全 文 ：真 菌 学 报 1峪 (l) :6 9一 ; 7, 2 9 , ,
再` t a M y e o l哈 i e a S i n i e “
金顶侧耳多糖 P -C 4 的结构确定与
抗肿瘤活性的研究
张丽萍 苗春艳 许丽艳* 张翼伸
(东北师范大学生物系 长春 1 3 0 02勺
摘要 从 3% 三氯乙酸浸提过的金顶侧耳 ( p l , “ r o t , , : i , , i n 。户矛l , a , u , ) 子实体中分离纯化另
一水溶性多塘 P C一 4 。 该多塘分子量约为 1 8 9 K d 。 纸层析与气相层析分析表明其为单一葡聚
糖 。 经高碘酸氧化 , s m i o h 降解 , 甲基化 , 气相层析 , 气质联机分析 , 核磁共振 ( ’ H 一 N M R ,
, ’ C 一 N M R ) 谱及红外光谱测定等 ,可确定 P C一 4 的主链结构由 户l( , 3 ) 糖昔键相连的葡萄塘
构成 ,部份残基 C 。 上带有分支 。 约每 5 个塘残基有两个侧链 ,侧链仅为 1 个葡萄塘残基。
给 cI R 小鼠腹腔注射 P C 一 4 , 对移植性肿瘤 s 一 1 80 有一定的抑制作用 ,抑瘤率为 67 % 。
离体条件下 , P C 一 4 与肿瘤细胞 s一 180 共同培养 ,则未显示抑瘤作用 。
关键词 金顶侧耳 ,多糖 ,肿瘤 s 一 180
金顶侧耳 p l e u r o , “ 5 c i: r i o o P i l o a ,二 5 5 1, 9 . 有较高的药用价值。 我们 曾用 3多三氯乙
酸浸提子实体 ,经分级纯化得到半乳甘露聚糖 P C 一 3 〔1 。 从三氯乙酸浸提过的残渣中用沸
水提取 , 分离纯化得另一水溶性葡聚糖 P C 一 4。 有多篇文献报道 , 从香菇田 ,裂褶菌 〔 3] ,斜顶
菌 〔叼等多种真菌中都曾提取出以 夕( 1” 3 ) lG 。 为主链 , 月( 1” 6 ) lG 。 为侧链的葡聚糖 ,
而且这些葡聚糖大都具有抗肿瘤活性 。 金顶侧耳葡聚糖是否也有类似的 结 构 及 生 物活
性 , 国内外尚无这方面的研究报道 。
1 材料与方法
.1 1 P C 一 4 的分离纯化
按 H a r a e t a l . 方法 ` ’ , ” ,再经 C e t a v l o n p H 二 1 0 的硼酸盐缓冲液分级 , s e v a g 法及链霉蛋白酶
( p
r o n a s e
) 联合去游离蛋白 , H : o : 脱色等等 。
1
·
2 一般测试方法
1
.
2
.
1 搪组成分析 : 采用 .P c 与 .G c 法 “ ,
1
.
2
·
2 分子量测定: 采用凝胶过滤法 〔 ” 。
1
.
2
.
3 与 c 。 。 A 的相互作用: 采用琼脂塘双扩散法 , 25 ℃ , 4 8 h 。
1
·
2
·
4 与刚果红的络合作用 : 按梁忠岩的方法“ , 。
1
·
2
·
5 粘度测定 : 用乌氏粘度计测定 。
1
.
3 结构测试方法
1
.
3
.
1 红外光谱分析 : s P E C O R D IR 型红外光谱仪 。
1
.
3
.
2 核磁共振谱分析 : ’ H 一 N M R , ” C 一 N M R 均采用 B r u k o r A E 一 5 0 型核磁共振仪 。 溶剂为 D : o 。
国家自然科学基金项目。
白求恩医科大学应用基础研究所 。
l 夕9 3 一 0 6一 2 4 收稿。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1995. 01. 012
0 7具 国 子 于t 1 斗 卷
1
.
3
.
3高碘酸氧化与 i s mt h 降解按 s ao ak i的方法` ” 。
1
.
3
.
4 完全甲基化: 按 Hk ao mor i法进行甲基化反应 。 甲基化产物经酸水解 , 乙酞化 , 进行 .G C 与
G
.
c 一 M
.
s 分析。 使用 v a r i a n 3呼0 0 色谱仪 , 石英毛细管柱 ( 2 5 m X 0 . 2 2 m o x 0 . 2林nI ( s G E 公司 ) ,
s E 一 3。 为固定液 ,程序升温 ; 色质联机 H p s s 9 0 ( 1 1) G . C / H p , g s s M s , 石英毛细管柱 U i : r a 2 . 2 , m x
o
.
3 2 m m x 0
.
