全 文 ： 2008;34 (2) 蚕 业 科 学 CANYE KEXUE
收稿日期:2007-12-15
资助项目:辽宁省重点实验室专项课题 [编号 辽科发(2005)36] 。
作者简介:叶青雷(1981-),男 ,沈阳 ,硕士研究生。
E-mail:yeqinglei2008@yahoo.com.cn
通讯作者:王学英 ,教授 ,博士生导师。
E-mail:yingxuewang2003@yahoo.com.cn
槲树 DNASSR-PCR反应体系的正交优化
叶青雷 王玲玲 藏 楠 陈 丹 王学英
(沈阳农业大学生物科学技术学院 ,辽宁省农业生物技术重点实验室 ,沈阳 110161)
摘 要 利用正交设计 L16(45)对槲树(QuercusdentataThunb.)基因组 DNASSR-PCR反应体系的 5个因素(Tap
酶 , Mg2+, , 模板 DNA, dNTP, 引物)在 4个水平上进行优化试验 , 筛选出各反应因素的最佳水平 , 建立了槲树模板
DNASSR-PCR反应的最佳体系(20 μL):60 ng模板 DNA, 2 mmol/LMg2+, 0.075 U/μLTaq酶 , 0.4 mmol/L
dNTP, 引物浓度 0.1 μmol/L。对槲树 DNASSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验 , 最佳退火温度
为 51.3 ℃。
关键词 槲树;SSR标记;反应体系;正交设计
中图分类号 S889 +.9 文献标识码 B 文章编号 0257-4799(2008)02-0307-05
OptimizationofSSR-PCRReactionSystemofQuercusdentata
byOrthogonalDesign
YEQing-Lei WANGLing-Ling ZANGNan CHENDan WANGXue-Ying＊
(BiologicalScience＆TechnologyColege, ShenyangAgriculturalUniversity,
KeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnologyofLiaoningProvince, Shenyang110161, China)
Abstract OrthogonaldesignwasusedtooptimizeSSR-PCRamplificationsystemforQuercusdentataThunb
intermsof5factors(TaqDNApolymerase, Mg2+, DNAtemplate, dNTPandprimer)from 4levels.Anoptimal
SSR-PCRsystem forQuercusdentataThunbwasobtainedas60 ngDNA template, 2 mmol/LMg2+,
0.075 U/μLTaqDNApolymerase, 0.4 mmol/LdNTP, and0.1 μmol/Lprimerfor20μLreactionsystem.The
optimalannealingtemperatureforSSR-PCRreactionsystemwasdeterminedas51.3 ℃ bygradientPCR.
Keywords QuercusdentataThunb.;SSRmarkers;Reactionsystem;Orthogonaldesign
槲树 (QuercusdentataThunb.)属壳斗科 (Fa-
gaceae)栎属(Quercus)植物 ,其分布范围广 ,分布区
内生态环境复杂 ,种群间遗传差异明显 [ 1] 。研究槲
树种群间的遗传多样性 ,可为槲树的遗传改良 、优良
品种选育和种质资源保存工作提供科学依据。分子
标记方法是研究物种种群间遗传多样性的主要手段
之一 ,其中 SSR(simplesequencerepeat)标记方法倍
