全 文 ：第 25 卷 第 1期 细 胞 生 物 学 杂 志
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葫芦科作物转基因研究进展
于天祥 张明方
(浙江大学园艺系 杭州 3 10 02 9)
葫芦科作物是重要的世界性经济作物 , 品种丰
富 ,种类繁多 ,在蔬菜作物中占有极重要位置 。 其果
实中含有丰富的碳水化合物 、 矿物质和抗坏血酸。
葫芦科作物中的西瓜 、 甜瓜果实中还富含陈化酶 , 能
帮助分解食物中的蛋白质 ,深受人们喜爱 。 西瓜 、甜
瓜均被列人世界十大水果之列 , 我国的栽培面积和
总产量均占世界的 112 左右 。 葫芦科作物的遗传改
良被世界各国所重视 。 迄今为止 ,利用转基因技术
已经培育出抗病 、抗逆 、延迟成熟和高品质的葫芦科
作物品种 ,本文就转基因葫芦科作物的研究进展及
其发展方向作一简要综述 。
一 、 转基因体系的建立
通过有效的方法将外源基因导人植株是转基因
技术的关键 。 葫芦科作物的子叶外植体具有高效的
转化再生频率 , 广泛用于转基因再生体系 。 常用的
外源基因导人方法主要有农杆菌介导法 [ ’ 1 、花粉管
通道法 2[] 、 D N A 浸胚法 3j[ 和基因枪法 4[J ,其中农杆
B arn il
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细 胞 生 物 学 杂 志 2 00 3年
菌介导法是葫芦科作物最常用的基因导人方法 。
在葫芦科作物转基因植株的筛选中 , 新霉素转
磷酸酶 (N PT H )基因和 件葡萄糖昔酸酶 (G U )S 分别
为常用的选择基因和报告基因 , 相继用农杆菌介导
法建立了甜瓜 5[] 、 西瓜 t6] 和黄瓜 ;[] 等的高效转化体
系 。 萤火虫荧光素可以在光照下发出荧光 ,将荧光
素酶基因作为报告基因导人植株可对转基因植株进
行监测 。 19% 年 , sa ouP nt z ak i s 等8[] 将萤火虫荧光
素酶基因转人黄瓜 ,代替常规的 G U S 基因进行转化
植株的筛选 。
二 、 抗病转基因研究
1
. 抗病毒转基因研究
葫芦科作物病毒病是世界性的病害 , 凡种植地
区几乎都有发生 , 严重影响了葫芦科作物的产量和
品质 。 常见病害有黄瓜花叶病毒 ( uC cu m be : 卉肠叙 ic
iV
r u : , CMV )
, 西瓜花叶病毒 ( W凌et ~ 勿刀 几肠刃 ic
iV ur
: ,
w M v )
,南瓜花叶病毒 (匆 ua hs 几肠叙 ic vi r -
us
,匆M V ) , 西葫芦花叶病毒 ( uZ hc i in h 11此峨玉〕-
sa ic iV ur
: , Z Y MV ) 等。 其中最严重 的是 C Mv ,
匆MV 和 CM V ~ 2 。 他们单独或者混合侵染给葫芦
科作物生产带来严重威胁 。 传统的育种方式对抗病
基因的筛选监测非常困难 , 同时通过常规育种育成
的抗病品种 ,根据基因对基因假说 ,病毒又要不断分
化出新的株系 ,要不断育出新的品种增加对病毒的
抗性 ;并且常规育种周期长 ,难度大 , 获得的性状不
易稳定 [,1 。 通过基因工程育种创造新种质为这些问
题的解决提供了一条新的途径 ,成为葫芦科作物品
种改良的前沿生物技术 。 目前 ,人们已将许多种来
自病毒本身的基因导人植物 ,获得了抗病毒的工程
植物 。 如外壳蛋白 ( C )P 基因 ,病毒 R N A 基因和病