5 2卜m (美 H p 公司 ) ,程序升温 1 0 0 oC 一 2 5 0℃ ,电离电压 7 0 e v o
1
.
4 抗肿启实验
1
.
4
.
1 5一 18 。 肿瘤细胞 : 由白求愚医大放射生物研究所提供 。
1
.
,
.
2 c1 从 / J C L 小鼠 : 由白求恩医大实验动物部提供 。 每组小鼠 6 只 。
1
.
4
.
3 细胞培养液 : R P M l l ` 4 0 培养液 ( GI B C o 美国 ) 内含 10 帕小牛血清 , 含 ,呢小牛血清为维持
液 。
1
.
4
. 斗 对小鼠移植肿瘤实验 : 给药前 24 小时 ,每鼠接种 S 一 180 瘤株 (约 6 x 比` 个 ) ;腹腔注射给药 ,剂
量为 l o m g / K g / d a y x 1 0 。 对照组注射同体积生理盐水 。
l
·
4
·
, 体外抑瘤实验 : 将 s一 18 。 肿瘤细胞进行悬浮培养 ,至对数生长期时 ,用生长液稀释至 2 义 l 0’ 个
细胞 /。 l 加到 9 6 孔培养板中 ,每孔 0 . 1二 l , 再加 o . z m l 含浓度 (件g / nr l ) 分别为 1 5 0 , 3 0 0 , ` 0 0 多糖的
生长液 , 3 7℃ , ,呱 c o Z培养。 分别在 4 8 , 9 6 , 1 4 4 小时测定肿瘤细胞生长情况 , 用中性红摄入法 ( O D ,… )
测定细胞存活率 。
2 结果与讨论
2
.
1 P C
一
4 的结构确定
2
.
1
.
1 组成分析 : 多糖样品经 l m ol / L H Zs o 。 , 1 0 ℃水解 8 小时 , B as O 3 中和后进行纸
层析 ;盐酸甲醇解后 , 用三甲基硅烷 ( T . M . s) 衍生化后进行气相色谱分析均只检出 G k ,
表明 P C 一 4 为单一葡聚糖 。
2
.
1
.
2 分子量测定 : p C 一 4 经 S e ph a r o s e e L 一 4 B 柱层析 ( 9 0 x l . s e m , 1务N a e l 洗脱 ) ,
由洗脱体积 ( 12 1 m l) 查葡聚糖制定的标准曲线 1[] ,测其分子量约为 1 8 9 K do
2
.
1
.
3 构型分析 : 琼脂糖双扩散与定量沉淀实验均表明 , P C 一 4 与 C on A 不能形成多糖
蛋白复合物。 提示其末端 G lc 残基可能为 夕构型 。 红外光谱分析 (图 1) , 其 8 9 0 c m 一 ` 的
·外 t , ~ ~ - -
-
一一- 一气二甲- ,
80
60
4 0
20
万60 0 2 800
图 1 P C
2 000 1200 80 0 e m
-
F i g
.
1 I
.
R
.
一 4 的红外光谱
S P e e t r u m o f PC
一
4
张丽萍等 :金顶侧耳多塘 P C一 4的结构确定与抗肿瘤活性的研究
图 2 P C一 4的 ’ H一核磁共振谱
F 19
.
2
I
H
一
NM R S p e c t r um of P C
一呼
吸收峰也为 P C一 4含口型糖营键提供了证据 。 P C一 4的 ’ H一核磁共狠谱中 (图 2 ) c :质子
区的信号峰均在 , . 0陀 /m l 以下 。 文献报导 , 质子化学位移在 5 . 0 以下为 夕型糖营键切 。
2
.
1
.
4 高碘酸氧化与 S m iht 降解 : P C 一 4 56 m g 与 50 m l 1 5m M oI 不氧化反应 。 经紫外
光谱 ( 2 2 3n m ) 检测 , 98 小时后反应完全 ,测得每摩尔己糖消耗 10 不为 .0 91 摩尔 , 甲酸
释放量为 0 . 4 摩尔 。 10 不 消耗量基本为甲酸消耗量的 2 倍 , 提示有较多的 lG 。 残基是
以 1、 6 糖营键相连或处于分子的末端 ; 而其它糖残基则以不消耗 10 不 的 l* 3 键 型 相
连 。
将上述高碘酸氧化产物经 N aB H 。 还原 24 小时 。 经气相层析分析 , s m i ht 降解的
完全酸水解产物是甘油与 G k , 其摩尔比为 1 . 0 : 2 . 4 ;而部份酸水解产物 , 其透析袋内仅检
出 G k , 袋外仅检出甘油 , 表明分子的主链骨架可能是以抗 oI 不氧化的 (l 。 3) G l c 构
成 。
2
.
1
.