受人们青睐 。 SSR是一类由几个碱基组成的基序
(motif)串联重复而成的 DNA序列 ,由于 SSR标记
呈共显性遗传 ,符合孟德尔遗传规律 ,能用 PCR扩
增提供高质量的信息以及在单个微卫星位点上可做
共显性的等位基因分析 ,因而具有试验重复性好 ,结
果可靠性高等优点 [ 2-4] 。然而 , SSR-PCR的扩增结
果往往受到多个因素的影响 ,如模板用量 、Mg2 +浓
度 、引物浓度 、Taq酶用量 、退火温度等 。为了确保
SSR标记用于槲树种群间遗传多样性分析结果的可
靠性和可重复性 ,笔者以槲树基因组 DNA为材料 ,
用正交试验法探讨影响 SSR-PCR反应的多个因素 ,
建立了槲树 DNASSR-PCR的最佳反应体系 。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用槲树叶于 2007年 5月下旬采于沈阳
307
DOI :10.13441/j.cnki.cykx.2008.02.007
农业大学柞蚕场 , 6份不同地区槲树叶分别来源
于沈阳 、长山岛 (辽宁)、铁岭 、丹东 、北京 、烟台 。
提取槲树叶基因组 DNA作为 SSR-PCR反应的模
板 , Taq酶 、dNTP、Mg2 +均购自 TIANGEN公司 ,引
物购自上海生工生物工程公司 。以初步筛选出
的引物 (5′CAGCCTCATCGATTACCCCAAAC3′、
5′GGTCGCTGAGGGGGAAAG3′)作为正交试验
的固定引物 [ 5-7] 。标准分子量 (marker)λDNA/
HindⅢ 、 50 bpDNAladder均购 自 TIANGEN
公司 。
1.2 槲树基因组 DNA的提取
分别采用改良 CTAB法 [ 8] 和 SDS法[ 9]进行对
比提取试验 ,用 0.8%的琼脂糖电泳 。
1.3 槲树基因组 DNASSR-PCR扩增
PCR扩增反应在 TC-512梯度 PCR仪上进行 ,初
步反应程序及条件为:95℃预变性 4min, 94℃变性
1min, 50 ℃复性 2min, 72℃延伸 1min共 32个循
环;72℃延伸 10min, 4 ℃保存。 PCR产物用 3%琼
脂糖凝胶(含 0.5μg/mLEB)于 3V/cm电压下电泳 ,
电泳结果用 Bio-Rad公司的 GelDocXR凝胶成像系
统拍照保存 ,记录结果。
1.4 SSR-PCR反应因素水平的确定与正交试验
设计
为了确定 PCR反应中模板 DNA 、Tap酶 、
dNTP、Mg2+、引物等 5因素的最佳水平 ,采用正交
L16(45)在 4水平上进行试验 [ 10, 11] 。槲树 DNASSR-
PCR反应中的各因素水平见表 1, L16(45)设计方案
见表 2。
表 1 槲树 DNASSR-PCR反应的因素水平
Table1 FactorsandlevelsofSSR-PCRreactionforQuercusdentataThunb.genomicDNA
水平
Level
因素 Factor
dNTP浓度 /
(mmol·L-1)
dNTPconcentration
Mg2+浓度 /
(mmol·L-1)
Mg2+concentration
Taq酶浓度 /
(U·μL-1)
TaqDNA
polymeraseconcentration
引物浓度 /
(μmol·L-1)
Primersconcentration
模板质量 /
ng
TemplateDNAcontent
1 0.1 1.5 0.025 0.10 30
2 0.2 2.0 0.050 0.20 40
3 0.3 2.5 0.075 0.30 50
4 0.4 3.0 0.100 0.40 60
表 2 槲树 DNASSR-PCR反应的因素水平 L16(45)正交试验设计
Table2 L
16
(45)orthoronaldesignforSSR-PCRfromQuercusdentataThunb.genomicDNA
编号
NO.
