全 文 ：木鳖子中总皂苷的提取分离工艺及其急性毒性的研究
汪　斌 ,程德怀 ,黄　带 ,朱嘉孺 ,张霄翔
(合肥工业大学制药工程系 , 安徽 合肥　230009)
摘要:目的　优选木鳖子中总皂苷的最佳提取工艺 ,并观察木鳖子总皂苷对小鼠的急性毒性作用 ,评价其安全性。方法　采用
正交实验 , 以木鳖子总皂苷含量为指标 , 考察溶剂用量 、提取次数 、提取时间对木鳖子中总皂苷提取率的影响 , 并采用 D101大
孔吸附树脂结合正丁醇萃取分离提取液中木鳖子总皂苷。采用小鼠半数致死量 (LD50)测定方法 , 观察小鼠灌胃给予木鳖子
总皂苷的急性毒性反应。结果　最佳提取工艺条件为:8倍量水提取三次 , 每次煮沸提取 1 h。大孔树脂分离纯化的总皂苷纯
度可达 72.5%。小鼠单次灌胃给药的 LD50为 1.490 g· kg-1。结论　优选的提取工艺结合大孔吸附树脂和正丁醇分离纯化木
鳖子中总皂苷的方法 ,成本低且操作简便可行 , 适用于工业化生产木鳖子总皂苷。木鳖子总皂苷有一定的毒性。
关键词:木鳖子;木鳖子总皂苷;急性毒性实验
Extraction, separationandacutetoxicitytest
ofsaponinsinMomordicacochichinensis
WANGBin, CHENDe-huai, HUANGDai, ZHUJia-ru, ZHANGXiao-xiang
(DepartmentofPharmaceuticalEngineering, HefeiUniversityofTechnology, Hefei　230009, China)
Abstract:Aim　TooptimizetheextractionprocessofsaponininMomordicacochichinensisandtoexploretheacutetoxicityofMomordica
saponinsinmiceinordertoevaluateitssafety.Methods　TheoptimumextractionprocesswasinvestigatedbyL9(34)orthogonaldesign
withthecontentofMomordicasaponinsastheobservationindex.Theefectsofthevolumeofsolvent, theextractionfrequencyandextrac-
tiontimeontheextractionyieldofMomordicasaponinshadbeenstudiedexperimentally.D101 macroporousabsorptiveresinswasused
combinedwithn-butanolextract.MomordicasaponinsinextractsfromMomordicacochichinensiswereseparatedandpurified.Medianle-
thaldose(LD50)methodwasused, andtheacutetoxicityofMomordicasaponinswasobserved.Results　Theoptimalextractioncondi-
tionsofmomordicasaponinswereasfollows:adding8-foldvolumeofwater, extractingfor3times, onehourforeachextraction.Thepurity
ofMomordicasaponinswas72.5%.TheLD50 ofMomordicasaponinsinmicewas1.490 g· kg-1.Conclusion　Themethodofextrac-
ting, separatingandpurifingMomordicasaponinsfromMomordicacochichinensisisconvenientandfeasible.Itcouldbeappliedtoindus-
trializedproductionofMomordicasaponins.Momordicasaponinhasacertaindegreeoftoxicity.
