全 文 ：中国法医学杂志 CHINJFORENSICMED 2008年第 23卷第 3期
【基金项目】云南省科技攻关资助项目(2001GG34)
【作者简介】路帆(1958-), 女 , 天津人 , 主任法医师 ,主要从事
毒品 、毒物研究。
AFLP技术鉴别罂粟 、虞美人和大麻种属差异的初步研究
路 帆1 , 程宝文 1 , 李 虹1 , 曾发明 1 , 洪俊彦2 , 文云波 3 ,
焦德强 4 , 李丽莎5 , 赵文嵩 1 , 方 平1
(1.云南省公安厅刑事科学技术研究所 ,云南 昆明 650021;2.昆明明技科技有限公司 , 云南 昆明 650223;
3.昆明市公安局五华分局 , 云南 昆明 650041;4.保山市公安局刑事科学技术研究所 , 云南 保山 655400;
5.西双版纳州公安局刑事科学技术研究所 , 云南 西双版纳 666100)
【摘要】目的 探讨采用 AFLP技术检测植物 DNA,鉴别罂粟 、虞美人和大麻植物种属间差异的方法。方法 收集
罂粟根 、茎 、叶 、花 、果以及虞美人和大麻叶检材 , 用 AxyPrepDNA试剂盒提 DNA, 经 EcoRI/MseI酶切 ,人工接头及
PCR预扩增 ,用 E-ACA/M-CAG、E-ACT/M-CTC、E-ACC/M-CTA、E-ACC/M-CTG、E-AGC/M-CTT、E-AGG/M-CTA6对标
记了荧光的选择性引物进行 PCR扩增 ,其产物在的 CEQ8000遗传分析仪上检测。结果 6对引物分别在罂粟 、大麻
和虞美人样本中检出 27 ～ 46、5 ～ 20、4 ～ 31条扩增片段 , 种属间存在明显差异;同一罂粟根 、茎 、叶 、花和果的 DNA检
测结果相同。结论 罂粟 、虞美人和大麻 3种植物的 AFLP分析结果显示出的差异性 ,同一植株不同部位 DNAAFLP
结果的同一性 , 有可能用于检测未知植物检材的种属来源。
【关键词】法医物证学;植物 DNA;罂粟;虞美人;大麻;种属鉴定
【文献标识码】A 【文章编号】 1001-5728(2008)03-0157-04
ApreliminarystudyonspeciesdifferencesamongPapaversomniferumL, PapaverrhoeasLand
CannabissativaLbyAFLPtechnique(■LUFan, CHENGBao-wen, LIHong, etal./■YunnanSecurity
Department, Kunming650021 , China)
【Abstract】ObjectiveTodisclosetheinter-speciesdiferencesamongPapaversomniferumL, Papaver
rhoeasLandCannabissativaLusingAFLPanalysis.MethodsTheroot, stem, foliage, flower, seedof
PapaversomniferumL, foliageofPapaverrhoeasLandCannabissativaLwerecolectedrespectively.DNA
wasisolatedwithAxyPrepKit, anddouble-digestedbyEcoRIandMseI, thenoligonucleotideadapters
wereligated.AfterPre-amplification, selectiveamplificationwasperformedusing6 pairsoffluorescent
primer.TheDNAfragmentswereanalyzedusingaCEQ8000DNAFragmentAnalyzer.Results27to46,
5 to20and4 to31piecesofamplifiedproductsweredetectedfromPapaversomniferumL, Cannabissativa
LandPapaverrhoeasLrespectively, andsignificantdiferencewasobservedamongthesethreegroupsof
products.Theidenticalspecies-specificpeakswereidentifiedfromroot, stem, leaf, flowerandseedDNA
fromthesamePapaversomniferumL.ConclusionThediacriticalresultsfromPapaversomniferumL,
PapaverrhoeasLandCannabissativaL, aswelastheidenticalresultsofdiferentpartsfromthesame
plantdemonstratedthatAFLPanalysiscouldbeusedpossiblytodeterminethespeciesoriginofunknown
plantssamples.