毒核酸等 。
利用病毒本身的一些基因或经过改造的基因导
人植物 ,可获得抗病毒的转基因植株 。 最早获得成
功的例子是使用病毒外壳蛋白( CP )基因〔’ 0] ,又称为
外壳蛋白介导保护 ( coa t port e i-n m ed i a t ed p ort e e t i n ,
CP M )P
。 病毒 R N A 进行复制要脱去本身的外壳蛋
白 ,通过导人的 CP 基因在植株内表达 , 干扰病毒的
正常增殖而达到抗病目的 [川 。 将病毒 cP 的 CD N A
片段导人植物基因组成为基因工程产生病毒抗性品
种的常用方法 。
1
90 年
,
isl hg 恤 等〔’ 21 将 C M V cP 编码基因导
人黄瓜 ,转化的黄瓜植株对 ( ) 涯V 高抗 ,并可遗传。 导
入病毒 CP 编码基因的黄瓜 [4 · ’ 3 ] 、南瓜 [4 , ” · ’ 8 ] 、西瓜 [4 ] 、
甜瓜 [’. ” , ’ 6] 植株 ,在相应病毒侵染下都表现出不同程
度的抗性。 1995 年 , G溯砂 等 [ , 9〕将 WM v 和 Z YM v
的 CP 基因整合到一个质粒载体 ,分别导人南瓜和甜
瓜 ,转化的南瓜和甜瓜植株对相应的病毒都有抗性 ,
经济产量显著高于对照 。 19 5 年 , irT col i 等〔” }获得
了抗 Z、 ,M V 、 C MV 和 w M V 三种病毒的南瓜品种 ;
19 7年 , uF 面等〔洲获得了抗 Z ” 功V 、 CM V 和 w M V
三种病毒的甜瓜品种 。
导人核酸酶基因可 以将人侵的病毒核酸降解 ,
从而达到抗病毒效果 。 将核酸酶基因导人植物获得
对病毒抗性的品种为瓜类作物抗病毒基因工程提供
了一条新的选择途径 。 1 9 9 9 年 , uH t t n e : 等口 〕分别
将 ZY M V 和 w MV 一 2 多聚核酶基因导人甜瓜 ,转化
植株分别对 Z Y M V 和 WM V - 2 病毒产生 高抗性 。
大田试验结果表明 ,抗 WM V ` 2 甜瓜植株的后代在
大田试验中对 节乃匹v ~ 2 表现为免疫 〔川 。
2
. 抗真菌转基因研究
西瓜 枯萎病是 由尖抱 镰刀 菌西 瓜专 化型
(uF sa ir
“ m 众叹邺加mr f… n i~ m ( E . f . S m it h )旦” 砚` ; et aH n sen )引起的土传毁灭性病害 ,世界各
地均有发生 。 瓤瓜适应性广 , 对西瓜枯萎病免疫。
将靓瓜的 D N A 导人西瓜 , 有可能获得高抗西瓜枯
萎病或具特异性状的新材料 , 1997 年 , 肖光辉等川
采用 D N A 浸胚法 , 将外源瓤瓜 D N A 导人西瓜 , 变
异株的生长势明显增强 , 主要表现为叶片增大 ,叶色
加深 , 叶柄增长 ,主蔓增长 ,节间长度增加 。 2D 植株
叶部病害较轻 , 无枯萎病 ;而对照西瓜叶部病害较
重 。
19 98 年 , C h e -n Sh a w C h e n 等 fZ ]通过花粉管途径
将抗镰刀枯萎病基因导人西瓜 。 从南瓜叶子中提取
了对枯萎病抗性的总 D N A , 携同花椰菜花叶病毒
6 MV 35S 启动子与 G U S 基因注射导人西瓜 1F 代
杂种的胚珠 ,通过人工授粉获得转基 因杂种 。 转化
植株表现出枯萎病抗性 , 用 R AP D 分析 , 检测 出和
南瓜相同的特异扩增条带 。
几丁质酶 (hC it n ase )可以有效的保护作物免受
真菌性病害侵染 。 灰霉病是黄瓜栽培中的主要病
