全 文 ：书姚绍嫦，谭文明，蓝祖栽，等．海南冬青组培快繁体系的建立［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１）：２２－２６．
ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．０１．００７
海南冬青组培快繁体系的建立
姚绍嫦１，谭文明２，蓝祖栽１，刘丽辉１，利荣欢２，凌征柱１
（１．广西壮族自治区药用植物园，广西南宁５３００２３；２．广西万寿堂药业有限公司，广西南宁５３０２１９）
　　摘要：建立海南冬青（ＩｌｅｘｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓＭｅｒ．）的组培快繁技术体系。以海南冬青成熟种子为材料，以ＭＳ、１／２ＭＳ为
基本培养基，采用正交试验设计法研究不同植物生长调节剂组合对海南冬青种子萌发、初代诱导、增殖培养、生根培养
的影响，筛选出组培快繁各环节的最佳培养基配方。研究结果，海南冬青种子萌发的最佳培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ
０．５ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３０．５ｍｇ／Ｌ，萌发率达９０％以上；丛生芽诱导的最适培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ＋
ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ，诱导不定芽数为２８．５６个；最佳继代增殖培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ２．５ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ，２０ｄ增殖系数为７．３０；最适的生根培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ，生根率为９１．３３％，
在菜园土－细河沙（３∶１）中移栽成活率为９０％。表明本组培快繁技术体系不但增殖系数高，而且组培苗质量好，可
为海南冬青的规模化生产提供优质种苗与技术指导。
　　关键词：海南冬青；组培快繁；丛生芽；正交试验
　　中图分类号：Ｓ５６７．１＋９０．４３　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１７）０１－００２２－０４
收稿日期：２０１４－１１－１７
基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科重１３５５００１－
５－１６）。
作者简介：姚绍嫦（１９８０—），女，广西容县人，硕士，高级工程师，研究
方向为药用植物组织培养技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｓｈａｏｃｈａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ。
　　海南冬青（ＩｌｅｘｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓＭｅｒ．）为冬青科冬青属常绿
小乔木，其干燥叶加工炮制而成的广西少数民族民间草药山
绿茶，被收载于《广西中药材标准》（１９９０年版）［１］，具有清热
解毒、消肿止痛、活血通脉的功效，主要用于降血压、降血脂、
降胆固醇以及治疗冠心病、脑血管意外所致的偏瘫、风热感
冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等病症［２］。以山绿