【Keywords】Forensicbiologicalevidence;BotanyDNA;PapaversomniferumL;PapaverrhoeasL;
CannabissativaL;Genusidentification
在非法种植罂粟(PapaversomniferumL)、大麻
(CannabissativaL)及毒品走私案件的侦破中 ,常涉
及对相关原植物的种属[ 1, 2] 、来源地鉴定 [ 3] 。通过进
化 ,物种间 DNA片段大小和序列各不相同 ,因此 ,检
测其 DNA序列差异可能实现对罂粟 、虞美人和大麻
等毒品原植物的物种鉴定。扩增片段长度多态性
(amplifiedfragmentlengthpolymorphismAFLP)技术[ 4]
具有操作简便 、快速 、重复性好和模板 DNA用量少的
优点。本文采用 AFLP技术对罂粟属的罂粟 、虞美人
和桑科的大麻 DNA进行检测 ,以期为罂粟 、大麻毒品
原植物的种属鉴定提供可行的检测方法 。
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DOI :10.13618/j.issn.1001-5728.2008.03.005
中国法医学杂志 CHINJFORENSICMED 2008年第 23卷第 3期
1 材料和方法
1.1 样本及 DNA的提取
1.1.1 检材 罂粟:植株采自缅甸 , 分别取根 40、
120mg、茎 120、240 mg,叶 10、100 mg,花 10、100 mg
和果 120 mg备检 。虞美人和大麻:植株采自中国科
学院植物研究所昆明市植物园 ,各取叶 50 mg。同一
罂粟根 、茎 、叶 、花 、果各 1份用于同一性检测;罂粟及
虞美人 、大麻植株各 1份用于差异性检测 。
1.1.2 DNA提取 按 Axygen公司的 AxyPrepDNA
试剂盒的说明进行 , 1%琼脂糖凝胶电泳检测 。提取
的 DNA样本作 EcoRI/MseI酶切 、T4DNA酶连接 、
PCR预扩增和和选择性扩增。
1.2 EcoRI/MseI核酸内切酶消化
EcoRI酶切 20μl体系 ,包含 EcoRI1μl(10U/μl),
10×Bufer2μl,总 DNA5μl(100ng), 37℃反应 2h,
65℃ 30 min终止反应;MseI酶切 20μl体系 ,包含
MseI1μl(10U/μl), 10×Bufer2μl, EcoRI酶切产
物 15μl, 65℃ 2h, 80℃ 30min终止反应 。
1.3 T4DNA连接酶反应
20μl反应体系 ,包含 T4DNALigase2μl(5U/μl),
10×Bufer2μl, EcoRI/MseI双酶切产物 10μl, EcoR
I/ MseIAdaptor(序列见表 1)各 1μl, ddH2O4μl,
22℃ 3h, 65℃ 10min终止反应。
表 1 荧光 AFLP分析中的接头 、预扩增和选择性扩增引物序列
Table1 Theadapters, pre-amplificationandselectiveamplificationprimersequencesforfluorescentAFLPanalysis
名 称 序列
接头
EcoRIadapter
MseIadapter
5-AATTGGTACGCAGTCTAC-3
3-CCATGCGTCAGATGCTC-5
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-3
预扩增引物 E+1M+1
5-GACTGCGTACCAATTCA-3
5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3
选择性扩增引物 5端标 D4PA
E-ACA:
E-ACT:
E-ACC
E-AGC:
E-AGG:
M-CAG:
M-CTC:
M-CTA
M-CTG
M-CTT
5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3
5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3
1.4 PCR预扩增
20 μl体系 , T4 DNA连接酶反应产物 4μl, Mse
I/EcoRI引物各 1μl(35ng/μl), Taq酶 (5U/μl)
1μl, dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl, MgCl2 1.6μl, 10×
Bufer2μl, ddH2O13.8μl。预扩增在 MJPTC200PCR
仪上进行 , 程序为 94℃ 2min, 94℃ 20s, 56℃ 30s,
72℃ 2min, 20次循环后 60℃ 30min。
1.5 PCR选择性扩增(20μl体系 /样品)
取 PCR预扩增产物 4μl(预扩增产物稀释 20
倍),分别加 E-ACA/M-CAG、E-ACT/M-CTC、E-ACC/
M-CTA、 E-ACC/M-CTG、 E-AGC/M-CTA、 E-AGG/M-
CTA选择性扩增引物 1μl(35ng/μl),其余和预扩增
反应体系相同 。选择性扩增程序:94℃ 2min后 94℃
20s, 66℃ 30s, 72℃ 2 min,每循环降 1℃,共 10个循
环;然后再 94℃ 20s, 56℃ 30s, 72℃ 2 min, 20个循
