全 文 ：第 2卷 第 2期
1 9 9 3 年 6月
激 光
LA E S R
生 物 学
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1 9 9 3
激光诱导金盏菊原生质体融合
方 法 初 探 ’
卜宗式 白洁玲 李曙光 戴东旭 迟红武 孙巨龙
(中国科学院大连化学物理研究所 ,大连 , 1 1 6 0 1 2 )
安利佳 张相歧 王洪庆
(辽宁师范大学生物学系 ,大连 , 1 6 0 2 2)
摘 要 本文简述运用激光微束诱导金盏菊 ( ca le dn ul a o if d an ils L . )叶肉细胞原生质体融合的方法和初
步结果 ,并就激光诱导植物原生质体融合的条件进行初步讨论 。
关键词 激光徽束 ,原生质体 ;融合
分类号 Q 6 3 ; Q 3 4 ; T N 2 4 , 5 6 5
A P R C L I M IN A R Y S T U D Y O N M E T H O D F O R L A S E R一 I N D U C E D F U S IO P N
O F P R O T O P L A O T S O F C A L E N D U L A O F F IC IN A L I S L
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K e y w o r ds L
a s e r m i e r o b e a m ; P r o t o p l a s t ; f u s i o n
.
. 在北京第五届全国激光生物学学术会议上的发言 。本文收稿 日期 : 19 9 3一 0 3一 1 6
第 2 期 卜宗式等 :激光诱导金盏菊原生质体融合方法初探 2 8 3
七十年代初 , 用 N . N 。 : 诱导植物原生质体融合获得初步成功 ,但诱导频率极低 。 高国楠用聚乙
二醇 (P EG )与高 C+a 十 、高 P H 相结合的方法获得了 1 0一 50 %的融合频率 ,现已成为应用最为
广泛的融合手段 。 P E G 和高 aC 十+ 、高 几溶液对原生质体有损伤 ,且融合频率越高 ,伤害可能
越大 . aB et s 等 ( 1 9 87 )用电融合法诱导烟草种内体细胞融合 ,获得了高于 P E G 法 1 0一 10 0 倍的
杂种克隆形成率 。 电融合法仍属非特异性融合法 ,还不能解决两亲本细胞间特异配对融合问
题 。 其正弦交变电场的长时间作用 , 特别是高压电脉冲作用于整个细胞 ,会造成细胞活力的损
伤 。 近年发展起来的激光诱导细胞融合技术 ,能在正常的细胞培养基中诱导细胞融合 , 从而避
免了诱导剂对融合细胞的化学毒害 ;激光微束垂直作用于融合细胞接触部位的质膜徽区 ,对细
胞内部无损伤 ;对于融合细胞可以通过显徽镜逐一进行选择 , 从而实现了两订本细胞的特异性
融合 ,并且有可能简化杂种细胞的筛选过程 。 W ieg an d 等 ( 1 9 8 7 )报道了激光诱导油菜原生质体
融合的结果 。 国内尚未见激光诱导植物细胞融合的报道 。 1 9 9 2 年 ,我们试用金盏菊叶肉细胞原
生体探素激光诱导植物体细胞融合的方法 ,取得了初步成功 。
1 实验装置
激光诱导细胞融合的实验装置即激光微束系统主要由激光器和荧光显微镜构成 . 本实险
采用 E M G一50 型准分子激光器 , 内充 F 、 X e 、 H e 混合气体 , 经高电压激发 ,产生 3 5 I n m 波长的
脉冲式紫外激光 。发射光用一个直角棱镜和两个平面反射镜导入荧光显微镜 ,通过外加光栏和
显微镜 ( X S Y一 1型 ) 内部装置限制人射光时 , 借以调节激光能量 。 激光经显微镜的高倍物镜
( 10 OX ) 聚焦 ,成直径约为 lu m 的激光微束 。
2
一 材料与方法
用于制备原生质体的植物材料要先作预处理 。 在本实验中 ,采摘金盏获植株中部叶片 ,将
下表皮朝上 ,置于温度为 20 一 25 ℃ 、光照强度为 5 0 0 。一 I Oo 0 L u x 的环境条件下处理 1一 2 小
时 . 然后剥去下表皮 , 将叶片分割成小块 ,放入 内装混合酶液的培养瓶中 。 将培养瓶置于 25 ℃
水浴中保温 l一 1 . 5 小时 。 取出培养瓶 ,轻轻摇动 ,倾出瓶内悬浮液 ,用 4 0 目尼龙网过滤 , 收集
滤液 . 滤液在 5 0 o r pm /m in 转速下离心 1 分钟 ,弃去上清液 , 沉淀用缓冲液悬浮 。 重复离心三 、
四次 ,最后沉淀用少量缓冲液悬浮 , 即得较纯净的高密度原生质体悬浮液 .
