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ表达，当心肌过氧化损伤时Ｂｃｌ－２蛋
白表达显著下调，而Ｂａｘ蛋白表达显著上调，同
时细胞凋亡率增加还与Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ的比值呈负相
关［１０，１７］。本研究用流式细胞仪和荧光定量ＰＣＲ
分别检测了心肌细胞在 Ｈ２Ｏ２ 致氧化应激损伤后
线粒体膜电位和Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达，结果发
现模型组线粒体膜电位明显下降，用珠子参总皂
苷处理后线粒体膜电位显著回升。模型组的Ｂａｘ
ｍＲＮＡ表达水平明显增加，Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达和
Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ的比值显著降低；而珠子参总皂苷
则可显著下调Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达，上调Ｂｃｌ－２ｍＲ－
ＮＡ表达及Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ的比值。实验提示珠子
参总皂苷对氧化损伤心肌细胞凋亡的抑制作用可
能与恢复线粒体膜电位及影响Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ表达
有关。
Ｂｃｌ－２家族在细胞凋亡的线粒体信号通路上
游过程发挥作用，而Ｃａｓｐａｓｅ蛋白激酶家族则在
下游发挥作用，在这一过程中有多种促凋亡和抗
凋亡的蛋白相互作用，两者失调导致细胞凋亡。
Ｂｃｌ－２蛋白主要在凋亡的上游过程发挥作用，它与
Ｂａｘ蛋白结合形成异二聚体，抑制了 Ｂａｘ蛋白的
促凋亡作用；同时Ｂｃｌ－２蛋白亦可直接或间接抑
制线粒体膜渗透性转移孔道复合物的开放，阻止
后继的细胞色素Ｃ、凋亡诱导因子及其他促凋亡
蛋白酶因子－１、Ｃａｓｐａｓｅ－９结合成三元复合物，阻
止Ｃａｓｐａｓｅ－９激活，两者均使 Ｃａｓｐａｓｅ－３不能激
活，因而细胞凋亡受到抑制［１８］。有研究表明［１９］氧
化应激可激活线粒体信号通路，而线粒体依赖的
Ｃａｓｐａｓｅｓ激活途径依赖于线粒体细胞色素Ｃ释
放到胞浆，触发Ｃａｓｐａｓｅｓ的级联效应，首先激活
Ｃａｓｐａｓｅ－９，然后它进一步激活Ｃａｓｐａｓｅ－３启动线
粒体信号通而引发细胞凋亡［２０］。因此激活
Ｃａｓｐａｓｅ－９及Ｃａｓｐａｓｅ－３是细胞凋亡的必经之路。
本实验结果显示，Ｈ２Ｏ２ 作用后，心肌细胞中
Ｃａｓｐａｓｅ－９及Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性显著升高，证明氧
化应激不但可激活线粒体上游Ｂｃｌ－２家族信号通
路，而且还可激活下游的Ｃａｓｐａｓｅ蛋白激酶家族
信号通路。用珠子参总皂苷处理后Ｃａｓｐａｓｅ－９及
Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性显著降低。
综上所述，珠子参总皂苷对 Ｈ２Ｏ２ 致新生大
鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用。它通过抑制心肌
细胞内ＲＯＳ的产生与聚集，恢复线粒体正常膜电
位，下调Ｂａｘ ｍＲＮＡ表达，上调Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表
达和Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ的比值以及降低Ｃａｓｐａｓｅ－９及
Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性，进而提高心肌细胞存活率，抑
制心肌细胞凋亡而发挥对氧化应激损伤心肌细胞
·５６８·中国临床药理学与治疗学２０１２Ａｕｇ；１７（８）
的保护作用。本研究为珠子参总皂苷防治心血管
疾病的临床应用提供一定的理论基础和实验依
据。
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·６６８· Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２Ａｕｇ；１７（８）
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉｚｏｍａ ａ－
ｇａｉｎｓｔ Ｈ２Ｏ２－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ－ｊｉｎ１，ＳＨＩ Ｍｅｎｇ－ｑｉｏｎｇ１，ＨＥ Ｈａｉ－ｂｏ２，ＸＩＯＮＧ Ｘｉｎｇ－ｊｕｎ３，ＬＵ Ｘｕｎ－ｃｏｎｇ１
１ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈｉｎａ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；２ Ｈｕｂｅｉ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈｉｎａ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；３ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈａｎｇｙａｎｇ ４４３５００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ ＡＩＭ：Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉ－
ｚｏｍａ ｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＭＥＴＨＯＤＳ：
Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂ－
ｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ Ｈ２Ｏ２．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｆｒｏｍ
Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉｚｏｍｅ（１００，２００μｇ／ｍＬ）ｏｎ
ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｓ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐ－
ｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ；
Ｃｅｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ
（ＲＯＳ）ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，
ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｓ ｍｏｒｐｈｏｕｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ
ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；
Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３，９ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｄｅ－
ｔｅｃｔｉｎｇ ｋｉｔｓ；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ
Ｂｃｌ－２ ａｎｄ Ｂａｘ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．ＲＥ－
ＳＵＬＴＳ：Ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉ－
ｚｏｍｅ（１００，２００μｇ／ｍＬ）ｍｉｇｈｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅ ｃｅｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｉｎｈｉｂｉｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｉｍｐｒｏｖｅ
ｃｅｌ ｍｏｒｐｈｏｕｓ，ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎｔｒａ－ｃｅｌｕｌａｒ ＲＯＳ ｃｏｎ－
ｔｅｎｔｓ，ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｘ，
ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ－２ａｎｄ
Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ ｒａｔｉｏ，ｄｅｃｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－
３，９，ａｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｏｓｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｉｎｃｒｅａｓ－
ｉｎｇ，ｔｈｅ ａｆｏｒｅｓａｉｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｂｅｃａｍｅ ｍｏｒｅ ａｎｄ
ｍｏｒｅ ｓｔｒｏｎｇ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ： Ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ
ｆｒｏｍ Ｐａｎａｃｉｓ ｍａｊｏｒｉｓ ｒｈｉｚｏｍｅ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ
ｉｎｈｉｂｉｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ
ｔｏ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，
ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｏｆ ＲＯＳ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｃａｓｐａｓｅ－３，
９，Ｂｃｌ－２ａｎｄ Ｂａｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ Ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｃｉｓ ｍａ－
ｊｏｒｉｓ ｒｈｉｚｏｍｅ；Ｈ２Ｏ２；Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ；ａｐｏｐｔｏ－
ｓｉｓ；Ｂｃｌ－２；Ｂａｘ；Ｃａｓｐａｓｅ－３；Ｃａｓｐａｓｅ－９
本文编辑：
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储冀汝
读者·作者·编者
２０１２年本刊一些常用词汇可直接用缩写
磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）
核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）
酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）
一氧化氮（ＮＯ）
总胆固醇（ＴＣ）
甘油三酯（ＴＧ）
丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）
天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）
尿素氮（ＢＵＮ）
肌酐（Ｃｒ）
干扰素（ＩＦＮ）
白细胞介素（ＩＬ）
肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）
二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）
四唑盐比色法 （ＭＴＴ法）
舒张压（ＤＢＰ）
收缩压（ＳＢＰ）
曲线下面积（ＡＵＣ）
抑制浓度（ＩＣ５０）
小抑菌浓度（ＭＩＣ）
半数致死量（ＬＤ５０）
体重指数（ＢＭＩ）
糖化血红蛋白（Ｈｂａｌｃ）
·７６８·中国临床药理学与治疗学２０１２Ａｕｇ；１７（８）