5 ` , C 一 N M R 谱分析 : p C 一 4 的 ’ 3C 一 N M R 谱中 , 1 0 3 · 2 7陀 /m l 为毗喃型葡萄糖营键
C
; 的信号峰 , 此与文献报导的葡聚糖 C ; 的化学位移数值 10 3 . 3田十分接近 。
2
.
1
.
6 与刚果红的络合实验 : P C 一 4 同刚果红在不同浓度氢氧化钠溶液中的络合行为与
许多以 爪 1、 3) G k 为主链 , 并带有 风 1” 6 ) GI 。 分支的葡聚糖相似汇3] , 当氢氧化钠浓度
增至足以破坏维持三股螺旋构象的氢键时 ,因三股螺旋构象的破坏 , 而不能与刚果红形成
复合物 ,其最 大吸收波长将因复合物的解体而下降 ,并与起对照作用的刚果红相同 (图 3 )
2
.
1
.
7 甲基化分析 : P C 一 4 经 H ak o m or i 法完全 甲基化后 , 经完全酸水解 , N aB H ; 还
原 , 乙酞化后 , G . C 分析检出了 3个峰。 .G C 一 M · S 分析得到 P C 一 4 的各甲基化单糖衍
生物 (表 1 ) 。 由 2 , 3 , 4 , 6一四甲基葡萄糖 , 2 , 4一二甲基葡萄糖及 2 , 4 , 6 一三甲基葡萄糖的摩
尔比并综合高碘酸氧化 , s m it h 降解及前述各项分析结果 ,可判定以 武 1* 3 ) 糖昔键相
连的 1G 。 构成了分子的主链 , 主链部份残基 6 位上带有分支 , 平均每 5 个糖残基带有 2
个分支点 , 分支仅为 l 个葡萄糖残基 。
真 菌 学 1 4卷
ǎ u jà x时曰拭
C
·
N ao H
图 3P C一 4同刚果红复合物在不同浓度 N o 0 H中最大吸收波长的变化
Fi g
.
3 Ch an ge o f ab so r pt in o mx ai mu mo ft h e Con go Re d一P C· 呼 c o m ple x
in i f f de e rn t e n e e on t r at in o o f N a0 H
一一 h Te Con go Re d一 P C一 4 Co mP le x … … Con go Re d
表 1P C一 4的甲甚化分析
T ab le 1M e t h yl at i on an al y se o sP f C一 4
甲基化单塘 摩尔比
me t h yl at e d su gM o l ar r at i o
主要碎片离子的 m/ e
M ain m a s sf r a g me n t
连结方式
M o de o f l i ok a ge
2 , 3 , 4 , 6
一
G l e
2 , 4 , 6
一
G l e
2 , 4
一
G l e
1
。
0
1
。
, l
1
。
0 4
4 3, 4 5 , 7 1 , 1 0 1 , 1 1 7 , 1 2 9 , 14 5 , 16 9 , 2 0 5
4 3 , 8 7 , 1 0 1 , 1 1 7 , 12 9 , 16 1 , 1 8 9
4 3 , 8 7 , 1 1 7 , 1 2 9 , 1 8 9
1一
1一 3
.2 2 抑瘤活性研究
将小鼠接种 S一 1 80 肿瘤细胞后 , 由腹腔注射 P C 一 4 , 连续给药 10 天后处死 , 并计算
抑瘤率阁 。
抑瘤率 (多 ) ~ 〔A 一 B] / A X 10
A 是对照组的平均瘤重 , B 是给药组的平均瘤重 。 结果表明 , P C 一 4 对小鼠移植肿瘤
抑瘤率为 67 多。
按前述方法将不同浓度的 P C 一 4 与 S 一 180 肿瘤细胞共同培养 , 以观察离体条件下
有无抑瘤活性 , 结果如表 2所示。
从表中数据可见 ,离体条件下 , P C一 4 对 S一 180 肿瘤细胞无明显的抑制作用 。
和文献报导的具 夕( 1、 3 ) , 夕( l * 6 ) 结构的葡聚糖一样 , P C 一 4 对肿瘤细胞无直接
毒性 , 它是通过调节动物机体的免疫功能而起到抑瘤作用 。 日本国立癌研究中心认为 ,香
菇多糖 L e nt ian n 是通过增强巨噬细胞 、 杀伤细胞 、 杀伤性 T 细胞三种效应细胞活性起到
对癌细胞攻击的作用 。
1期 张丽萍等 :金顶侧耳多糖 C P一 4的结构确定与抗肿瘤活性的研究 3 7
表 2 Pc 一 4的抗肿瘤作用
T a bl e 2 A n ti 一 u tmo r ef f c e to f C P一峪
样品
Sa m pl e
曦
,
9 1m l )
抗肿瘤活性
A n t i
一 t u m o r a e t iv i t y ( o D
, 。。 。 . ) X 士 s D 。 二 10议雄
6 0 0
3 0 0
1 5 0
C o n t r o l
4 8h
O
·
2 8士 0 . 0 1
0
·
2 6土 0 . 0 2
0
.
