全 文 ：第 30卷第 2期　　　　　　　　　　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) Vol. 30, No. 2
2 0 0 1年 6月　　　　　　　　　　　 J. of Shanghai Teach ers Univ. ( Natu ral Sciences ) Jun . 2 0 0 1
不同花色金盏菊的 RAPD分析
许　燕 , 李建粤 , 葛继林
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要: 利用 RAPD分析技术 ,选取 13个具有 10个碱基长度的随机引物 ,对开淡黄色花
和橙色花的金盏菊进行了扩增反应 .在对扩增产物进行琼脂糖电泳后显示:有 9个随机引
物扩增出条带 ,一共扩增出条带 89条 ,平均每个随机引物扩增约 10条 ;在 9个随机引物
中 ,有 3个引物扩增的条带在两种不同花色金盏菊中有差异 .此项研究结果将为分析控制
淡黄色和橙色花色有关的基因提供一点新的思路 .
关键词: RAPD分析 ; 随机引物 ;金盏菊
中图分类号: Q943　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-5137( 2001) 02-0072-05
0　引　言
　　　　　　　　　　
收稿日期: 2000-11-20
作者简介: 许燕 ( 1962-) ,女 ,上海师范大学生命与环境科学学院副教授 ;李建粤 ( 1958-) ,女 ,上海师范大学生
命与环境科学学院副教授 .
自然界中不同种类的花卉 ,颜色繁多 ,但就每一种花卉而言 ,颜色有限 ,如玫瑰、康乃馨、郁金香
等缺乏蓝色和紫色 .随着经济发展和社会进步 ,人们对于花卉尤其是在花色上有新特点的品种需求
越来越强烈 ,因此 ,花色改良一直是育种工作者的重要目标 .郑志亮等 [1, 2 ]认为花色是花瓣所含色素
为主体呈现出来的 .色素可分为 3大类群:黄酮类色素 ( Flav onoids) ,胡萝卜素类色素 ( Ca rote)及甜
菜色素 ( Betalains) ,有人 [3 ]认为这 3大类色素的合成都涉及到多个代谢步骤 ,多种酶催化 , 与之相
关的结构基因及调控基因也可能较多 ,它们的作用机理十分复杂 ,缺乏相应基因会导致花某些颜色
的缺失或改变 .
近年来植物分子生物学的迅猛发展和基因工程的实用化 ,为花卉性状改良提供了全新思路 ,花
卉基因工程已成为花卉育种最有前途的新技术 . 改变花色的转基因花卉是基因工程中改良工作最
多的方面 [2～ 5] . M EYER[ 6]等 ( 1987)首次将一个源于玉米的基因导入矮牵牛 ,创造出新的花色 .还有
人应用反义 RNA技术抑制色素合成酶基因的表达 ,达到修饰花色的目的 ,并在矮牵牛上应用获得
成功 [2 ] .基因工程进行花色改良首先需要获得目的基因 ,有关花色素代谢相关基因的分离和研究一
直是研究热点 .目前 ,一大批调控植物花色的结构基因与调节基因已被分离和克隆 [ 5, 7] ,利用外源基
因导入 ,反义基因及共抑制原理已培育出了新色系观赏植物品种 ,因此利用花色素代谢的有关基
因 ,对观赏植物的色彩改良具有十分广泛的前景 .
90年代兴起的遗传标记技术 RAPD( Random ampli fied polymo rphic DN As, 随机扩增多
态性 DNA) ,具有简单、快速、灵敏度高且花费低、又不受环境条件和发育状况的影响等优点 ,为基
因定位和分离提供了十分有用的遗传工具 . 目前 RAPD用于基因定位和分离在植物上特别是在农
作物上的进展较快 [8 ] , RAPD技术在园艺作物品种鉴定及系统分类上的应用也已有报道 [9 ] . 然而
RAPD分析这一新兴技术在花色基因的定位和分离方面的运用还很少 ,怎样利用 RAPD技术研究
控制花色有关基因的筛选和定位问题还未见报道 .本研究以两种金盏菊为实验材料 ,两者间除花色
分别为淡黄色和橙色外 ,别的性状皆一致 . 经 RAPD分析技术 ,寻找它们之间可能存在的遗传差
异 ,并分析比较这些遗传差异与金盏菊控制不同花色形成的有关基因之间的联系 ,为基因工程在花
卉育种上的应用提供新的思路 .
