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(2006 - 11 -20收稿)
基金项目:吉林省教育厅科技发展计划项目(2004004);吉林省中医药管理局科技发展计划项目(2004111)
珍珠梅提取物抑制肝癌 HepG-2细胞增殖的实验研究
张学武 ,崔长旭 ,陈丽艳
(延边大学基础医学院 ,吉林延吉 133000)
　　摘要　目的:观察珍珠梅提取物对肝癌 H epG-2细胞增殖的影响 ,探讨其作用机制。方法:采用 MTT比色法观
察珍珠梅提取物抑制肝癌 H epG-2细胞增殖;采用流式细胞仪检测其对 H epG-2细胞周期分布的影响 , 同时结合倒
置显微镜 、HE染色 、透射电镜及免疫细胞化学方法检测凋亡相关基因 bcl-2、 p53的蛋白表达 , 观察其诱导肝癌
H epG-2细胞凋亡的作用。结果:珍珠梅提取物可抑制肝癌 H epG-2细胞增殖 , 其作用具有时间和浓度依赖性;珍珠
梅提取物可诱导细胞凋亡;同时改变细胞周期分布 , 多数细胞阻滞于 G 2 M/ 期 , 与对照组比较 ,细胞凋亡率差异有显
著性(P<0.01);用药前后凋亡相关基因 bcl-2、 p53蛋白表达均有显著性改变(P<0.01)。结论:珍珠梅提取物可诱
导肝癌 H epG-2细胞凋亡 ,改变细胞周期分布 , 从而抑制细胞增殖。
关键词　珍珠梅;细胞周期;细胞凋亡
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)06-0681-04
Inhib ition ofSorbaria sorbifo lia on Proliferar ion ofHepatoma H epG-2 Cell L ine
ZHANG Xue-wu, CU I Chang-xu, CHEN L i-yan
(BasicM edica l College, Yanbian University, Yanji 133000, China)
Abstrac t　Objective:To inve stig ate the inh ibition of Sorbaria sorbifolia on pro liferation hepatom a H epG-2 ce lls, and to explore
the antineop la sticm echanism o f Sorbaria sorbifolia. M ethods:MTT assay w as used to exam ine the effec t o f Sorbaria sorbifolia on the
proliferation of H epG-2 ce ll and flow cy tom e try w as used fo r the ce ll cycle distribution. Apoptosis o fH epG-2 cellw as investigated fur-
the r by m eans of inverted m icroscope, HE staining, transm ission e lectron m icro scopy and expre ssion o f apoptosis-associa ted gene bcl-2
and p53 w ere de te rm ined by immunohisto chem ica lm e thod. Results:Sorbaria sorbifolia inhib ited the pro life ra tion o f H epG-2 ce ll and
the effec ts w ere in a tim e-and-concentration dependent m anne r. Sorbaria sorbifolia could also induce apop to sis, the G2 M/ phase w as
arrested and the ra tio of apoptosis w as significan tly d iffe rence w ith that of contro l group, respec tive ly. The expressions o f apopto sis-as-
socia ted gene bc l-2 and p53 had changed sign ificantly, respective ly. Conc lusion:Sorbaria sorbifolia inhibits pro liferation o f H epG-2
ce lls via induction of apop tosis and ce ll cyc le a rrest.