茶为主要原料制成的制剂作为降压、降脂的常用中成药，具有
使用量较大、疗效确切、毒副作用小、产品独特等优点，在广西
等地区市场占有率高，有较好的经济效益与发展前景。山绿
茶是山绿茶降压片、决明山绿茶、山绿茶降压胶囊等产品的主
要原料，其中山绿茶降压片已被收载于中药部颁标准（标准
编号：ＷＳ３－Ｂ－２８３８－９８）。目前，山绿茶以采集野生资源
为主，随着近年来需求量的不断上升，野生资源已濒临灭绝，
难以满足制药企业的需求［３］，迫切需要开展人工栽培，但目
前对山绿茶的研究主要集中在其制剂的临床疗效［４－５］、含量
测定和炮制方法［６－７］、化学成分与药理活性［８－９］等方面，迄今
尚未发现海南冬青有关组织培养方面的研究报道。在自然状
态下，海南冬青主要依靠种子繁殖，由于果实经常在成熟期被
鸟类啄食而造成种子大量损失，以及种子具有休眠特性，在自
然状态下萌发率低而导致种子繁殖速度缓慢。为了更好地开
发和利用海南冬青，本研究通过组培快繁的技术手段，建立组
培快繁的技术体系，为开展海南冬青的规模化人工栽培提供
优质种苗与技术指导。
１　材料与方法
１．１　材料
海南冬青的成熟浆果于２０１４年１０月采自广西南宁地区
武鸣县大明山风景区，标本经广西中医药研究院鉴定为海南
冬青（ＩｌｅｘｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓＭｅｒ．）。
１．２　方法
１．２．１　外植体选择与灭菌　在海南冬青果实成熟期（每年
１０—１２月），选取完全成熟的红色浆果，将果皮搓烂，流水冲
洗果皮，挑选沉淀的种子作为外植体进行灭菌。在超净工作
台上，用纱布袋将种子包好，用７５％乙醇（体积分数）浸泡纱
布袋５～１０ｓ后，再用０．１％ ＨｇＣｌ２水溶液（质量分数）分别浸
泡６、８、１０、１２ｍｉｎ灭菌种子，用无菌水摇荡洗涤４次，用镊子
打开纱布袋，再用无菌吸水纸将种子表面水分吸干后，将种子
夹起接种到种子萌发培养基上培养。接种后１５ｄ统计污染
情况。
１．２．２　种子萌发培养　将种子接种到含不同质量浓度６－
ＢＡ与ＧＡ３组合的种子萌发培养基上，每处理１０瓶，每瓶１０
粒种子，记录种子萌发情况，３０ｄ后统计种子萌发率，筛选出
适合打破休眠促进萌发的培养基。
１．２．３　初代诱导培养　将萌发的幼苗切取含２片真叶的不
定芽进行丛生芽诱导培养，采用Ｌ９（３
４）正交试验，在ＭＳ基本
培养基上以６－ＢＡ（Ａ）（１．０、２．０、３．０ｍｇ／Ｌ）、ＫＴ（Ｂ）（０．５、
１．０、１．５ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（Ｃ）（０．１、０．２、０．５ｍｇ／Ｌ）３种不同类型
的生长调节剂的３个水平进行正交试验，对海南冬青丛生芽
诱导培养基进行优化，每种培养基２０瓶，每瓶接种３个芽，
３０ｄ统计不定芽诱导数量，比较不同组合诱导不定芽的差
异，筛选出适合的初代诱导培养基。
１．２．４　继代增殖培养　将初代培养获得的丛生芽切下单个
芽进一步转接到继代培养基中进行增殖培养，以 ＭＳ为基本
培养基，添加不同质量浓度６－ＢＡ（２．０、２．５、３．０ｍｇ／Ｌ）、ＫＴ
（０．５０、０．７５、１．００ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）组合，每处理 １０
瓶，每瓶３个芽，观察记录芽的生长情况，２０ｄ统计增殖情况，
—２２— 江苏农业科学　２０１７年第４５卷第１期
网络出版时间：2017-02-16 11:18:18
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计算芽增殖系数，筛选出继代增殖的最佳培养基。
１．２．５　生根培养　切取长约２ｃｍ的不定芽为生根材料，在