1　材料与方法
1. 1　材　料
本试验材料有两个: 淡黄色和橙黄色金盏菊 ( Calendula of f icinal is L ) ,取自上海师范大学
校园内 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　模板 DNA制备
　　参照陈永强和 BENDICH等人 [10, 11 ]的快速提取植物组织 DNA的方法制备金盏菊总 DNA,被
提取的金盏菊 DNA最终溶解在 1× Tris-EDT A( TE)中 ,经紫外光谱测定浓度后置- 20℃备用 .
1. 2. 2　 RAPD分析
1. 2. 2. 1　引物
所有随机引物为上海生工生物工程有限公司产品 ,每一随机引物为 10个碱基的寡聚核苷酸 ,
实验使用 13个引物的编号及其序列见表 1
表 1　 RAPD扩增引物编号及其序列
编号 序列 ( 5′→ 3′) 编号 序列 ( 5′→ 3′)
S1 GT T TCGCTCC S8 GTCCACACGG
S2 TGAT CCCTGG S9 TGGGGGACT C
S3 CATCCCCCT G S10 CT GCTGGGAC
S4 GGACTGGAGT S12 CCTT GACGCA
S5 TGCGCCCTTC S14 TCCGCTCT GG
S6 TGCT CTGCCC S16 T T TGCCCGGA
S7 GGTGACGCAG
1. 2. 2. 2　基因组 DNA扩增和电泳检测
RAPD分析中所用药品及 DNA标准分子量λDNA /EcoRⅠ + HindⅢ也购自生工生物工程公
司 . DN A扩增反应 [12 ]在 2. 5× 10- 5 L混合液中进行 ,其中 10×缓冲液 2. 5× 10- 6 L , MgCl2 2. 0
m mol /L,随机引物 15ng ,模板 DNA 40ng ,各种 dN TP 200umol /L, Tag酶 1. 0U,用无菌去离子水
补充至总体积 2. 5× 10- 5 L,再加 2. 0× 10- 5 L石蜡油覆盖 .
PCR循环系统: 92℃预变性 10min; 92℃变性 30s, 38℃退火 1. 0min, 72℃延伸 2min,如此循环
35轮 ;最后一轮延伸为 72℃ 10min. 扩增产物在 1. 3%琼脂糖凝胶 (含溴化乙锭 0. 5mg /L)中电泳 ,
电压为 60V,电泳缓冲液为 0. 5× TBE. 电泳 2～ 3h后在紫外分析仪下检测观察并照相记录 .
应用复日 SmartView生物电泳图象分析软件分析并作曲线 .
1. 2. 2. 3　相似率分析
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根据 Nei等人的相似率分析公式进行数据分析 [13 ]:相似率= ( 2×Nab) / ( Na+ Nb)× 100% ,其
中 Nab为样品 a和 b之间共有的 DNA扩增带数目 , Na为样品 a具有的 DNA扩增带数目 , Nb为
样品 b具有的 DNA扩增带数目 .
2　结果及分析
2. 1　引物的筛选
选用 13个随机引物检测淡黄色和橙色金盏菊的基因组 DNA. 其中有 4个引物 ( S4 , S7 , S8 , S14 )
未扩增出任何条带 ,余下的 9个引物能扩增出条带 ,共产生 89条清晰可辨谱带 (表 2) . 通常在
RAPD反应中产生的 1条带代表基因组中的一个位点 ,即这 9个引物对两种金盏菊基因组的 89个
位点进行了检测 . 其中每个引物对两个样品可扩增出 2～ 15条可分辨的 DNA片段 , 9个引物对每
个样品扩增出的 DNA片段数分别为 43条和 46条 ,与标准分子量 DNA比较 ,绝大多数扩增条带
分子量大小在 564～ 2000bp之间 .