K ey words　Sorbaria sorbifolia;C ell cy cle;Apoptosis
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DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牰牣牥牪牱
　　珍珠梅 (Sorbaria sorbifolia)属蔷薇科植物 ,广泛
分布于云南 、贵州 、四川 、甘肃 、宁夏及东北 ,有活血
化瘀 、消肿止痛 ,治骨折及跌打损伤的作用 ,其主要
成分为黄酮类化合物 〔1〕。笔者曾报道珍珠梅提取
物对小鼠 S180肉瘤有抑制作用〔2〕。本实验选用肝
癌 HepG-2细胞株作为研究对象 ,研究珍珠梅提取
物对肝癌 HepG-2细胞增殖的作用 ,及其对细胞周
期分布和凋亡的影响 ,对珍珠梅抑制肝癌 HepG-2
细胞增殖的机制进行了初步探讨。
1 　材料与方法
1.1 　材料
1.1.1　细胞株:HepG-2细胞购于南京凯基生物技
术公司 。
1.1.2　药物及主要试剂:长白山珍珠梅乙醇提取
物:将药材适度粉碎 ,置于三角烧杯中加入 95%乙
醇浸泡 24 h , 85℃水浴加热回流提取 ,第一次加热 3
h,后两次均加热 2 h,提取液趁热过滤 ,最后将 3次
提取液合并 ,回收乙醇 ,浓缩 、干燥。干燥提取物 ,配
成所需浓度 ,贮存备用 。噻唑兰购自美国 S igma公
司;RPM I1640培养基购自美国 G ibco公司;小牛血
清购自北京华美生物工程公司;胰蛋白酶购自美国
Difco公司;鼠抗 bc l-2、p53单克隆抗体购自福州迈
新生物有限公司 。
1.1.3　主要仪器:OLYMPUS倒置显微镜购自日
本;RT-2100型酶标仪购自美国;FACS C alibur流式
细胞仪购自美国;JEM-1200EX透射电子显微镜购
自日本;PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自
北京天地百年科技公司。
1.2 　方法
1.2.1　HepG-2细胞培养:肝癌 HepG-2细胞贴壁
生长 ,培养于含 10%灭活小牛血清 ,含 100 U /m l青
霉素及 100 U /m l链霉素的 RPM I1640培养液中 ,置
37℃、相对湿度 90%、5%CO2孵箱内培养 。
1.2.2　HepG-2细胞形态的变化:取对数生长期
HepG-2细胞按每瓶 1 ×105个细胞接种于 96孔细
胞培养板中 , 24 h后换液 ,加入含不同浓度 (50、
100、200 μg /m l)珍珠梅提取物的 10%新生小牛血
清 RPM I 1640培养液 200μl,另设终浓度为 25 μg /
m l 5-Fu的阳性对照组和不加药物的阴性对照组 。
置 5%CO 2孵箱内培养 24 h、48 h。每 d在倒置显微
镜下观察细胞生长状态 , 48 h时进行常规 HE染色 。
1.2.3　MTT比色实验:取对数生长期的 HepG-2
细胞按每孔 1×105个细胞接种于 96孔板中 ,每孔
体积 200 μl。 24 h后换液 ,珍珠梅组加入珍珠梅提
取物使其终浓度分别 50 μg /m l、 100 μg /m l和 200
μg /m l,另设终浓度为 25 μg /m l的 5-Fu阳性对照组
和不加药物的阴性对照组以及不接种细胞的空白对
照组 。分别培养 24 h、48 h,每个浓度每个时点均设
4个复孔。于终止前 4 h,每孔加入 5mg /m lM TT溶
液 20 μl,继续孵育 4 h后弃去上清液 ,加入 150 μl
DM SO ,轻轻振荡 10 m in,使结晶物完全溶解 ,于 490
nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值 (A
值),计算抑制率(IR)。
IR(%)=(对照孔 A值-实验孔 A值 ) /对照孔 A值 ×
100%
1.2.4 　流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分
布:对照组和 100 μg /m l珍珠梅组细胞培养 48 h
后 ,收集各组细胞悬液 1m l,浓度约为 106个 /m l,离
心(1 000 r /m in , 5m in),弃掉培养液 , 70%冷乙醇固
定 , 4℃PI暗染 30m in,流式细胞仪检测 ,采用 Modf-
itLT3.0软件对各组样本进行 DNA含量及细胞周期
分析 。
1.2.5 　透射电镜观察凋亡细胞形态:细胞培养 24
h后 ,实验组加入珍珠梅提取物 ,使其终浓度为 100
μg /m l,对照组不加药 ,置培养箱中贴壁培养 , 48 h
后收集各组细胞 , 2 000 r /m in,离心 5 m in,弃上清 ,
加 4℃预冷的 3%戊二醛固定 2 h, PBS液洗 ,再用
1%锇酸固定 30m in,梯度酒精脱水 ,环氧树脂包埋 ,
切取 50 ～ 70 nm超薄切片 ,醋酸铀和柠檬酸铅双重
染色 ,透射电镜观察 。
1.2.6 　细胞凋亡相关基因 bc l-2、p53蛋白检测:取
对数生长期的 HepG-2细胞 ,以 1 ×105个 /m l的浓
度接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的 6
孔培养板 ,每孔 2m l。待细胞贴壁生长良好 ,吸除上
清液 ,加入珍珠梅提取物使终浓度为 100 μg /m l,继