Keywords:Momordicacochichinensis;Momordicasaponins;acutetoxicitytest
　　木鳖子是葫芦科植物木鳖的干燥成熟种子 ,为常用中药 ,
具有消肿散结 、清肝胆热 、通络止痛等功效 , 可用于治疗疮疡
肿毒 , 乳痈 ,瘰疬 , 痔瘘 , 干癣和秃疮等疾病 [ 1] 。 蒙族民间应
用中药木鳖子治疗慢性肝炎 、肝胆热证 、肝癌等病证 [ 2～ 6] 。本
品在《中华人民共和国药典 》(2005年版一部)中记载有毒。
木鳖子水及乙醇浸出液均有较大毒性 ,其主要活性成分之一
木鳖子皂苷(五环三萜齐墩果烷型三萜皂苷), 小鼠静脉注射
通讯作者:张霄翔 ,男 ,博士 ,副教授 ,研究方向:中药制剂与药理 , E-
mail:zxxwyfzsy@sina.com
LD50为 32.35mg· kg-1 , 腹腔注射则为 37.34 mg· kg-1 [ 7] 。
国外文献报道木鳖子皂苷主要化学成分为皂苷 I和皂苷Ⅱ 。
1985年 , Iwamoto等作者首次从种子中分离出了这两种皂苷 ,
并确定了其甲酯化后经过离子交换树脂的产物 I和 Ⅱ 的结
构 [ 8] 。
有关木鳖子的研究虽取得了一些进展 , 但木鳖子皂苷的
提取分离方法及其灌胃给药的急性毒性研究未见报道。本文
以水为提取溶剂 , 采用正交实验 ,优化提取木鳖子中总皂苷的
工 艺条件 , 并采用D101大孔吸附树脂结合正丁醇萃取分离
[ 10] 程　俊 ,张　琼.甲磺酸托烷司琼注射液联合地塞米松注射液
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(收稿日期:2010-11-13)
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提取液中木鳖子总皂苷。通过观察木鳖子总皂苷对小鼠的急
性毒性作用 , 确定木鳖子总皂苷的安全给药剂量 , 为临床合理
用药提供理论依据。
1　材料
1.1　实验动物　昆明种小鼠 ,体质量 18 ～ 22 g, 雌雄兼用 , 由
安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号:皖医实动 001
号)。实验前适应性喂养 3d,室温(22±2)℃, 相对湿度 50%
～ 70%, 喂颗粒标准饲料 ,自由饮水和摄食。
1.2　药品及试剂　木鳖子购于安徽亳州中药材市场 , 经安徽
中医学院中药教研室王玉凤副教授鉴定本品为葫芦科植物木
鳖 Momordicacochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种
子;D-101大孔树脂(天津南开大学化工厂);齐墩果酸(中国
药品生物制品检定所 , 批号 110709-200505);汽油 、无水乙
醇 、甲醇 、香草醛 、浓硫酸 、盐酸 、冰醋酸 、石油醚 、正丁醇和高
氯酸等试剂 , 均为分析纯。
1.3　主要仪器　HH-S恒温水浴锅 、DZF-6050型真空干燥
箱 、JY5002型电子天平 、WFZ800-D3B型紫外可见分光光度
计 、RE5298A型旋转蒸发器 、Auy120型电子天平。
2　方法与结果
2.1　木鳖子中总皂苷的提取与分离
2.1.1　木鳖子总皂苷含量测定　采用文献报道的木鳖子总
皂苷含量测定方法 [ 9, 10] ,以齐墩果酸为对照品 ,比色法测定木
鳖子总皂苷含量。
　　(1)标准曲线的制备:称取在 105℃减压干燥至恒重的
齐墩果酸对照品约 20 mg, 精密称定 , 置 25 ml量瓶中 ,加适
量甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 精密移取 1 ml置 25 ml量
瓶中 ,加甲醇定容至刻度 , 摇匀 , 作为对照品溶液 。精密移
取齐墩果酸对照液 1、2、3、4、5、6 ml,分别置 10 ml量瓶中 , 水
浴加热挥去溶剂 , 于每只量瓶中分别精密加入 0.2 ml5%香
草醛-冰醋酸溶液和 0.8ml高氯酸 , 密塞 ,摇匀 , 60℃水浴加热
15 min后 , 取出 , 立即流水冷却 , 加冰醋酸 5.0 ml,摇匀 ,以相
应的试剂作空白对照 , 在 560 nm波长处分别测定其吸收度。
以吸收度(A)对浓度(C)进行一元线性回归 , 回归直线方程为
A=0.037 3C-0.032 6, r=0.999 1。结果表明在 5.23 ～
26.10 mg· L-1浓度范围内 , 吸收度与浓度之间的线性关系良