１／２ＭＳ基本培养基上，添加不同质量浓度 ＮＡＡ（０、０．２、
０．５ｍｇ／Ｌ）与ＩＢＡ（０、０．５０、０．７５、１．００ｍｇ／Ｌ）组成１０个处理，
每处理１０瓶，每瓶５个芽，２０ｄ统计不同处理的生根率与平
均生根数，考察２种生长素组合对生根的影响。
１．２．６　培养条件　培养基均附加３．０％蔗糖和０．５％琼脂，
ｐＨ值５．８～６．０，配制分装后，于１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。培养条
件为２６℃、光照强度２０００ｌｘ、光照时间１０ｈ／ｄ。
１．２．７　炼苗移栽　待组培苗生根培养３０ｄ后进行炼苗移
栽，将瓶盖打开炼苗３～５ｄ，然后用镊子将瓶苗取出，用流水
洗去粘在根部的琼脂，移栽到经过消毒的泥炭土、河沙、菜园
土、泥炭土－河沙（３∶１）、菜园土－河沙（３∶１）５种不同基质
上，移栽后用遮阳网遮阴，覆膜保湿，视生长情况逐渐撤去薄
膜，２０ｄ时统计不同基质的移栽成活率。
１．３　数据统计与分析
试验所得数据用Ｅｘｃｅｌ和ＳＰＳＳ１７．０方差分析软件处理。
萌发率＝３０ｄ后萌发种子数／接种种子数 ×１００％；芽增殖系
数＝（２０ｄ后不定芽数量－接种时不定芽数量）／接种时不定
芽数量；生根率＝生根苗数／接种苗数×１００％；平均生根数＝
总生根数／接种总数；成活率＝成活苗数／移栽苗数×１００％。
２　结果与分析
２．１　外植体灭菌时间筛选
用０．１％ ＨｇＣｌ２溶液对海南冬青种子进行灭菌，从表１
可以看出，用０．１％ ＨｇＣｌ２溶液灭菌１０ｍｉｎ以上，效果较好，
成功率显著高于用０．１％ ＨｇＣｌ２溶液灭菌时间少于１０ｍｉｎ的
处理，成功率达９５％。ＨｇＣｌ２作为一种灭菌剂，在对外植体进
行灭菌的同时对其生活力也具有一定的伤害作用，灭菌时间
越长对其伤害的程度越大，在取得相同灭菌效果的情况下，我
们认为灭菌时间越短越有利于外植体生活力的保持。当灭菌
时间低于１０ｍｉｎ时，污染率较高，灭菌６ｍｉｎ时外植体全部污
染。因此，用０．１％ ＨｇＣｌ２溶液灭菌１０ｍｉｎ的效果最佳。
表１　ＨｇＣｌ２不同灭菌时间对外植体污染率的影响
灭菌时间
（ｍｉｎ）
接种数
（个）
污染数
（个）
污染率
（％）
成功率
（％）
６ ２０ ２０ １００ ０ｃＣ
８ ２０ １５ ７５ ２５ｂＢ
１０ ２０ １ ５ ９５ａＡ
１２ ２０ １ ５ ９５ａＡ
　　注：同列数据后不同的小写、大写字母分别表示差异显著（Ｐ＜
００５）、极显著（Ｐ＜０．０１），表２、表５、表６、表７同。
２．２　种子萌发培养
将种子接种到含不同质量浓度６－ＢＡ与 ＧＡ３组合的种
子萌发培养基上培养，从表２可以看出，灭菌后的种子接种在
不同处理的培养基上均能萌发，但是萌发情况差异较大，在添
加ＧＡ３的培养基上萌发情况较好，说明ＧＡ３能有效地打破海
南冬青种子的休眠，促进种子萌发。随着 ＧＡ３浓度的增加，
种子萌发率反而出现下降现象，当 ６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３
０５ｍｇ／Ｌ时，种子初始萌发时间最短，且萌发率最高，达
８５％，极显著高于其他处理，达到较好的种子萌发效果。种子
在６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３０．５ｍｇ／Ｌ组合的培养基上培养
１５ｄ后开始萌发，２０ｄ后胚芽出现，并且开始迅速生长（图
１－Ａ），至３５ｄ时，种子苗高已１～２ｃｍ（具２张以上真叶），
此时，切取含２张真叶的不定芽进行丛生芽诱导培养。因此，
适合海南冬青种子萌发的培养基为 ＭＳ＋６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋
ＧＡ３０．５ｍｇ／Ｌ。
