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HPLC法测定黄腺香青中银椴苷的含量



全 文 :中国药房 2013年第24卷第39期 China Pharmacy 2013 Vol. 24 No. 39
黄腺香青为菊科香青属植物黄腺香青 Anaphalis aureo-
punctata Lingelsh et Borza的全草,为鄂西北土家族的民间常
用药,在神农架地区和土家族中享有盛誉[1]。全草味甘,性凉,
具有清热解毒、利湿消肿的功效,用于治疗口腔溃疡、小儿惊
风、疮毒、泄泻、水肿、毒蛇咬伤、感冒、咳嗽痰喘、外伤出血等
症。目前,国内、外对黄腺香青的研究报道较少,本课题组前
期已对其挥发性化学成分进行过分析[2];本试验中,笔者采用
高效液相色谱(HPLC)法对黄腺香青中的黄酮类化合物银椴
苷进行含量测定,以期对该植物的开发与应用提供更为全面
的试验依据。
1 材料
1.1 仪器
ULTIMATE 3000型HPLC仪(美国DIONEX公司);BSI型
电子分析天平(d=0.01mg,北京赛多利斯天平有限公司);
UP520H型超声波清洗机(熊猫集团南京电子计量有限公
司)。
1.2 药材
黄 腺 香 青(批 号 :091025、100920、110715、100628、
090713)采自湖北神农架红坪镇,经中国科学院武汉植物园赵
子恩教授鉴定为菊科香青属植物黄腺香青 A. aureopunctata
Lingelsh et Borza的全草,标本存放于湖北省药用植物研发
中心。
1.3 试剂
银椴苷对照品(上海阳光试剂有限公司,批号:A0018,纯
度>98%);磷酸(分析纯,上海振兴化工一厂);甲醇、乙腈(色
谱纯,美国天地公司);水为三蒸水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);
流动相:0.04%磷酸水溶液-乙腈,梯度洗脱(洗脱程序见表
1);流速:0.8 ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:254 nm;进样
量:10 μl。
表1 梯度洗脱程序
Tab 1 Gradient elution process
时间,min
0~5
>5~15
>15~20
>20~25
>25~30
>30~35
>35~40
>40~55
0.04%磷酸水溶液,%
90→85
85→80
80→78
78→77
77→76
76→74
74→70
70→55
乙腈,%
10→15
15→20
20→22
22→23
23→24
24→26
26→30
30→45
2.2 对照品溶液的制备
精密称取银椴苷对照品适量,加甲醇制成每 1 ml含银椴
苷0.4 mg的溶液,作为对照品溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
*教授,硕士研究生导师。研究方向:中药及其制剂的物质基
础。E-mail:ljq59169@sohu.com
HPLC法测定黄腺香青中银椴苷的含量
卢金清*,唐瑶兴,杨 珊,李 婷,郭 彧,何冬黎(湖北中医药大学/湖北省药用植物研发中心,武汉 430065)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2013)39-3707-02
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2013.39.20
摘 要 目的:建立测定黄腺香青中银椴苷含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250
mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.04%磷酸水溶液(梯度洗脱),流速为0.8 ml/min,柱温为30℃,检测波长为254 nm。结果:银
椴苷的进样量在 1.60~5.60 μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.999 9);精密度、重复性、稳定性试验的
RSD<3%;平均加样回收率为98.84%,RSD=1.70%(n=9)。结论:该方法操作简便、准确度高、重复性好,可作为黄腺香青中银
椴苷的含量测定方法。
关键词 黄腺香青;银椴苷;高效液相色谱法;含量测定
Content Determination of Tiliroside in Anaphalis aureopunctata by HPLC
LU Jin-qing,TANG Yao-xing,YANG Shan,LI Ting,GUO Yu,HE Dong-li(Hubei University of TCM/Research
and Development Center of Medicinal Plants in Hubei Province,Wuhan 430065,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To develop a method for the content determination of tiliroside in Anaphalis aureopunctata. METH-
ODS:HPLC method was used. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column
with mobile phase consisted of acetonitrile-0.04% phosphoric acid(gradient elution)at the flow rate of 0.8 ml/min. The detection
wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 30 ℃. RESULTS:The linear range of tiliroside was 1.60-5.60 μg
(r=0.999 9)with an average recovery of 98. 84%(RSD=1.70%,n=9). The RSDs of precision,reproducibility and stability
tests were all lower than 3%. CONCLUSIONS:The method is simple,accurate and reproducible,which can be used for the con-
tent determination of tiliroside in A. aureopunctata.