取少量原生质体悬浮液置于显微镜视场中 ,选择形态正常 、 接触紧密的细胞对 ,将其质膜
接触区对准激光微束作用位点 。 开启工作激光 , 由小到大地调节激光能量 。 当激光能量达到某
尸最适范围时 ,两原生质体接触区的质膜受到扰动 ,通透性发生变化 ,随即开始融合 。
3 结果与讨论
根据我们的初步经验 , 当照射到细胞膜上的激光微束的能量密度约有 0 . ZuJ u/ m Z (参照激
光光路中各光学器件对强激光的衰减率计算而得 ) 时 ,对被选择融合的细胞对接连施加 40 一
5 0 脉冲 , 可导致金盏菊叶内细胞原生质体融合 。 在原生质体开始融合的瞬间 ,两原生质体实然
向接触面靠拢 ,而后逐渐由哑铃形变为椭球形 、 球形 (附图 )历时约 2 小时 。
影响原生质体融合的因素很多 ,除环境因素如温度 、 光照以外 , (下转 第 2 75 页 )
第 2期 霍利琼等 : N D十 .Y A G激光治疗基底细胞癌应用研究 25 7
6.5 存在的问题
5 6.
.
1 N+ d
` :
Y A G激光治疗时产生的烟雾 ,对人体有害 , 有条件的单位需安装排风或吸烟设
备 。
6
.
5
.
2 N +d
’ :
Y A G 激光为不可见光 , 但长时间接触 , 对眼睛有伤害作用 , 需注意眼睛的保护
和适当的保健 。
参考文献
1 徐国祥主编 : 《激光医学》 ,广东教育出版社 19 87 . P 50 一 51
2 郭中和主编 : 《激光血叶琳诊治恶性肿瘤研究 . 资料汇编 》 ,中国人民解放军总医院 76 年 P 47 ~ 50
3 王自彬主编 : 《实用皮肤美容治疗学 》 , P 3 05 ~ 3 09
4 彭大文主编 : 《激光医学讲义》 , 四川激光医用中心编辑 , 19 87 . P 28 ~ 31
5 吴江等 : 《医用激光研究与临床》 , 1 9 9 o N 。 : 4 . 29
6 杨崇江等 : 《医用激光研究与临床 》 , 1 990 N 。 : 4 . 27
(止接 第 2 8 3 页 )
主要来自激光和原生质体两外方面 :
3
.
1 激光诱导原生质体融合 ,对激光能量的要求十分严格 ,实验过程中须要精细调节 。能量过
大 。 会产生轰击效果 ,原生质破裂 ,原生质外流 ;能量达小 ,原生质无显著反应 。 为提高融合成
功率 ,应根据不同类型的激光器 ,采取不同的激光能量细调节方法 , 以期警告精确而稳定的能
量密度 。
3
.
2 激光微束作用位点及光斑形状 、 大小对融合成功率亦有很大影响 。 激光微束作用位点偏
离两细胞质膜接触区 ,往往导致其中一个细胞破裂 。 光斑过大或形状不规则 ,则往往导致两个
细胞同时破裂 。 激光微束作用位点的精确性以及光斑大小 , 取决于光束直径 ,从根本上取决于
激光器的性能 。 发射光的平行度越高也就越小 ,作用位点就越精确 。 光斑形状和能量密度分布
与平面反射镜的位置和空间取向有关 。 此外 ,从经验中得知 ,激光通过显微镜物镜聚焦平面与
成象清晰时的原生质体排列平面不重合 , 为保证激光微束作用位点的精确性 ,实验中应细微调
节载物台高度 .
3
.
3 细胞融合是活细胞的生命现象 ,细胞保持旺盛的生活力是细胞融合的前提条件 。 在整个
实验过程中 ,从植物材料的予处理 , 到原生质体的制备和保存 , 以及实验过程中对环境条件的
控制 ,都要时刻注意保持原生质体的生理活性 。 此外 。 用于制备和保存原生质体的缓冲液的渗
透压要适当 , 以防原生质体皱缩变形或极度膨胀而易于破裂 ,从而不利于融合 。
参考文献
I W i
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,
R
, e t a l
,
J
,
aC ll sc i
,
8 8
,
/4 5一 1 4 9 , 1 9 8 7 .
2 张闻迪等 : 生物工程学报 , 4 ( 4) : 2 98 一 303 , 19 8 .8
3 郑强等 :生物工程学报 , 5 ( 3 ) : 1 85一 1 9 0 , 1 9 8 9 .