表２　不同植物生长调节剂组合对海南冬青种子萌发的影响
生长调节剂（ｍｇ／Ｌ）
６－ＢＡ ＧＡ３
初始萌发时间
（ｄ）
萌发数
（个）
萌发率
（％）
０．５ ０ ２８ １８ １８．００ｅＤ
１．０ ０ ２６ ２１ ２２．００ｄＤ
０．５ ０．５ １５ ８５ ８５．００ａＡ
１．０ ０．５ １７ ８０ ７８．３３ｂＢ
０．５ １．０ １９ ７６ ７３．００ｃＣ
１．０ １．０ ２０ ７２ ７２．３３ｃＣ
２．３　初代诱导培养
将种子萌发后切取的不定芽转接到以 ＭＳ为基本培养
基，不同质量浓度６－ＢＡ与 ＮＡＡ配比的初代诱导培养基上
进行丛生芽诱导培养，培养过程中不定芽继续生长，无愈伤组
织产生。培养１０ｄ后，不定芽的腋芽开始不断分化而形成大
量丛生芽（图１－Ｂ），培养３０ｄ后，大量丛生芽使得不定芽呈
簇状结构，此时可进行继代转接（图１－Ｃ）。
　　从表３可以看出，在初代诱导培养过程中，不同激素组合
对海南冬青丛生芽的诱导效果差别很大。在 ６－ＢＡ
３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ组合下，不定芽数
量最多，达到２８．５６个。正交试验设计的极差 Ｒ大小决定各
生长调节剂对不定芽诱导影响程度依次为 Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即６－
ＢＡ＞ＫＴ＞ＮＡＡ，最优组合为 Ａ３Ｂ２Ｃ１。由方差分析可知，６－
ＢＡ对丛生芽的诱导作用达到显著水平，ＫＴ、ＮＡＡ对丛生芽的
诱导作用均不显著（表 ４）。因此，６－ＢＡ为主要因素，ＫＴ、
ＮＡＡ为次要因素。在６－ＢＡ浓度保持在０～３．０ｍｇ／Ｌ之间
时，不定芽数量与浓度成正比，适当高浓度的６－ＢＡ对丛生
芽的产生起到积极作用。从不定芽生长状况来看，各处理均
—３２—江苏农业科学　２０１７年第４５卷第１期
表３　海南冬青丛生芽诱导培养基的正交试验设计与结果
序号
激素浓度（ｍｇ／Ｌ）
Ａ：６－ＢＡ Ｂ：ＫＴ Ｃ：ＮＡＡ
误差列 不定芽数量（个）
１ １．００ ０．５０ ０．１０ １ ５．５９
２ １．００ １．００ ０．２０ ２ ６．８３
３ １．００ １．５０ ０．５０ ３ ７．４８
４ ２．００ ０．５０ ０．２０ ３ １３．６８
５ ２．００ １．００ ０．５０ １ １４．２１
６ ２．００ １．５０ ０．１０ ２ １６．３６
７ ３．００ ０．５０ ０．５０ ２ ２３．２７
８ ３．００ １．００ ０．１０ ３ ２８．５６
９ ３．００ １．５０ ０．２０ １ ２５．４７
ｋ１ ６．６３３ １４．１８０ １６．８３７ １５．０９０
ｋ２ １４．７５０ １６．５３３ １５．３２７ １５．４８７
ｋ３ ２５．７６７ １６．４３７ １４．９８７ １６．５７３
Ｒ １９．１３４ ２．３５３ １．８５０ １．４８３
表４　丛生芽诱导培养基方差分析
因素 离差平方和 自由度 均方 Ｆ临界值 显著性
６－ＢＡ ５５３．３３２ ２．０００ １５６．３９７ １９．０００ 
ＫＴ １０．６４０ ２．０００ ３．００７ １９．０００
ＮＡＡ ５．８１８ ２．０００ １．６４４ １９．０００
误差 ３．５４０ ２．０００ ０．１５９
　　注：“”表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。
无玻璃化现象发生，６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ处理组合不定芽长势明显比其他处理强，因此，综
合考虑正交试验结果与不定芽生长状况，采用 ６－ＢＡ
３．０ｍｇ／Ｌ、ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ组合，以此组合进行