表 2　每个引物扩增的条带数及品系间的相似率
引物编号 扩增的条带数橙　色 淡黄色 相似率 (% )
S1 6 6 100
S2 4 4 100
S3 8 7 93. 3
S5 6 6 100
S6 3 3 100
S9 6 9 80
S10 6 7 92. 3
S12 3 3 100
S16 1 1 100
扩增的条带总数 43 46 94. 38
2. 2　两个样品扩增的条带类型及相似率分析
实验结果显示大部分引物扩增出的条带类型对两种不同花色的金盏菊来说 ,无多态性差异 .但
是 S3引物在橙色金盏菊中扩增出的 8条带 (图 1) ,其中有一条带在淡黄色金盏菊中没能扩增出 ,相
反 S9和 S10引物在淡黄色金盏菊中分别各多扩增出 3条带和 1条带 ,而这些条带在橙色金盏菊中
都没能扩增出 . 按相似率分析法计算两个样品基因组之间的相似率 ,结果见表 2,两个样品之间的
差异带数为 5条 ,占其总带数的 5. 62% ,两种花色的金盏菊基因组之间的相似率为 94. 38% .
3　讨　论
RAPD是由 W ILLIAM S[ 14]和 W ELSH[15 ]于 1990年首先提出 ,已在许多领域得到广泛运用 .
刘春林等 [16 ]认为 ,在属、种内和群体内 ,特定大小的 RAPD片段具有序列同源和遗传相关性的假设
是普遍有效的 [17 ] ,即具有相似分子量的扩增 DNA片段通常显示出遗传相似性 . 从实验结果看 , 13
种引物中只有 3种引物能扩增出金盏菊淡黄色和橙色两个品种之间有差异序列的 DNA片段 . 经
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RAPD分析两者基因组相似率为 94. 38% ,说明这两种材料在遗传关系上非常接近 ,这与事实情况
一致 ,实验所取的材料是除了花色有差异外 ,其余性状完全一致的同一种植物 . 但是 S3、 S9、 S10 3种
随机引物能扩增出有差异序列的 DN A片段 ,某种随机引物在两种不同生物基因 DNA上 ,结合位
点的数目和位置不同 ,就会产生不同的扩增产物 ,这反映了两种不同生物基因组 DNA碱基序列的
差异 . 据报道 ,近等基因系 ( NILs)几乎仅在目标性状上存有差异 ,因此 ,一般凡是能在近等基因系
间揭示多态性的分子标记 ,就极可能位于目标基因的两翼附近 [18 ] ,因此 ,利用 RAPD对两个近等基
因系进行分子标记 ,是进行快速基因定位的有效方法 .
目前利用 N ILs已定位了一些农作物质量性状基因 ,例如番茄抗病毒基因 Tm-2a ,园艺作物在
这方面研究报道较少 . 由于所选用的材料 , 除了花色不同外 ,其余性状完全相同 ,可以被看作是两
个近等基因系 ,那么在本试验中两者基因组之间存在 5. 62%的差异 ,也许正反映了两种不同花色
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金盏菊在控制花色表达目的基因上的差异 .
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RAPD Analysis in the Different Color-flowered
Calendula off icinalis
XU Yan , LI Jian-yue, GE Ji-lin
( Colleg e o f Life and Env ironm ent Sciences, Shanghai Teachers Univ er sity, Shanghai 200234)
Abstract: Th e RAPD marker s gener ated by 13 random primer s, 10bp in every one, discriminated light Yellow -
flow ered and o range-flow ered Calendula o fficinalis. 89 bands w ere amplifed from 9 among 13 primer s used, the
average bands of each primer were 10. The results indicated tha t three primers ( S3 , S9 , S10 ) o f used could reva l
polymo rphisms betw een tw o kinds of co lo r-flowe red.
Key words: ra ndom am plified polymo rphic DN A; r andom prim ers; calendula of f icinalis
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