续培养 48 h后取出细胞爬片 ,应用免疫细胞化学方
法检测 bc l-2和 p53蛋白的表达。结果判断:选取
bcl-2、p53阳性细胞密度最高的部位在真彩色病理
细胞图像分析系统分析 ,每例随机 5个统计场 ,取其
平均值作为凋亡相关基因蛋白的阳性表达率 。
1.3　统计方法　应用 SPSS11.5统计软件进行相
关性分析和方差分析 ,数据采用 –x±S表示。
2　结果
2.1　对 HepG-2细胞生长的影响
2.1.1　细胞生长形态变化:对照组 HepG-2细胞呈
上皮型贴壁生长 ,细胞呈延展 、扁平 ,细胞均质而透
明 ,细胞一般有 2-4个核仁 ,核膜 、核仁轮廓明显 ,细
胞间结构紧密 ,细胞生长旺盛 。珍珠梅组 、阳性对照
组细胞轮廓增强 、反差增大 ,变圆浮起 ,细胞间接触
变松 ,增殖减慢 ,胞质中颗粒增多;HE染色染色质
682 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 6期 2007年 6月
浓缩 ,呈深染的新月体形 ,可见凋亡小体。
2.1.2　MTT比色实验:不同浓度处理组分别培养
24 h、48 h,珍珠梅提取物对 HepG-2细胞生长有抑
制作用 ,且其抑制作用具有时间和浓度依赖性 。随
着时间的延长和药物浓度的增加 ,细胞抑制效果越
明显 ,药物对肿瘤细胞生长有量-效 、时-效关系 。当
珍珠梅浓度为 100 μg /m l、作用时间为 48 h时 ,对
HepG-2细胞的抑制率为 47.11%,接近半数抑制浓
度 (IC50)。结果见表 1。
　表 1　　　　　珍珠梅提取物体外对 HepG-2
细胞的抑制作用( x±S)
组别
24 h
A值 抑制率(%)
48 h
A值 抑制率(%)
对照组 0.723±0.005 　　 0 1.156±0.020 　　 0
50 0.566±0.008 21.66±0.60 0.749±0.005 35.15±0.70
100 0.457±0.010 36.73±1.42*△ 0.611±0.011 47.11±1.34*△
200 0.329±0.010 54.51±1.65*△ 0.223±0.016 80.74±1.42△□
5-Fu 0.443±0.009 38.71±1.08 0.477±0.008 58.76±0.79
　　同一时间组中与前一剂量比较 , * P <0. 01;同一浓度组中与前
一时间比较 , □ P<0. 01;与 5-Fu组比较 , △P <0. 01
2.2　对细胞周期分布的影响　100 μg /m l珍珠梅
提取物处理 HepG-2细胞 48 h后 ,在 G 0 /G1 、G2 M/
和 S期的细胞分别为 46.33%、12.55%和 41.12%;
而未经药物作用的对照组细胞的 G0 /G 1 期为
58.81%、G 2 M/ 期为 1.85%、S期为 39.34%。可见
珍珠梅提取物作用下 , G 2 M/ 期细胞比率显著上升 ,
多数细胞阻滞在 G2 M/ 期。结果见表 2、图 1。
2.3　诱导细胞凋亡
2.3.1　流式细胞仪检测细胞凋亡:100μg /m l珍珠
梅提取物作用 HepG-2细胞 48 h后 ,流式细胞仪检
测 DNA含量 ,可见明显的细胞凋亡峰 ,其凋亡率为
37.38%,与对照组细胞的凋亡率 2.89%比较有显
著性差异 (P<0.01)。结果见表 2及图 1。
　表 2　珍珠梅提取物对细胞周期和凋亡率的影响( x±S)
组别 细胞周期
G0 /G1 G 2 M/ S
凋亡率(%)
100 μg /m l 46. 33 12. 55 41.12 37. 38*
对照组 58. 81 1. 85 39.34 2. 89
　　与对照组比较, *P<0.01。表 3同
图 1　流式细胞仪检测结果
A.对照组　B. 100 μg /m l珍珠梅作用 48 h
2.3.2　透射电镜观察凋亡细胞形态:透射电镜观
察可见珍珠梅提取物处理后的细胞胞体缩小 ,微绒
毛减少 ,胞质浓缩 ,胞核局部向外呈锐角突起 ,核染
色质高度浓缩 ,电子密度增高 ,边集于核膜下 ,核染
色质呈半月形 ,出现核固缩和核碎裂 ,可见凋亡小
体 。对照组细胞未见有明显凋亡细胞形态特征 。
2.3.3　细胞凋亡相关基因 bcl-2、p53蛋白检测:对
照组胞核染色细胞数少 ,而加药组染色阳性细胞数
增多 ,染色明显变深。珍珠梅组的 bc l-2蛋白表达下
降 , p53蛋白表达升高 ,与对照组比较有显著性差异
(P <0.01)。结果见表 3。
　表 3　　　　　用药前后 bcl-2、p53蛋白的
阳性表达率(%)( x±S)
组别 bc l-2 p53
对照组 39.25±1. 03　 25. 39±0.52　
珍珠梅组 21.58±1. 08* 38. 05±0.79*
3　讨论
细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中 ,
与肿瘤的发生 、发展及退化有密切的关系〔3〕。现已
明确 ,大多数抗肿瘤药物都能诱导敏感肿瘤细胞发
生凋亡 ,并且其抗肿瘤效能与肿瘤细胞在药物诱导
下发生细胞凋亡的内在活性有关〔4〕。因此 ,通过观
683 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 6期 2007年 6月
察是否能诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗肿瘤药物
的新靶点 ,以及评价疗效的一项新指标 〔5〕。本实验