海南冬青丛生芽诱导可获得不定芽更多的数量与更优的
品质。
２．４　继代增殖培养
将初代培养获得的丛生芽切下单个不定芽转接到继代培
养基中进行增殖培养，在充分考虑初代诱导培养基中各激素
影响的情况下，以ＭＳ为基本培养基，添加不同质量浓度６－
ＢＡ、ＫＴ与０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ组合，对继代增殖培养基进行优化。
从表５可以看出，不同质量浓度的６－ＢＡ与 ＫＴ组合获
得的芽增殖系数差异较大，６－ＢＡ是增加芽增殖系数的主导
因素，当６－ＢＡ浓度为２．５ｍｇ／Ｌ时，与不同浓度的 ＫＴ组合
均获得较高的芽增殖系数，其中以 ６－ＢＡ２．５ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ
０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ组合获得最好的效果，培养２０ｄ
后实现芽增殖系数７．３０倍，极显著高于其他处理，且不定芽生
长健壮，展叶良好，长势快，有利于下一步生根诱导（图２－Ａ）。
当６－ＢＡ浓度增加到３．０ｍｇ／Ｌ时，芽增殖系数反而出现下降
的现象，且不定芽的质量也有所下降，丛生芽容易出现簇状而
抑制了芽的伸长生长，不利于下一步生根培养（图２－Ｂ）。当
６－ＢＡ浓度相同时，ＫＴ浓度的增加对芽增殖系数的影响差异
不大。因此，ＭＳ＋６－ＢＡ２．５ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ培养基是最适宜海南冬青丛生芽增殖的培养基。
２．５　生根培养
切取长约２ｃｍ的不定芽为生根材料，在１／２ＭＳ基本培
养基上添加不同浓度ＮＡＡ或ＩＢＡ进行生根培养，２０ｄ后统计
生根率及平均生根数（表６）。不定芽转接７ｄ后根原基开始
形成，２０ｄ后苗生长良好，根长且粗壮，茎基部无愈伤组织产
表５　不同质量浓度６－ＢＡ、ＫＴ、ＮＡＡ对不定芽增殖的影响
激素浓度（ｍｇ／Ｌ）
６－ＢＡ ＫＴ ＮＡＡ
芽增殖系数
２．０ ０．５０ ０．１ ３．５６ｇＦ
２．０ ０．７５ ０．１ ３．７４ｆＥ
２．０ １．００ ０．１ ３．５０ｇＦ
２．５ ０．５０ ０．１ ６．５２ｃＣ
２．５ ０．７５ ０．１ ７．３０ａＡ
２．５ １．００ ０．１ ６．７４ｂＢ
３．０ ０．５０ ０．１ ６．４６ｃＣ
３．０ ０．７５ ０．１ ５．９８Ｄ
３．０ １．００ ０．１ ５．８５ｅＤ
　　注：每处理接种数为３０个芽。
生。不同浓度生长调节剂组合对不定芽生根率的影响较明
显，ＩＢＡ浓度相同时，ＮＡＡ浓度增加对生根率与平均生根数
的增加均有促进作用，根较细长。２种生长素同时添加出现
了促进生根的叠加效应，生根率、平均根数均比单独使用ＩＢＡ
时高，当ＩＢＡ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ组合时，生根率为
９１．３３％，平均生根数为５．９０条，二者均达到最大值，极显著
高于其他处理，且根粗壮、发达，有利于下一步移栽成活（图
３－Ａ、图 ３－Ｂ）。因此，１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．５ｍｇ／Ｌ较适合海南冬青诱导生根。
表６　不同质量浓度ＩＢＡ与ＮＡＡ组合对试管苗生根的影响
生长调节剂（ｍｇ／Ｌ）
ＩＢＡ ＮＡＡ
生根率
（％）
平均生根数
（条）
０ ０ ０．００ｇＧ ０．００ｈＨ
０．５ ０ ５４．６７ｆＦ ２．００ｇＧ
０．５ ０．２ ７４．００ｃＣ ３．５７ｄＤ
０．５ ０．５ ８５．３３ｂＢ ４．２９ｂＢ
０．７５ ０ ６２．００ｅＥ ３．２４ｆＦ
０．７５ ０．２ ７６．００ｃＣ ３．３４ｅＥＦ
０．７５ ０．５ ９１．３３ａＡ ５．９０ａＡ