2 4士 0 . 0 2
0
.
2 6土 0 . 05
9 6 h
0
。
1 4士 0 . 0 5
0
.
1`士 0 . 0 4
0
.
1 3土 0 . 0 5
0
.
0 9土 0 . 0 3
1 4 4 h
0
.
0 9土 0 . 0 3
0
.
0 9士 0 . 0 5
0
.
0 8士 0 . 0 1
0
.
0 8土 0 . 0 2
香菇多糖 , 云芝多糖 P S一 k 在 日本投放市场多年效益显著。 我国真菌资源丰富 , 尚
有待于进一步开发与应用 。 金顶侧耳多糖 P C 一 4 的抑瘤活性有无实用价值也需进一步工
作 。
参 考 文 献
1 S J
张丽萍 ,李森 , 等 。 真菌学报 , 1夕9 3 , 12 ( 2 ) : 1 58一 16 2。
S a s a k i T A
,
T a k a s u k a N O
.
C o r b o五y d r R 亡: , 1 9 7 6 , 4 7 : 9 9一 10 4 .
M i s a k i A K
,
K a k u t a M A
.
C a r b o h y d y R e ` , 19 8 1 , , 2: 1 15一 12 9
梁忠岩 ,张翼伸。 高等学校化学学报 , 1 98 3 , :4 3 6 4一 3 6 ,。
H
a r a C H
,
K i h o T A
.
C a r b o 人y d R e s , 19 82 , 1 10 : 7 7一 8 7 .
梁忠岩 ,张翼伸 。 生物化学杂志 , 1 9 8 5 , 1: 14 1一 l 斗7。
周义发。张翼伸。 生物化学杂志 , 1 , 9 1 ,7 : 7 4一 78 。
张淮杰 。 复合多糖生化研究技术 。 上海: 科学技术出版社 , 1 , 8 7 , 1 5 0一 1 , 2。
、 .Jt ., .J.卫.1.1二,山ZJ通.哎了一七. /ó.Lr. we. J,s..
真 菌 学 报 1 4 卷4 7具 困 生并 了汉 , 花万一一一-一一一S T R U C T U R A L D E T E R M IN A T IO N A N D S T U D Y O NA N T IT U M O R A C T I V IT Y O F P O L Y S A C C H A R I D EP C一 F R O M P L E U R O T U SC I T R I N O P I L E A T .U SZ h a n g L I P i n g M i a o C h u n y a l l X u L i y a n( D , P a , , . 。 。 , o f B i o l o g y , N o r r h o a , , N o r o a l U 移 i , e r , i : y , Z h a n g Y i s e nC 无a o g c 无二 。 13 0 0 2 4 )A B S T R A C T T h e w a t e r 一 s o l u b l e p o l y s a e c h a r id e P C 一 4 w a s i s o l a t e d a n d f u r t h e r
p u r i f i e d f r o 瓜 r e s id u e o f f r u i t b o d i e s o f P l e “ r o t “ 了 c i , r i移 o P i l e a t“ : . T h e m o l e e u l a r
w e i g il t o f P C
一 4 w a s a b o u t 1 8 9 K d
.
G e l e h r o m a t o g r a p il y o n S e Ph a r o s e C L一 4 B r e v e a l s
t h a t P C
一 4 15 h o m o g e n e o u s
·
T il e c h e画 c a l s t r u c t u r e o f PC 一 4 w a s d e t e r m i n e d b y P e r i o d a t e o x i d a t i o n , Sm i t h
d e g r a t i o n
,
m e t h y l a t i o n
,
G
.
C , G
.
C一M
.
5
. , I
H
一
N M R
, I J C 一 N M R
,
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, e t e
.
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p C 一 4 m o l e e u l a r w a s c o tn p o s e d o f 夕( 1 ” 3 ) l i n k e d g l u e o p y r a n o s e a s a m a i n e h a i n
a n d ( 1 ` 6 ) b r a n c il . I t w a s a b o u t e v e r y f i v e g l u c o s y l r e s id u e s w i t h t w o s i n g l e G l e
b r a n e h e s
.
I t w a s f o u n d P C
一 4 il a s a n t i t u m o r a e t i v i t y o n t h e i m P l a n t e d S a r e o m a 1 8 0 i n
m i e e
,
i n h i b i t i o n r a t i o w a s 6 7外 ; i t w a s n o t f o u n d t h e a n t i t u m o r a e t i v i t y o n s 一 1 8 0
I n V l t f o
。
K E Y W O R D S p l
e “ r o t “ 5 c i t r ￡” o P` l o a r u s , P o l y s a e e h a r i d e , T u m o r s 一 1 5 0