全 文 ：近年来 , 肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内呈
持续上升趋势 ,给人类的生命造成了极大威胁 ,因此寻找
有效治疗各类肿瘤药物的研究已成为一大热点 。现代医
药中虽然筛选了不少有明显抗肿瘤作用的药物 , 但因毒
副作用大 、易产生耐药等因素 , 使其应用受到一定的局
限性 。能否找到既能杀伤肿瘤细胞 ,毒副作用又小的药
【摘要】目的:观察木鳖子(cochinchina momordica seed , CMS)水提物(water extract of CMS , CMSWE)和醇提物(ethanol extract of
CMS , CMSEE)对肿瘤细胞生长的影响 , 探讨 CMSEE的抗肿瘤机制 。 方法:制备CMSWE和 CMSEE。MTT法检测 CMSWE和 CMSEE对
人黑色素瘤 B16 、肺癌细胞 A549 、乳腺癌细胞MDA_MB_231 、食管癌细胞 TE_13 ,以及正常人外周血淋巴细胞(PBMC)生长的影响 ,计算细
胞生长抑制率;光镜下观察细胞形态变化;瑞氏_吉姆萨染色观察 B16细胞凋亡形态学变化 。流式细胞技术(FCM)检测 B16细胞凋亡
率和细胞周期分布 。 结果:CMSEE(25 ～ 300 mg/L)对 B16 、A549 、MDA_MB231和 TE_13细胞增殖均有明显的抑制作用(P<0.01), 对
PBMC的增殖没有明显影响 。CMSWE(25 ～ 300 mg/L)对 A549 、TE_13 、MDA_MB231 、PBMC的生长没有明显影响 ,仅对 B16细胞的增殖有
较弱的抑制作用 , 且各浓度组抑制率均小于相同浓度的 CMSEE(P<0.01)。经 CMSEE处理后 , B16细胞显示典型的凋亡形态变化 ,凋
亡率明显增高(P<0.01), G 0/G 1期细胞明显增加 , S期 、G2/M期细胞减少(P<0.01)。 结论:CMSEE体外对人肿瘤细胞增殖有明显
的抑制作用 ,其抗肿瘤机制可能与阻滞肿瘤细胞周期和诱导凋亡有关 。
【关键词】 木鳖子;抗肿瘤;细胞周期;细胞凋亡
中图分类号:R735.2 文献标识码:A 文章编号:1004-616X(2010)01-0019-05
【ABSTRACT】 OBJECTIVE:The anti_tumor activi ty of extract from cochinchina momordica seed (CMS)and its probable
mechanism were investigated.METHODS:The growth_inhibitory effect of ethanol extract and water extract of Cochinchina
Momordica Seed (CMSEE and CMSWE) on A549 , MDA_MB_231 , TE_13 , B16 tumor cell lines and PBMC were
examined by MTT assay.Morphological changes of tumor cells were analyzed by light microscope and Wight_Giemsa
staining.The ratio of cell cycle and apoptosis rate were analyzed with Flow Cytometry (FCM).RESULTS:CMSEE could
significantly inhibit the proliferation of tumor cell lines in a dose_dependent manner(P<0.01), but CMSWE had no
such effect .Both CMSEE and CMSWE showed no obvious influence on growth of PBMC.After treatment wi th CMSEE ,
B16 cells showed apoptosis morphology and the apoptotic rate was increased as compared to control group , meanwhile the
proportion of B16 cells in the G 0/G 1 phase was elevated significantly(P<0.01).CONCLUSION:CMSEE significantly
inhibited tumor cell growth in vitro by arresting cell cycle and inducing apoptosis of tumor cells.
【KEY WORDS】 cochinchina momordica seed;anti_tumor;cell cycle;apoptosis
收稿时间:2009-08-05;修订日期:2009-10-10
作者简介:赵连梅(1981-), 女 ,汉族 , 内蒙古敖汉旗人 ,硕士 , 研究方向:中
药抗肿瘤研究。E-mail:lianmeizhmail@163.com
＊Correspondence to:SHAN Bao-en, Tel:0311-86095283.