好。
　　(2)样品含量测定:取木鳖子药材去壳取仁 , 干燥后粉碎
成细粉(过 60目筛)。称取木鳖子细粉约 2 g, 精密称定 , 加
100 ml石油醚 , 回流脱脂 4 h, 脱脂完毕后将药渣烘干 , 再用
10倍量甲醇提取三次 , 合并提取液 , 水浴上蒸干甲醇。残渣
用 10 ml水溶解 , 该水溶液用两倍量水饱和的正丁醇萃取 6
次 , 合并正丁醇相 , 水浴上蒸干正丁醇 , 残渣用 20 ml甲醇分
次溶解并定量转移至 25 ml量瓶中 , 加甲醇定容至刻度 , 摇
匀 , 作为供试品溶液 [ 11 , 12] 。 精密量取供试品溶液 0.2 ml, 齐
墩果酸对照品溶液 2 ml,分别置 10 ml量瓶中 , 照 “ 2.1.1(1)
标准曲线的制备”项下的方法 ,自 “水浴加热挥去溶剂”起 , 至
“在 560 nm波长处分别测定其吸收度”止 ,依法测定 , 计算含
量。结果表明 , 木鳖子药材中总皂苷平均含量为 5.31%(n=
3)。
2.1.2　正交试验优选木鳖子中总皂苷的提取工艺　称取脱
脂木鳖子仁细粉(过 40目筛)50 g, 采用水为提取溶剂 ,将加
水量(A)、煎煮次数(B)和煎煮时间(C)作为考察因素 ,以提
取液中木鳖子总皂苷得率为考察指标。提取液中木鳖子总皂
苷的得率按下式计算:
总苷得率(%)={总皂苷提取量(g)/[投入药渣量(g)×总
苷含量 ] }×100
选用 L9(34)正交表进行正交试验。每组试验重复三次。
结果见表 1。对实验结果进行方差分析 ,结果见表 2。
表 1　水提工艺正交试验结果
组号 A(水量) B(次数) C(时间) 总皂苷得率(%) Yi(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1(4倍)
1
1
2(6倍)
2
2
3(8倍)
3
3
1(1次)
2(2次)
3(3次)
1
2
3
1
2
3
1(1h)
2(2h)
3(3h)
2
3
1
3
1
2
22.68
30.94
37.87
26.69
41.29
64.66
55.78
47.56
73.77
19.12
44.57
45.62
26.27
36.01
56.66
60.22
59.76
71.79
20.26
43.97
41.17
20.60
36.99
64.68
56.92
64.08
78.52
62.06
119.48
124.66
73.56
114.29
186.00
172.92
171.40
224.08
Ij 306.20 308.54 419.46
IIj 373.85 405.17 417.12
IIj 568.40 534.74 411.87
Sj 4202.64 2947.72 88.41
表 2　方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 P
A
B
C
误差
4202.64
2947.72
88.41
783.63
2
2
2
18
2101.32
1473.86
44.21
43.54
31.46
22.07
1.32
<0.01
<0.01
>0.05
　　注:F
1-0.10(2, 18)=2.62, F1-0.05(2 , 18)=3.55, F1-0.01(2, 18)=6.01
　　方差分析结果表明 , 加水量 、提取次数的水平变化对木鳖
子总皂苷得率均有极显著影响(P<0.01), 而提取时间的水
平变化则对木鳖子总皂苷得率无影响(P>0.10)。因此 , 最
佳水提工艺条件为 A
3
B
3
C
1
, 即每次加水 8倍量 , 煎煮 3次 , 每
次煎煮 1 h。
2.1.3　木鳖子提取液中总皂苷的分离 、纯化与含量测定　称
取 1 kg脱脂木鳖子仁 , 按最佳水提工艺条件进行提取 , 合并
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提取液(取样测定提取液中木鳖子总皂苷得率 , 其测定结果
为 81.78%),滤过 , 滤液上 D101型大孔吸附树脂(树脂质量
为 2 kg)柱 ,流速为每公斤树脂每分钟流出 100 ml, 上样完毕
后用蒸馏水洗涤树脂至流出液无色 , 继用 70%乙醇洗脱(洗
脱流速为每公斤树脂每分钟流出 30 ml),收集洗脱液 , 减压旋
转蒸发回收乙醇 , 浓缩液用 4倍量水饱和正丁醇萃取 3次 , 合
并正丁醇萃取液 , 减压回收正丁醇 ,浸膏经减压干燥 , 即得木
鳖子总皂苷精制品(取样测定总皂苷得率为 78.25%)。