害 , 19% 年 , R a c h劝。 等 23[ ]用农杆菌介导法将水稻
几丁质酶 c D N A ( R C巴 )转人黄瓜 。 No r t h e m 杂交
试验表明 , cr 己 基因可 以在黄瓜中正常表达 ,转化植
株对灰霉病表现出高抗性 。 对抗性黄瓜株系进行杂
交试验 ,在后代中呈现出 3 : 1 的分离 比例 , 表明灰
霉病抗性性状受一对显性基因控制 ,可 以在黄瓜后
代中稳定遗传〔24] 。
第 25 卷 第 1期 细 胞 生 物 学 杂 志 31
19 9 年 , S z w ack a 等 25[ 〕用农杆菌介导法将甜蛋
白基因 ht o u ~ t动 1 c D N A 导人黄瓜 , 蛋白质杂交
结果表明 , hat u ma 瓦n l 可 以在黄瓜叶子和果实中
正常转录 ,霜霉病接种试验结果显示转化黄瓜植株
能够抑制霉菌在植株体内的扩散 , 对霜霉病表现出
较高的抗性 [ 2 6 ] 。
三 、 耐逆境转基因研究
酵母菌 hl al 基因具有较高的盐抗性 ,可 以在高
浓度 N aCI 下生长 。 1 992 , 反r ~ 等田〕用农杆菌介
导法将 h勿 I 基 因转 人甜 瓜 。 乳 u t h ern 杂交 和
n o r t he m 杂交试验结果表明 , hl al 基因转人甜瓜基
因组 ,并能正常转录 。 在 10 9 . 1一 , N aCI 培养基下
, 转
人 hl al 基因甜瓜在离体培养状态有 巧% 一 20 % 的
茎尖端可以正常生根 , 而未转人对照只有 2 % 可 以
正常生根 ,导人的 h la l 基因对 N aCI 产生较高抗性 。转人 hl al 基因的西瓜〔28] 在离体培养状态也对 N aCI
产生较高抗性 。
19 3 年 , K od ~ 等 29[
}用基因枪法将发根基因
olr 导人黄瓜 , sou t he m 杂交结果表明 or l 基因整合
到黄瓜的基因组 ,转化的黄瓜植株生根能力 明显增
强 ,在离体培养状态 ,不使用激素就可以正常生根 ,
提高了黄瓜逆境生存能力 。
细胞膜是冷冻伤害的原初部位 ,而冷冻低温引
起的氧自由基积累引发膜脂过氧化是导致细胞膜伤
害的主要原因 ,植物本身也有分解氧自由基的解毒
体系— 抗氧化酶系统 , 因而植物抗冻力与其对氧自由基 的清除力密切相关 〔30] 。 19 94 年 , o hk aw a
等 l3[ 〕通过基因枪法将抗坏血酸氧化酶基因导人黄
瓜 , G U S 监测结果显示抗坏血酸氧化酶基因导人黄
瓜 ,转化黄瓜植株抗寒能力显著增强 。
五 、 品质转基因研究
1
. 果实特异调控基因工程
外源基因在转化植物中的定向 、高效特异表达 ,
一直是基因工程研究的热点和难点 。 随着分子生物
学研究的深人 ,利用基因工程手段定向控制果实的
发育 、改良果实的品质成为可能 。 1 997 年 , hS et yt
等 34[ 〕将烟草发病机理相关基因 p而 的启动子序列
融合郡: 基因导人甜瓜 , gu : 基因在甜瓜果实中正
常表达 ,并且水杨酸处理可以增强 P而 启动子的表
达 。 在环境胁迫条件下或者用水杨酸处理可以利用
lrP
a 启动子序列驱动 目的基因在甜瓜果实中特异
表达 。 为通过基因工程改良甜瓜食品加工相关的性
状和用甜瓜生产食品工业相关的特异蛋白提供了潜
在的可能 。
2
. 果实甜味品质基因工程
目前人们对食品饮料中低热量的甜味剂的要求
不断提高 。 甜蛋白是一种高甜度 、低热量 ,又不易为
细菌所利用的特殊蛋白质 ,并且还是一种味觉增进