１．０ ０ ６８．００ｄＤ ３．４０ｅＥ
１．０ ０．２ ７６．００ｃＣ ３．４２ｅＥ
１．０ ０．５ ８８．００ａｂＡＢ ３．８２ｃＣ
　　注：每处理接种数为５０个。
２．６　试管苗的移栽
待组培苗生根培养３０ｄ后进行炼苗移栽。从表７可以看
出，试管苗在不同基质上的成活率由高到低依次为菜园土－河
沙（３∶１）＞菜园土＞泥炭土＞泥炭土－河沙（３∶１）＞河沙，
其中，试管苗在菜园土－河沙（３∶１）的基质中移栽３０ｄ后成
活率达到９０％（图３－Ｃ），极显著高于其他处理。移栽１８０ｄ
后，植株高超过１５ｃｍ，生长良好（图３－Ｄ），可进行大田移栽。
因此，试管苗移栽最适宜的基质为菜园土－河沙（３∶１）。
—４２— 江苏农业科学　２０１７年第４５卷第１期
表７　不同基质对海南冬青试管苗移栽的影响
基质种类 移栽苗数（株）
成活苗数
（株）
成活率
（％）
泥炭土 ５０ ３１ ６２ｃＣ
河沙 ５０ １６ ３２ｅＥ
菜园土 ５０ ３７ ７４ｂＢ
泥炭土－河沙（３∶１） ５０ ２８ ５６ｄＤ
菜园土－河沙（３∶１） ５０ ４５ ９０ａＡ
３　讨论
多数冬青属植物的种子具有休眠特性而影响其快速繁
育，其休眠期长短因种而异，如大叶冬青（Ｉｌｅｘｌａｔｉｆｏｌｉａ）种子的
休眠期长达３年［１０］。本课题组在前期研究中发现海南冬青
种子具有短暂的休眠期，秋季采集的种子需在４℃低温贮藏
３个月方可有效解除休眠［３］。本试验中，为了解除海南冬青
新鲜种子的休眠，我们在种子萌发培养基中添加ＧＡ３，结果表
明，ＧＡ３能有效地打破海南冬青种子的休眠，促进种子萌发，
当６－ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３０．５ｍｇ／Ｌ时，种子初始萌发时间最
短，且萌发率最高，达８５％，达到较好的种子萌发效果，与前
人采用ＧＡ３在解除大果冬青与狭叶冬青等同属植物的种子
休眠上取得较好的积极作用的研究结果［１１－１２］一致。
在植物组织培养中，外植体初代诱导的结果除了与外植
体本身取材有关，也与培养过程中使用的生长调节剂密切相
关［１３］。目前尚未发现海南冬青组织培养方面的研究报道，同
属植物组织培养方面，研究报道也较少。王慧瑜等以大叶冬
青当年生嫩枝为外植体，以ＢＡ与ＮＡＡ或者 ＩＢＡ组合实现了
丛生芽的诱导与增殖培养［１４］。杨灿等以红果冬青的茎段进
行组培试验，诱导出丛生芽，并在低浓度的 ＢＡ与 ＫＴ配合下
实现芽的继代增殖［１５］。同属植物多数是以茎段为外植体直
接诱导不定芽，我们前期研究发现，海南冬青植株内含多酚类
物质较多，选用其嫩芽或者带芽茎段作为外植体十分容易褐
化而不利于不定芽诱导，种子是较理想的外植体材料，具有容
易消毒、生长力旺盛的特点。本试验采用种子萌发形成的无
菌苗切去根部后作为材料进行不定芽的诱导与增殖。植物生
长调节剂种类和质量浓度对海南冬青的不定芽诱导与增殖有
较大影响。使用６－ＢＡ、ＫＴ与 ＮＡＡ组合进行初代诱导与继
代增殖筛选，６－ＢＡ对丛生芽的诱导作用达到显著水平，是
海南冬青丛生芽形成与增殖的关键因素，其中以 ６－ＢＡ
３．０ｍｇ／Ｌ的诱导作用最强，在一定范围内不定芽的诱导数量
与增殖系数随着６－ＢＡ浓度的增加而增加。ＫＴ作为促进侧
芽发生发育的外源性细胞分裂素，组织培养中主要用于促进
细胞分裂和分化，与五指毛桃［１６］类似，在培养基中配合使用
低浓度的ＫＴ对海南冬青不定芽的诱导与增殖均具有较大的
促进效应。高浓度的细胞分裂素与低浓度的ＮＡＡ配合使用，
有利于不定芽的分化，ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ与高浓度的６－ＢＡ、ＫＴ
组合时达到较好的效果，与杨灿等在红果冬青的研究结果相
符。在本试验中，以种子萌发产生的无菌苗进行丛生芽诱导，