KEY WORDS Anaphalis aureopunctata;Tiliroside;HPLC;Content determination
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China Pharmacy 2013 Vol. 24 No. 39 中国药房 2013年第24卷第39期
称取黄腺香青粗粉 1.00 g,精密称定,精密加入 80%甲醇
50 ml,密塞,称定质量,加热回流 1 h,放冷,再称定质量,用
80%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,即得。
2.4 系统适用性试验
取供试品溶液、对照品溶液及空白对照溶液,按上述色谱
条件各进样10 μl,记录色谱图(图1)。结果表明,银椴苷与相
邻色谱峰的分离度为2.1,基线分离良好;理论板数按银椴苷峰
计算应不低于5 000。
2.5 线性关系考察
分别精密量取银椴苷对照品溶液 4、6、8、10、12、14 μl,注
入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录峰面积。以银椴苷
进样量(x)为横坐标,峰面积积分值(y)为纵坐标,绘制标准曲
线,得回归方程为y=4.751 6x-1.085 5(r=0.999 9,n=6)。结
果表明,银椴苷进样量在 1.60~5.60 μg范围内与其峰面积积
分值呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取银椴苷对照品溶液10 μl,连续进样5次,按上述
色谱条件测定,记录峰面积。结果显示,RSD=0.57%(n=5),
表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10 μl,分别于0、3、6、9、12、24 h
注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录峰面积。结果显
示,RSD=0.74%(n=6),表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批黄腺香青药材粗粉 6份,每份 1.00 g,精密称定,
分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,再按上述色谱条件分
别进样10 μl,记录峰面积,以峰面积计算6份供试品溶液中银
椴苷的含量。结果显示,银椴苷的平均质量分数为 1.77%,
RSD=2.75%(n=6),表明本方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验
称取同一批已知含量的黄腺香青粗粉约0.50 g,精密称定
9份,分别置于 50 ml量瓶中,分别加入适量银椴苷对照品,按
“2.3”项下方法制备供试品溶液,再按上述色谱条件进样10 μl,记
录峰面积,测定银椴苷的含量并计算加样回收率,结果见表2。
表2 加样回收率试验结果(n=9)
Tab 2 Results of recovery tests(n=9)
取样量,mg
499.81
500.03
500.28
499.94
500.17
499.62
500.33
500.12
499.76
样品含量,mg
9.05
9.05
9.06
9.05
9.05
9.04
9.06
9.05
9.05
加入量,mg
4.50
4.50
4.50
9.00
9.00
9.00
13.50
13.50
13.50
测得量,mg
13.38
13.49
13.57
17.85
18.16
17.76
22.38
22.63
22.45
回收率,%
96.22
98.67
100.22
97.78
101.22
96.89
98.67
100.59
99.26
x,%
98.84
RSD,%
1.70
2.10 样品含量测定
取 5批黄腺香青粗粉各适量,分别按“2.3”项下方法制备
供试品溶液,再按上述色谱条件进样测定,记录峰面积,以峰面
积计算样品中银椴苷的含量,每批样品测定3份,结果见表3。
表3 样品含量测定结果(n=3)
Tab 3 Results of content determination of samples(n=3)
批号
110715
100628
100920
090713
091025
取样量,g
2.000 6
2.001 2
2.000 8
2.001 3
2.004 1
2.000 3
1.996 9
1.998 7
2001 3
2.001 9
2.002 5
1.999 1
1.998 6
1.997 9
2.003 6
银椴苷质量分数,%
1.81
1.79
1.80
1.80
1.95
1.89
1.87
1.85
1.72
1.72
1.57
1.63
1.79
1.78
1.81
平均质量分数,%
1.79
3 讨论
3.1 检测波长的选择
笔者曾对黄腺香青样品药材和银椴苷对照品在200~400
nm波长范围内进行紫外扫描,发现样品和对照品中银椴苷均
在 254 nm波长处有最大吸收,且该波长处基线平稳、不易漂
移,各色谱峰峰形和分离度好,故选择254 nm为检测波长。
3.2 流动相的选择
笔者曾对甲醇-水、乙腈-水、0.04%磷酸水溶液-甲醇、
0.2%醋酸水溶液-乙腈、0.05%磷酸水溶液-甲醇、0.04%磷酸水
溶液-乙腈等流动相进行考察,发现只有以0.04%磷酸水溶液-
乙腈作为流动相梯度洗脱时,银椴苷色谱峰峰形对称、分离效
果好、基线平稳,故选择其为流动相。
综上,本方法操作简便、准确度和回收率高、重复性和稳
定性好,可作为黄腺香青中银椴苷的含量测定方法。
参考文献
[ 1 ] 傅书遐.湖北植物志:第四卷[M].武汉:湖北科学技术出
版社,1979:69.
[ 2 ] 卢金清,何冬黎,许家琦,等.黄腺香青挥发油化学成分
GC-MS分析[J].中药材,2011,34(3):392.
(收稿日期:2012-09-14 修回日期:2013-03-18)
110
80
60
40
20
-100 10 20 30 40 55
t,min
A
1
mA
U
180
150
100
50
-20
mA
U
0 10 20 30 40 55
t,min
B
110
80
60
40
20
-10
mA
U
0 10 20 30 40 55
t,min
C
图1 高效液相色谱图
A.银椴苷对照品;B.供试品;C.空白对照;1.银椴苷
Fig 1 HPLC chromatograms
A. tiliroside control;B. test samples;C.blank control;1. tiliroside
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