dNTP浓度 /
(mmol·L-1)
dNTPconcentration
Mg2+浓度 /
(mmol·L-1)
Mg2+concentration
Taq酶浓度 /
(U·μL-1)
TaqDNA
polymeraseconcentration
引物浓度 /
(μmol·L-1)
Primersconcentration
模板质量 /
ng
TemplateDNAcontent
1 0.1 1.5 0.025 0.10 30
2 0.1 2.0 0.050 0.20 40
3 0.1 2.5 0.075 0.30 50
4 0.1 3.0 0.100 0.40 60
5 0.2 1.5 0.050 0.30 60
6 0.2 2.0 0.025 0.40 50
7 0.2 2.5 0.100 0.10 40
8 0.2 3.0 0.075 0.20 30
9 0.3 1.5 0.075 0.40 40
10 0.3 2.0 0.100 0.30 30
11 0.3 2.5 0.025 0.20 60
12 0.3 3.0 0.050 0.10 50
13 0.4 1.5 0.100 0.20 50
14 0.4 2.0 0.075 0.10 60
15 0.4 2.5 0.050 0.40 30
16 0.4 3.0 0.025 0.30 40
308 蚕 业 科 学 2008;34(2)
1.5 SSR-PCR最佳反应体系的退火温度筛选
在试验确定的最佳反应体系基础上 ,对试验所用
引物的退火温度进行优化筛选。利用 TC-512梯度
PCR仪进行 PCR反应程序中退火温度梯度试验。
1.6 最佳反应体系的验证
选择引物(5′CAGCCTCATCGATTACCCCAAAC-
3′、5′GGTCGCTGAGGGGGAAAG3′)对 6份不同地
区槲树 DNA进行 SSR扩增 ,对优化确定的槲树 DNA
SSR-PCR体系及反应参数的稳定性进行检测。
2 结果与分析
2.1 槲树基因组 DNA的提取结果
通过图 1可以看出 , 改良 CTAB法[ 8] 提取的
DNA较 SDS法 [ 9]提取的 DNA质量好 ,污染少 ,并且
改良 CTAB法提取槲树基因组 DNA可以有效去除
其中的多糖 、酚类等次生代谢物[ 12] 。
M.λDNA/HindⅢ 1-4.改良 CTAB法提取 5-8.SDS法提取
M.λDNA/HindⅢ 1-4.GenomicDNAisolatedbytheimprovedCTABmethod 5-8.GenomicDNAisolatedbytheSDSmethod
图 1 不同方法提取槲树基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 ElectrophoresisresultsofgenomicDNAisolatedfromQuercusdentataThunb.leavesbydifferentmethods
2.2 槲树基因组 DNASSR-PCR反应的优化体系
按正交试验(表 2)设计的 16个处理组合进行
PCR反应后 ,将得到的产物进行电泳 ,结果如图 2。
在 16个处理组合中由于 Tap酶 、dNTP、Mg2+、
模板 DNA、引物 5个因素组合的不同 , PCR扩增的
效果存在着明显的差异 。其中:第 2、 3、4、 7、8、 9、
10、15组合均产生了不同程度的次级扩增;第 3、4、
5、6、9、10、11、13、15、16组合均不同程度地扩增出
了小于100bp的引物二聚体片段;第 1、14组合均有
稳定的 PCR扩增带 ,但第 1组合扩增产物量少 ,条
带不清晰 , 而第 14组合扩增产物量高 , 条带清晰
明亮 。
比较上述试验结果 ,可以看出槲树 DNASSR-
PCR反应的最佳体系(20 μL)为:60 ng模板 DNA,
2mmol/LMg2 +, 0.075U/μLTaq酶 , 0.4 mmol/L
dNTP,引物浓度 0.1 μmol/L。
泳道的编号与表 2的组合编号对应; M为标准分子质量 50bpDNAladder
ThelanenumbersassameasintheTable2; M.50bpDNAladder
图 2 不同处理组合提取槲树基因组 DNA的 SSR-PCR产物电泳结果
Fig.2 ElectrophoresisresultsofSSR-PCRproductsofQuercusdentataThunb.genomicDNAisolatedbydifferentmethods
309 第 2期 叶青雷等:槲树 DNASSR-PCR反应体系的正交优化
2.3 SSR-PCR最佳反应体系的退火温度