成功诱导出较多的不定芽（不定芽数量２８．５６个），幼小的不
定芽继代培养２０ｄ后又获得７．３０的增殖系数，而且在培养
过程中无愈伤组织产生，实现了以芽繁芽的技术特点，在有效
减少变异的同时大大提高了繁殖的速度。
海南冬青不定芽在附加不同质量浓度 ＩＢＡ或 ＮＡＡ的
１／２ＭＳ培养基上均可生根，且２种生长素同时添加出现了促
进生根的叠加效应，其中较适宜的生根培养基为 １／２ＭＳ＋
ＩＢＡ０．７５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ，培养２０ｄ后可以获得再生
植株，生根率达９１．３３％。在不添加生长素类植物生长调节
剂的空白对照中，未发现生根，说明生长素类对海南冬青生根
起到了促进作用。基质的选择对于试管苗的移栽成功与否也
十分重要，适宜基质可以确保较高的试管苗移栽成活率。菜
园土肥力较高，团粒结构好，但是干时表层易板结，湿时通气
透水性差；河沙通气透水性好，但是肥力与保水性较差。本试
验把这２种基质按３∶１的比例混合，可有效弥补这２种基质
的不足，在海南冬青试管苗移栽上取得了较好的效果，移栽成
活率达到９０％。
利用组织培养技术能生产优质种苗，但组培苗能否在生
产上迅速应用推广，与其移栽的便捷性、成活率、培养成本等
密切相关［１７］。本研究通过对海南冬青组培快繁过程中各技
术环节的影响因子进行试验与优化，筛选出海南冬青种子萌
发、不定芽诱导、增殖、生根培养的最佳培养基，建立了海南冬
青组培快繁的技术体系，研究结果具有扩繁系数大、栽培管理
便捷、成活率高、成本低等优点，能短时间内生产出大量海南
冬青优质种苗，具有较好的应用前景。
参考文献：
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ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．０１．００８
石榴果皮 ＤＨＱ／ＳＤＨ基因的克隆及序列分析
冯立娟１，焦其庆１，尹燕雷１，李甲梁２
（１．山东省果树研究所，山东泰安２７１０００；２．枣庄市农业科学研究院，山东枣庄２７７３００）
　　摘要：以泰山红石榴果实为试验材料，利用逆转录 ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增出 ９８０ｂｐ大小的中间片段，用
３′ｃＤＮＡ末端快速扩增ＰＣＲ（ＲＡＣＥＰＣＲ）获得ＤＨＱ／ＳＤＨ基因的３′端，拼接后获得１５８５ｂｐ的ｃＤＮＡ片段。结果表明，
该基因含有１２６５ｂｐ编码序列（ＣＤＳ），编码４２１个氨基酸，其氨基酸序列与苹果（注册号：ＸＰ＿００８３７０５３７．１）、葡萄（注
册号：ＸＰ＿００２２７０２３２．１）、白梨（注册号：ＸＰ＿００９３３５６６０．１）的同源性分别为８２％、８４％、８２％；蛋白质理论分子质量为
１３３６８２．２ｕ，等电点为５．０１，含量最丰富的氨基酸是丙氨酸（Ａｌａ）、半胱氨酸（Ｃｙｓ）、甘氨酸（Ｇｌｙ）、苏氨酸（Ｔｈｒ），具有
ＤＨＱａｓｅＩ、ＳＤＨ（ＡｒｏＥ）２个保守结构域，为亲水性蛋白；二级结构主要由无规则卷曲（３１．１２％）、α－螺旋（３０．１７％）、伸
展链（２４．９４％）和β－转角（１３．７８％）组成；ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＵ１３３４７９。
　　关键词：石榴；ＤＨＱ／ＳＤＨ基因；克隆；序列分析
　　中图分类号：Ｓ６６５．４０１；Ｑ７８５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１７）０１－００２６－０４
收稿日期：２０１５－１１－１７
基金 项 目：山 东 省 自 然 科 学 基 金 （编 号：ＺＲ２０１４ＹＬ０２２、