木鳖子提取物
体外抗肿瘤活
性的初步研究
赵连梅/韩丽娜/单保恩 ＊/
潘晓明/刘丽华/李晓光
(河北医科大学第四医院科研中心 , 河北
石家庄 050011)
Anti -tumor activity of
cochinchina momordica
seed extract
ZHAO Lian-mei , HAN Li -na , SHAN Bao-en ＊,
PAN Xiao-ming , LIU Li -hua , LI Xiao-guang
(Research Center , The Fourth Hospital of Hebei
Medical University , Shijiazhuang 050011 , Hebei , China)
0 0 1 9CARCINOGENESIS, TERATOGENES IS ＆ MUTA GENESIS
论 著
癌变 畸变 突变第 22卷 第 1期 1 O 1月
论 著
癌变 畸变 突变
Vol.22 No.1
CARCINOGENESIS, TERATOGENES IS ＆ MUTA GENESIS
1月1 O
物及治疗方法 ,是肿瘤治疗成功的关键问题 。目前 ,从中
草药和民族医药资源中寻找活性强 、作用独特 、毒性小
的抗肿瘤新药研究已受到广泛重视 。蒙药木鳖子
(cochinchina momordica seed , CMS)始载于宋 《开宝本
草》 , 古代医药文献记载该药具有散结消肿 、攻毒疗疮
之功效 ,可用于治疗疮疡肿毒 、乳痈 、瘰疬 、痔瘘 、干癣 、
秃疮等症[ 1]。目前木鳖子在蒙药方剂中的应用非常广泛 ,
在多种癌症的治疗方剂中出现 ,且效果显著。但是关于该
药物的体内外抗癌效果及机制研究 , 迄今国内外尚未见
报道。本实验将分析木鳖子提取物对体外培养的 4种肿
瘤细胞生长的影响 , 探讨其抗肿瘤作用的有效成分及其
作用机制 , 为木鳖子作为抗肿瘤药的开发和利用提供有
价值的资料。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
中药木鳖子购自北京同仁堂药店 ,经河北医科大学
药学院生药教研室鉴定为正品。PI染料 、MTT试剂盒购
自美国 Sigma公司;瑞_姬(Wrigh_Giemsa)染液购自 Baso
公司(批号:050511);胎牛血清购自杭州四季青生物工
程材料有限公司;RPMI 1640 和胰蛋白酶购自美国
Gibco公司;人淋巴细胞分离液购自 Solarbio公司(批号:
P18610);无水乙醇为国产分析纯。
1.2 木鳖子提取物的制备
取一定量的木鳖子原药材 , 粉碎后称取 10 g , 加
去离子水 100 ml , 室温下浸泡过夜 , 水浴回流提取2
次 , 每次 1 h , 合并上清液 , 2%活性炭 80 ℃蒸煮脱色
30 min , 8 000 r/min离心 10 min , 取上清液用旋转冷冻
蒸发器蒸发干燥 , 所得干粉视为木鳖子水提物纯品
(water extract of cochinchina momordica seed , CMSWE)。
称取粉碎后的木鳖子 10 g , 加入 10倍体积的无水乙
醇 , 室温密闭浸泡 7 d , 纱布滤去渣滓 , 加入 2%活性
炭 , 80 ℃蒸煮脱色 , 旋转冷冻蒸发器减压蒸发成粉状
物 , 所得干粉视为木鳖子醇提物纯品(ethanol extract of
cochinchina momordica seed , CMSEE)。使用 CMSEE时经
乙醇溶解 , 并使乙醇终浓度<0.1%, CMSWE使用时
用 PBS 溶解 , 二者均用 RPMI 1640培养基稀释 , 经无
菌滤器除菌 , 4 ℃保存备用。
1.3 细胞培养
乳腺癌细胞株 MDA_MB_231 , 小鼠黑色素瘤细胞株