不同的引物退火温度可能不同 。PCR反应中 ,
退火温度的高低直接影响引物与模板 DNA的特异
性结合 。根据以上所得的最佳因素水平 ,利用 TC-
512梯度 PCR仪进行 PCR反应程序中退火温度梯
度试验 。设置退火温度 50 ℃、■6 ℃,扩增仪自动
生成 12个梯度 ,对所得 PCR产物用 3%的琼脂糖凝
胶进行电泳检测。图 3显示:退火温度过低 ,则产物
多为非特异性扩增 ,且有二聚体出现 ,结果不可靠;
退火温度过高 ,引物与模板结合差 , PCR产物丰度
低 ,电泳条带亮度差 。因此 ,采用本试验选用的引
物 ,以 51.3 ℃的退火温度 ,可扩增出清晰的 SSR靶
目标带(图 3第 9泳道)。
1-12依次表示退火温度为:47.5、47.8、48.3、48.9、49.3、 49.8、50.1、 50.9、51.3、 52.0、52.5、 53.0℃
M.标准分子质量 50bpDNAladder
1-12representtheannealingtemperatureof47.5, 47.8, 48.3, 48.9, 49.3, 49.8, 50.1, 50.9, 51.3, 52.0, 52.5and53.0℃, respectively
M.50bpDNAladder
图 3 SSR-PCR反应体系在梯度退火温度下的电泳结果
Fig.3 ElectrophoresisresultsofSSR-PCRproductsbydifferentannealingtemperature
2.4 SSR-PCR最佳反应体系的稳定性
应用上述最佳反应体系 ,用引物(5′CAGCCT-
CATCGATTACCCCAAAC 3′、 5′GGTCGCTGAGGGG-
GAAAG3′)对 6份不同地区槲树材料的基因组
DNA进行 SSR扩增 ,结果如图 4。
引物对每份槲树材料基因组 DNA样品均在
180 bp左右扩增出清晰的目的条带 ,说明该体系稳
定 ,适用于槲树基因组 DNA的 SSR标记。
M.标准分子质量 50bpDNAladder 1-6.分别来自沈阳 、长山岛(辽宁)、铁岭 、丹东 、北京、烟台的槲树材料
M.50bpDNAladder 1-6.TheoriginsofQuercusdentataThunb.areShenyang, Changshandao(Liaoning),
Tieling, Dandong, BeijingandYantai, respectively
图 4 应用最佳反应体系对 6份不同地区槲树材料基因组 DNA的 SSR扩增结果
Fig.4 TheSSRamplificationresultofQuercusdentataThunb.genomicDNAfrom6 originsbyusingtheoptimalreactionsystem
3 讨论
本试验采用正交设计方法研究了槲树基因组
DNASSR-PCR反应体系 ,并对结果进行了验证 。引
物浓度偏高是出现引物二聚体的主要原因 ,在降低
引物浓度基础上 ,适度增加模板 DNA用量是去除引
物二聚体的有效方法 。 Mg2+浓度过高易出现非特
异性扩增 ,过低则影响 Taq酶反应活性 。引物不同
310 蚕 业 科 学 2008;34(2)
对最佳退火温度的要求也不同 ,温度高 ,扩增产物的
特异性强 ,而温度低则非特异性扩增明显 ,因此 ,采
用不同的引物时 ,需要首先进行梯度退火试验 ,以确
定最佳的退火温度。
SSR体系优化的方法有多种 ,一般均采用多次
单因素设计的方法[ 11] 。在 Taq酶 、Mg2+、随机引物 、
dNTP、DNA模板 5种因素中 ,逐一变化其中一种组
分浓度而固定其余 4种 ,从中分析得到每一因素的
最佳浓度 ,最后组合成为最佳反应体系。然而 ,这种
方法不能有效地考察 PCR体系中各组分的交互作
用 。完全组合设计[ 13]虽然可以考察 PCR体系中各
因子的相互作用 ,得到的最佳反应体系也较稳定 ,但
要做大量的 PCR扩增工作 ,试验周期较长。本研究
采用正交设计则是从复因子试验的结果中挑选几个
处理进行试验 ,得到了具有代表性的结果 。正交设
计相对于单因素设计减少了许多处理组合 ,从而节
省了人力和物力 。
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基因的符号或数字用正体 , 如:大肠杆菌 aroG基因 、突变基因 argSΔr245。基因表型产物符号用正体。蛋白名称的英文缩写用
正体 , 首写字母大写或全部大写。
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