剂 ,因此是一种很有发展前途的食品添加剂 ,具有很
高的经济价值 。
19 9 年 ,阮 w a c k a 等 25[ 〕通过农杆菌介导法将甜
蛋白 tha u ma t认 H 基因 己。N A 导人黄瓜 ,在转化黄
瓜植株的果实中 tha u~ t认 基因得到表达 , 并且可
以品尝出甜味 。
六 、 葫芦科作物基因转化的前景
四 、 延熟转基因研究
葫芦科作物果实的成熟过程属于呼吸跃变型 ,
成熟过程快 , 容易过熟而变质 。 目前在用基因转化
技术抑制细胞壁的降解和乙烯的合成以延迟瓜类的
成熟 , 防止其腐烂方面取得较好的效果 , 反义 m R -
N A 技术在抑制乙烯合成 , 延长果实的储藏和保鲜
研究中取得了成功 。 用农杆菌将反义 A CC 氧化酶
基因导入植株 ,表达反义 AC 氧化酶的西瓜 32[ 〕、 甜
瓜 〔3j 等 ,果皮色素含量 、 细胞壁降解酶的活性明显
降低 ,在空气中放置不能正常成熟 , 不出现呼吸高
峰 ,只有经过乙烯或丙烯处理才能表现出正常果实
的颜色 、风味 。
转基因作物存在着潜在的安全性问题 。 抗病毒
转基因植物的风险来源于病毒的基因与侵染转基因
植物的另一病毒基因组可能相互作用 , 主要包括重
组 、异源包壳和协生作用 s5[ J。 转基因植物还存在着
食品安全性问题 ,包括毒性 、过敏性以及抗生素标记
的安全性等问题 。 20 01 年 , R e d J 等 e3[ 」用甘露糖-
6
一磷酸异构酶 ( PM )I 基因取代常规的 nP lt l作为一
种有效的选择标记 。 PM I 可 以促进果糖 一6 一磷酸和
甘露糖一6 一磷酸的可逆转换 。 不含有这种酶的植物
细胞在用甘露糖作为碳源的培养基上不能生存 。 表
达的 PM I蛋白可以完全为哺育动物的胃液和肠液
消化 ,完全没有毒性 。 PM I作为一种新型的选择标
记 ,在瓜类的基因转化中将有广泛的应用前景 。
抗病毒基因工程在植物基因工程中一枝独秀 ,
其应用前景十分引人瞩 目。 运用 CP M P 策略成功
得到不同程度的抗病毒葫芦科作物品种 ,但是随着
本领域研究的深人 ,多项数据表明 ,转基因植物的抗
细 胞 生 物 学 杂 志 2 0(] 3 年
性主要取决于 R N A 的表达程度 , 而不是 CP 基因在
植物体内的积累 37[ , 38] 。 ’ cP 高表达的植株并不一定
对该病毒高抗 ,但是 CP 低表达的植株一定低抗 37[ 」,
R N A 介导的保护而非 CP M P 的机理更有说服力 。
与 CP州 P[ 相比 , R N A介导的抗性具有高抗或免疫 、
抗病持久和生物安全性高的特点〔川 ,而在葫芦科作
物中却鲜见报道 。 R N A 介导的抗性作为一种新的
抗病策略 ,具有潜在的应用价值 。 葫芦科作物枯萎
病是一种毁灭性的病害 , 而相应的抗源却非常稀少 ,
在生产上造成了巨大的经济损失 。 通过基因工程产
生抗枯萎病的品种将成为今后葫芦科作物转基因研
究的热点 。
葫芦科作物的基因转化研究与生产正在蓬勃发
展 , 1994 年 , 美国转基因抗病南瓜通过了农业部食
品安全性检验〔30J ;同年日本的一个转 。 M飞几cP 的
甜瓜通过了日本农林部和渔业部的安全性检验〔40] ,
并用于商业化生产 。 随着转基因技术的深人发展和
转基因植物的安全性进一步得到保障 ,葫芦科作物
基因转化工作必将得到飞速的发展 。
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