B16 , 食管癌细胞 TE_13均由河北医科大学第四医院科
研中心保存 ,肺癌细胞 A549购自中科院上海细胞库 。所
用细胞均以体积分数为 100 ml/L胎牛血清的 RPMI
1640培养液 (含青霉素 100 U/ml , 链霉素 100 μg/ml)
于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 ,以 0.25%的胰蛋白酶
消化细胞传代 ,取对数生长期细胞用于实验 。常规密度
梯度离心法提取健康人外周血淋巴细胞(PBMC)。
1.4 四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测肿瘤细胞生长抑
制率
取对数生长期肿瘤细胞 , 调整细胞浓度为 1×105/
ml , PBMC浓度为 1×106/ml ,均接种于 96孔培养板 , 每
孔 180 μl , 实验组各孔分别加入不同浓度的木鳖子水
提物(CMSWE)和醇提物(CMSEE)各 20 μl ,使其终浓度
分别为 300 、200、100 、50 、25 mg/L;空白对照孔加入完
全培养基;阴性对照孔加入含有 0.01%乙醇的培养基 ,
每组均设 4个复孔 ,置于饱和湿度 、37 ℃、5%CO 2培养
箱中培养 24 h ,各孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl ,继续培
养 4 h ,弃去培养上清 ,每孔加入 DMSO 150 μl ,混匀后
以测定波长 492 nm、参考波长 620 nm检测各孔光密度
D(492)值 , 按下式计算对细胞增殖的抑制率(inhibitory
rate , IR)。
IR(%)=[对照组 D(492)值-实验组 D(492)值]/[对照组
D(492)值-空白对照组 D(492)值] ×100%
1.5 细胞形态学观察
于 96孔板中加入不同种类的肿瘤细胞(每孔 1×104
个),用 CMSEE(200 mg/L)分别处理 24 h后 ,倒置相差显
微镜下观察形态学变化。另取对数生长期的 B16细胞 ,调
整细胞浓度为 1×105/ml , 加入 6孔培养板中(孔内预先
放置灭菌盖玻片), 每孔 2 ml , 培养 24 h , 待细胞在盖玻
片上贴壁良好后 , 加入 1 ml不同浓度CMSEE(终浓度分
别为200、100、50 mg/L),继续培养 24 h ,取出玻片 ,生理
盐水冲洗 3次 , 晾干 , 滴加瑞_姬染料(Wright_Giemsa)染
色1 min ,加 3倍体积蒸馏水 ,混匀静置 15 min ,用清水冲
洗干净 ,普通光学显微镜下观察结果。
1.6 细胞凋亡率分析
分别以 50、100、200 mg/L 的 CMSEE作用于 B16细
胞 24 h , 收集细胞 , 用预冷的 70%乙醇固定 12 h;离心
弃去固定液 ,PBS重悬 5 min后 300目筛网过滤;加入PI
染液 , 4 ℃避光染色 30 min , 流式细胞仪分析细胞周期
及凋亡率。
1.7 统计学方法
采用 SPSS 11.5软件进行统计学分析 , 实验数据以
x-±s表示 , 多组间的比较采用单因素方差分析 , 组间
两两比较采用 LSD检验 ,以α=0.05为检验水准。
2 结 果
2.1 木鳖子提取物对肿瘤细胞增殖的影响
CMSEE(25 ～ 300mg/L)对 B16、A549 、MDA_MB_231 、
0 0 2 0
CARCINOGENESIS, TERATOGENES IS ＆ MUTA GENESIS
论 著
癌变 畸变 突变第 22卷 第 1期 1 O 1月
TE_13细胞的增殖具有明显的抑制作用 ,并呈剂量依赖
性(表 1), 最高抑制率(300mg/L)分别为 79.70%、
68.19%、70.93%、56.99%,对 B16细胞的生长抑制作