中 MTT结果显示珍珠梅提取物对 HepG-2细胞的增
殖具有明显的抑制作用 ,其细胞生长抑制随着药物
浓度的升高和时间的延长而增加 ,具有量-效 、时-效
关系。倒置显微镜 、HE染色 、透射电镜及流式细胞
术结果说明珍珠梅提取物可以诱导肝癌 HepG-2细
胞凋亡 。同时 , 珍珠梅提取物能明显抑制 HepG-2
细胞的周期变化 ,使其阻滞细胞停止于 G2 M/ 期 ,使
细胞周期改变而诱导细胞凋亡 。
bc l-2基因表达产物可以通过抑制诱导凋亡的
信号而在肿瘤发生中起到重要作用 ,突变型 p53失
去了对细胞生长 、凋亡和 DNA修复的调控作用 〔6〕。
在本实验中 ,珍珠梅组 bcl-2蛋白表达率明显下降 ,
m tp53基因表达 ,从而使细胞发生凋亡这可能是珍
珠梅诱导 HepG-2细胞凋亡的机制之一 。
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(2007 - 01 -17收稿)
作者简介:崔升淼 ,女 ,博士。研究方向为中药新剂型。*通讯作者:赵春顺 ,男 ,博士 ,硕士生导师。 E-m ail:zhaocs@m ai.l sysu. edu. cn。
葛根黄酮自微乳化给药系统的体内外评价
崔升淼 1 ,赵春顺2* ,何仲贵 3
(1.广东药学院中药学院 ,广东广州 510006;2.中山大学药学院 ,广东广州 510080;3.沈阳药科大学药学
院 ,辽宁沈阳 110016)
　　摘要　目的:研究葛根黄酮自微乳化给药系统的自微乳化能力及在大鼠体内的药动学。方法:通过测定自微
乳化所需的时间来评价自微乳化速度 ,测定自微乳化后药液的粒径来评价自微乳化效率 , 采用 HPLC法测定大鼠
血清药物浓度 , 与市售片剂比较 , 考察葛根黄酮自微乳化制剂体外溶出行为及体内药动学。结果:体系在 2 m in内
已基本乳化完全 , 乳化后的粒径在 50 nm以下 , 在水中 10 m in的溶出度可达 90%以上 , 而愈风宁心片 120 m in的溶
出度不足 50%。大鼠体内药动学研究结果表明:与市售片剂相比 , 自微乳化制剂达峰时间提前 , Tm ax =15 m in,而市
售片剂 Tm ax =29 m in;AUC0 ～ ∞提高了 82%。结论:自微乳化制剂显著提高了葛根黄酮的体外溶出和体内吸收。
关键词　葛根黄酮;自微乳化;溶出度;生物利用度
中图分类号:R943.3;R969.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)06-0684-04
Assessment of Puerar ia lobata isoflavone w ith Se lf-m icroemulsifying
Drug Delivery System s in V itro and in V ivo
CUI Sheng-m iao1 , ZHAO Chun-shun2 , HE Zhong-gui3
(1. Departm ent of T raditional Chine seM ateriaM ed ica, Guangdong Pha rm aceutica lUniversity, Guang zhou 510006, China;2. Schoo l
o f Pha rm aceutica lSc iences, Sun Yat-sen Un ive rsity, Guangzhou 510080, China;3. Schoo l o f Pharm acy, Shenyang Pharm aceutica lU-
niversity, Shenyang 110016, China)
Abstrac t　Objective:To evalua te the se lf-m icroemu lsify ing ab ility and dissolution behav ior o f pueraria lobata iso flavone in vitro
and the pharm acokine tic behav ior in ra ts. M ethods:The se lf-m icroemu lsify ing ra te w as evalua ted by the self-m icroem ulsify ing tim e and
the se lf-m icroemu lsify ing efficiency was eva luated by the particle size o f resu ltan tm icroemu lsions. The p lasm a concen tra tionsw ere eva l-
uated by HPLC and disso lution and pha rmacokine tic behav io r of self-m ic roem ulsify ing drug de livery sy stem s we re eva lua ted by compari-
son w ith comm ercial tab le ts. Results:The system was self-m ic roem ulsified in 2m in and the particle sizew as less than 50 nm. The dis-
684 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 6期 2007年 6月