ＺＲ２０１５ＹＬ０５６）；山东省果树研究所所长基金（编号：２０１３ＫＹ０４）。
作者简介：冯立娟（１９８２—），女，山东聊城人，博士，助理研究员，主要
从事果树遗传资源与育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｌｊ＿１９８２０２２７＠１６３．ｃｏｍ。
通信作者：尹燕雷，硕士，副研究员，主要从事果树遗传资源与育种研
究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｙｌｅｉ６６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
　　石榴（ＰｕｎｉｃａｇｒａｎａｔｕｍＬ．）是一种重要的功能性水果，富
含类黄酮、酚酸和鞣花单宁等可溶性酚类物质，市场发展前景
广阔［１］。没食子酸是石榴果实中重要的酚类物质，具有抗肿
瘤［２］、抗氧化［３］、抗炎抗菌［４－５］等诸多功效，生物学效应广
泛［６］。莽草酸途径在植物次生代谢途径中起到中心作用，可
为其他次生代谢途径提供底物。研究表明，没食子酸主要通
过莽草酸途径生成的３－脱氢莽草酸代谢生成［７－８］。
脱氢奎尼酸脱氢酶（３－ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，简称
ＤＨＱ）、莽草酸脱氢酶（ｓｈｉｋｉｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称 ＳＤＨ）分
别催化莽草酸途径中的第３、第４步反应，在大多数微生物
中，ＤＨＱ、ＳＤＨ是单功能的，但是在植物中，ＤＨＱ、ＳＤＨ可以融
合，形成具有 ２种功能的酶［９］。３－脱氢奎尼酸脱氢酶
（ＥＣ４．２．１．１０）／莽草酸脱氢酶（ＥＣ１．１．１．２５）双功能酶
（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ３－ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ／ｓｈｉｋｉｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ，简称ＤＨＱ／ＳＤＨ）能催化３－脱氢奎尼酸脱水生成３－
脱氢莽草酸，也能催化３－脱氢莽草酸、莽草酸之间的可逆还
原反应，是没食子酸代谢途径中的关键调控酶［１０］。编码ＳＤＨ
结构基因 ａｒｏＥ的克隆、表达分析和功能鉴定在结核杆
菌［１１－１２］、谷氨酸棒杆菌［１３］中已有报道。ＤＨＱ／ＳＤＨ基因 ｃＤ
ＮＡ的片段或全长序列已在豌豆［１４］、烟草［１５］、番茄［１６］等植物
中被克隆出来，通过全基因组测序推测苹果、葡萄、白梨、桃等
果树ＤＨＤ／ＳＤＨ基因的片段或全长已在 ＧｅｎＢａｎｋ上注册，但
是关于石榴中ＤＨＱ／ＳＤＨ基因的克隆及序列分析等方面的研
究在国内外尚未见报道。因此，本研究以山东省主栽石榴品
种泰山红为试验材料，利用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术克隆
ＤＨＱ／ＳＤＨ基因，对其进行生物信息学分析，从而为揭示石榴
果实中没食子酸代谢的分子机制提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
试验于２０１５年６—９月在山东省果树研究所进行。以泰
山红石榴果实为试验材料，将其定植于山东省果树研究所石
榴种质资源圃。于幼果期（果实直径２～３ｃｍ）采集石榴果
实，洗净擦干后，用削皮刀取果皮，在液氮中速冻后放入
－８０℃ 冰箱保存备用。
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