用明显高于其他 3组细胞(P <0.01),对 PBMC细胞的
生 长没 有 明显 影 响 。CMSWE(25 ～ 300 mg/L)对
MDA_MB_231 、TE_13和 A549细胞的增殖没有明显的影
响(P>0.05)(表 2),仅对 B16细胞的生长有抑制作用 ,
如图 1所示 ,且抑制效果显著低于 CMSEE(P<0.01)。
因此我们将对 CMSEE的抗肿瘤作用作进一步的研究。
2.2 肿瘤细胞形态学改变
倒置显微镜下观察 ,对照组细胞生长旺盛 ,大小均
一 ,贴壁生长 ,细胞轮廓清楚 ,透明饱满 ,成多边形 ,颗
粒较少 ,细胞间结构紧密 。经 200μg/mlCMSEE作用 24h
后 ,部分细胞体积变小 ,逐渐变圆并浮起 ,细胞间接触
变松 ,折光性及贴壁能力减弱(图 2)。Wright_Giemsa 染
色后在光学显微镜下观察 ,未经处理的 B16细胞呈圆
形 ,体积较大 ,呈紫红色 ,核仁多个 ,深紫红色 ,细胞质
淡蓝色;经 CMSEE(200、100、50mg/L)处理 24h后 ,部分
细胞发生凋亡特征性改变 ,细胞体积变小 ,染色质浓
缩 、深染 ,核碎裂成多个块状及凋亡小体形成等(图 3)。
2.3 细胞凋亡和细胞周期分布
结果见表 3 、图 4。经不同浓度 CMSEE(50 、100 、200
mg/L)处理 24h后 , B16细胞凋亡率明显增高 ,组间比
较有显著性差异(P <0.01), 200mg/L诱导的细胞凋
亡率可达 34.5%。G 0/G 1期细胞明显增加 ,处于 S 期 、
G 2/M期细胞减少 ,与对照组相比差异具有统计学意义
(P<0.01)。
0 0 2 1
论 著
癌变 畸变 突变
Vol.22 No.1
CARCINOGENESIS, TERATOGENES IS ＆ MUTA GENESIS
1月1 O
0 0 2 2
CARCINOGENESIS, TERATOGENES IS ＆ MUTA GENESIS
论 著
癌变 畸变 突变第 22卷 第 1期 1 O 1月
3 讨 论
蒙药木鳖子是一味散血热 、除痈毒之要药 ,临床上
主要用于治疗疮痈肿痛 、多种关节炎及皮肤病 ,疗效肯
定 。目前发现木鳖子入药对多种癌症具有治疗作用[ 2] ,
但迄今未见有关于木鳖子体内外抗肿瘤的实验研究 。本
实验提取了木鳖子的水提物(CMSWE)和醇提物
(CMSEE),对 4种不同组织来源的肿瘤细胞(人肺癌细
胞 A549 、乳腺癌细胞 MDA_MB_231 、食管癌细胞 TE_13、
黑色素瘤 B16)进行了体外生长抑制研究 ,结果表明 ,
CMSEE对 4种肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用 ,
对黑色素瘤细胞 B16的抑制作用最为明显 。而 CMSWE
只对 B16细胞有较弱的生长抑制作用 ,对其他 3种肿瘤
细胞的生长则无明显影响 ,提示木鳖子抗肿瘤活性成分
主要存在于醇提物。因此本实验以 B16为研究对象 ,对
CMSEE的抗肿瘤作用进行进一步的研究 ,为木鳖子抗
肿瘤活性物质的进一步分离 、提取 、纯化 、筛选抗肿瘤活
性成分及抗肿瘤机制的研究奠定了基础。
恶性黑色素瘤是来源于皮肤黑色素细胞的一种恶
性程度很高的肿瘤 ,突出特点为对多数化疗药耐药 ,转
移率和致死率高 ,病人生存期限仅为 6 ～ 10个月 [ 3]。大
量的研究表明 ,恶性黑色素瘤中细胞凋亡信号转导通
路中相关基因表达的“关闭” ,使其具备了强大的生存
能力 [ 4] ,是导致其对临床各种化疗药物耐受的主要原
因 。因此 ,寻找对黑色素瘤敏感的有效药物成为黑色素
瘤治疗的重点 。本研究结果发现 ,不同浓度 CMSEE(25、
50 、100 、200、300mg/L)对恶性黑色素瘤细胞 B16的生长