称取木鳖子总皂苷精制品 25 mg, 精密称定 , 置 25 ml量
瓶中 , 加适量甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,精密移取 0.2 ml,
至 10 ml量瓶中 , 摇匀 ,照 “ 2.1.1(2)样品含量测定”项下的方
法 , 自 “作为供试品溶液 ”起 , 至 “依法测定 , 计算含量”止 , 依
法测定精制品中总皂苷含量 ,结果表明 , 样品中木鳖子总皂苷
含量为 72.5%(n=3)。
2.2　小鼠灌胃给药的急性毒性试验 (LD
50
的测定)
2.2.1　预实验　总皂苷以蒸馏水配制成适当浓度的溶液供
使用 , 灌胃给药。设 2.5、 2.0、 1.6、1.3、 1.0、 0.8、 0.65 g·
kg-1 7组给药剂量 , 每组 10只昆明种小鼠。给药前禁食 12
h,不禁水 , 用药后观察一周。经反复预实验 , 推测 Dm(100%
死亡剂量)约为 2.5 g· kg-1 , Dn(0死亡剂量)约为 0.8 g·
kg-1。
2.2.2　正式实验　取健康小鼠 70只 ,雌雄各半 , 随机分为 7
组 , 每组 10只 , 其中 6组为给药组 , 1组为正常对照组。 Dm
取 2.375g· kg-1 ,给药组间剂量比为 0.8。试验前小鼠隔夜
禁食 、不禁水 ,各给药组分别按给药方案(见表 3)灌胃给予供
试药物 1次 , 灌胃给药体积均为 0.2 ml/10 g体质量 ,正常对
照组灌胃给予蒸馏水 。给药后观察动物的即时反应并连续观
察 7 d, 记录动物毒性反应情况及死亡动物数。死亡动物解剖
肉眼观察心 、肝 、肺 、肾 、脾等重要器官。
结果表明 , 各给药组小鼠在给药后 , 均表现为自主活动减
少 、静卧不动 、精神萎靡等症状 , 给药后约 2 h各组小鼠相继
出现中毒死亡 , 大剂量给药的小鼠死前抽搐剧烈 , 心率异常变
快 , 极度痛苦;小剂量给药死亡的小鼠 , 死前未见剧烈挣扎等
症状。死亡动物解剖肉眼观察未见心 、肝 、肺 、肾 、脾等重要器
官出血 、坏死等异常表现。按一周内累计死亡率计 , 采用
Bliss法计算小鼠灌胃木鳖子总皂苷的 LD50及 LD50的 95%可
信限 , 结果见表 3。
表 3　木鳖子总皂苷灌胃给药途径的小鼠急性毒性实验结果
剂量
/g· kg-1 动物数 死亡数
死亡百分率
(%)
LD50
/g· kg-1
95%可信限
/g· kg-1
2.375
1.900
1.520
1.216
0.973
0.778
10
10
10
10
10
10
10
6
5
3
2
0
100
60
50
30
20
0
1.490 1.299～ 1.709
3　讨论
木鳖子在临床应用日益增多 ,新药研发中也日益受到重
视 , 如由木鳖子为君药组成的复方抗癌中药制剂—枫苓合剂
已获新药证书且已正式上市。蒙医常用木鳖子与其他天然药
配伍治疗肝癌 、胃肿瘤等 [ 5] 。有关木鳖子的文献报道较少 ,
尤其是有关木鳖子活性成分与毒性相关性研究迄今尚未见国
内外文献报道 , 因此开展这方面的研究 ,对推动木鳖子的更深
层次的利用和开发具有重要意义。
木鳖子总皂苷易溶于水 , 能用于热甲醇 、乙醇等极性大的
溶剂 ,不溶于丙酮 、醋酸乙酯等低极性溶剂。考虑到大生产的
适用性 、安全性和经济性 , 本文作者采用水为提取溶剂 ,根据
正交试验优化的木鳖子总皂苷水提工艺 , 其提取率可达 80%
以上。尽管其提取率稍偏低 , 但综合考虑木鳖子总皂苷的大
生产的适用性 、安全性和经济性 , 水提工艺仍优于醇提工艺 ,
表明水提木鳖子总皂苷的工艺是可行的。提取液中木鳖子总
皂苷经 D101型大孔吸附树脂吸附分离 , 再经水饱和正丁醇
萃取纯化 , 获得的木鳖子总皂苷精制品纯度可达 72.5%, 表
明采用 D101型大孔吸附树脂分离纯化木鳖子总皂苷的工艺
是可行的 , 适合于工业化生产木鳖子总皂苷。
急性毒性试验结果表明小鼠灌胃给予木鳖子总皂苷的
LD50达 1.490g· kg-1。以 0.778 g· kg-1的剂量给小鼠灌胃
给药一次 , 连续观察三周 , 小鼠无死亡病例 , 且小鼠的行为活
动 、精神状态 、食欲 、大便 、小便 、呼吸 、鼻 、眼 、口腔等均未见异
常反应 , 说明木鳖子总皂苷在一定剂量范围内应用是安全的。
实验结果初步为木鳖子总皂苷的后续药效学研究中给药剂量
的设计提供了实验依据。
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