具有显著抑制作用 ,300mg/LCMSEE作用于 B16细胞 24
h 后 ,生长抑制率可达到 79.70%,且(50 ～ 200mg/L)
CMSEE作用 24h ,B16细胞均出现明显的凋亡形态学变
化 ,凋亡率明显升高 ,且可将 B16细胞阻滞于 G 0/G 1期 。
以上结果提示 ,CMSEE可诱导 B16细胞凋亡 ,有作为抗
黑色素瘤治疗进行开发利用的潜力 ,为黑色素瘤的治疗
提供新的有效的治疗手段 ,但其具体分子生物学机制尚
需研究证实 。
有报道提出 ,木鳖子为一种有毒的中药 ,但关于木
鳖子毒性的记载历代本草存在争议 [ 5-7]。《开宝本草》言
“无毒” ;《本草纲目》称其“有小毒” 。目前 ,对于木鳖子抗
肿瘤效应与其毒性剂量关系方面的研究尚未见报道 ,本
研究发现 ,CMSEE和 CMSWE在对肿瘤细胞有抑制作用
的浓度范围内 ,对外周血单个核细胞的生长均无显著影
响 ,提示 CMSEE对机体的免疫细胞没有损伤作用 。沈丕
安[ 8]报道 ,用木鳖子饮片水煎服治疗肿瘤和类风湿关节
炎的最大剂量为 3 ～ 9g ,没有发现明显的毒副作用 。但
是关于木鳖子抗肿瘤活性的浓度及其与毒性剂量的关
系尚需进一步研究 ,以确保用药安全有效 。
参考文献
[ 1] 林慧彬 ,安 芸 ,路俊仙 ,等 .中药木鳖子的研究进展[ J] .
时珍国医国药 , 2009 , 4(20):785-787.
[ 2] 林慧彬 ,彭湘军 ,路俊仙 ,等 .木鳖子的本草考证[ J] .四川
中医 , 2009 , 27(2):54-56.
[ 3] Grossman D , Altier DC.Drug resistance in melanoma:
mechanism apoptosis and new therapeutic targets [ J] .Cancer
Metast Rev , 2001 , 20:3-11.
[ 4] Soengas MS , Lowe SW. Apoptosis and melanoma
chemo_resistance [ J] .Oncogene , 2003 , 22(20):3138-3151.
[ 5] 王秀琴 ,李 檀 ,白宗利 .木鳖子素的分离与纯化[ J] .辽
宁中医杂志 , 2007 , 34(1):78.
[ 6] 闫 超 ,石飞军 ,刘 涛 ,等 .蒙药木鳖子的研究进展[ J] .
民族医药 , 2007 , 4(6):355-357.
[ 7] 刘文泰 .御制本草品汇精要[ M] .上海:上海科学技术出版
社 , 2005:769-770.
[ 8] 沈丕安 .中药药理与临床运用[ M] .北京:人民卫生出版社 ,
2006:888.
(下转第 47页)
(上接第 18页)
(2)发挥免疫调节作用 有人发现 ,添加番茄红素组小鼠体内 T细胞亚群 CD4 +:CD8 +比率提高 。异常 T淋巴细胞变异恢复正常 。
提示番茄红素通过使自身胸腺 T细胞变异恢复正常而发挥其免疫调节机理 。
(3)诱导细胞间隙连接通讯 细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication ,GJIC)功能对细胞的正常增殖分化以及
组织自身稳定等起着重要调节作用 。肿瘤细胞的恶性增殖可能与其 GJIC功能受到抑制或破坏有关 。有人在 C3H10T1/2细胞培养系统
中研究结果表明 , 番茄红素可使转化细胞与未转化的正常细胞之间的 GJIC功能得到恢复 , 因此转化细胞可以接受到正常细胞转导的
生长调控信号(如生长抑制因子等),从而减低转化细胞的恶性增殖 ,阻止转化表型的表达 。另有人在同一系统中进一步证实了上述观
点 ,并证实番茄红素是通过刺激细胞间隙连接通道蛋白家族中的一种 connexin_43基因表达 CN_43蛋白合成增加 。
0 0 2 3