环 ,最后 60℃ 30min。
1.6 扩增产物电泳检测
电泳上样液为去离子甲酰胺 15μl、Sizestandard-
600分子量内标(ABI公司)0.2μl,选择性 PCR扩增
产物 0.4μl, 在 CEQ 8000遗传分析仪 (Beckman
Coulter公司)上进行毛细管凝胶电泳分离 , DNA片断
分析软件采集激光激发荧光数据 ,参照分子量内标分
析各引物对在 50 ～ 500bp的检测区域内的扩增片段 。
2 结 果
所有检材包括 10mg的罂粟叶及干燥的罂粟根 、
茎 、花和果均提出了大分子的 DNA,从干燥不完全的
花和果中提出的 DNA有部份降解。
用于差异性检验的检材中提取的 DNA经 EcoRI
/MseI双酶切 、T4 DNA酶连接上接头 、PCR预扩增
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及 6对引物的选择性扩增 ,结果见图 1 ～ 6。
在分子量内标有效的 50 ～ 500bp检测区域内 , 6
对引物检出的片段数量:罂粟为 46、27、37、43、35和
35条 ,其中 E-ACA/M-CAG引物扩增的片段数目在
所有样本中最多 ,达 46条 (图 1);大麻检出 12、10、
13、20、14和 5条 ,其中 E-ACC/M-CTG引物对扩增得
到的 20条片段峰高及片断大小分布较均匀 (图 4);
虞美人检出 31、21、40、15、4和 10条 ,其中 E-AGC/M-
CTA引物扩增得到的片段数目在所有样本中最少 ,仅
4条(图 5)。
6对引物检出的片段大小:罂粟 61.84 ～ 464.21bp;
大麻 85.24 ～ 499.24bp,虞美人91.15 ～ 455.27bp(表 2)。
表 2 罂粟 、大麻和虞美人 DNA的 AFLP分析结果
Table2 ThepolymorphismresultsofPapaver
somniferumL, PapaverrhoeasLandCannabis
sativaLDNAbyAFLPanalysis
样品 引物 扩增片段范围(bp)片段数目
罂粟
E-ACA/M-CAG 91.08-412.54 46
E-ACT/M-CTC 94.48-392.94 27
E-CC/M-CTA 94.34-408.84 37
E-CC/M-CTG 61.84-433.16 43
E-AGC/M-CTA 104.39-464.21 35
E-AGG/M-CTA 85.57-434.69 35
大麻
E-ACA/M-CAG 85.24-499.24 12
E-ACT/M-CTC 109.50-322.08 10
E-CC/M-CTA 113.74-496.00 13
E-CC/M-CTG 92.47-445.36 20
E-AGC/M-CTA 93.50-420.37 14
E-AGG/M-CTA 132.45-461.19 5
虞美人
E-ACA/M-CAG 104.01-444.95 31
E-ACT/M-CTC 102.56-426.78 21
E-CC/M-CTA 91.15-455.27 40
E-CC/M-CTG 110.58-272.21 15
E-AGC/M-CTA 138.92-180.43 4
E-AGG/M-CTA 92.31-289.61 10
3 讨 论
在犯罪现场上 ,除了人体检材外 ,还会有与犯罪
相关的各类动植物检材 ,对这些非人源性 DNA样本
的种属分析 ,同样能够为案件侦破提供线索和证据 。
如近年来 ,海洛因 、大麻等毒品走私案猖獗 ,在边境地
区 、甚至内地 ,非法种植罂粟植物的案件也时有发生 。
目前对毒品原植物多根据形态学特征来判定其种属 ,
但由于罂粟的花型 、颜色及果实与同科属观赏植物虞
美人[ 5]极为相似 ,仅从外观形态上很难鉴别;而大麻
也常被混在其它植物中进行走私和贩卖 。为查明上
述毒品的种属及来源地 ,国内外已有较多对不同产地
的毒品提取物海洛因 、四氢大麻酚等 [ 6]及其添加剂成
分进行检验鉴别的研究报道 ,但对罂粟和大麻等毒品
原植物 DNA遗传信息的研究较少。
生物的遗传信息存在于其 DNA的碱基序列中 ,
在长期的进化中 ,不同属间 、种间甚至品种 、品系间同
源的 DNA序列上 ,由于碱基的插入 、缺失 、转换或重
组等突变 ,就会引起 DNA序列和限制性内切酶位点
的不同 , AFLP就是基于上述原理 , 结合了 PCR和
RFLP标记技术的优点而发展起来的 DNA指纹技
术[ 7] 。本研究利用罂粟 、大麻和虞美人植物 DNA的
大小和序列差异 ,分别用识别 6碱基回文结构的低频
剪切酶 (EcoRI)和识别 4碱基回文结构的高频剪切
酶 (MseI)酶切 3种植物 DNA,使其酶切产物带有
EcoRI和 MseI的黏末端 ,在 T4连接酶的作用下 ,将
EcoRI和 MseI的人工接头连接到酶切产物上 ,人工
接头作为 PCR预扩增的引物结合点 ,经预扩增和荧
光标记引物选择性扩增而获得种属特异的片段。由
于使用了高 、低频的双酶酶切总 DNA,确保了相当数
量的酶切片段 ,同时 ,为达到选择性扩增的目的 ,通过
选择在末端添加了 3个选择性核苷酸的不同引物 ,这
些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配
对序列的内切酶酶切片段 ,并与之结合 ,实现特异性
扩增 。理论上讲 ,在选择性扩增时引物末端每增加一
个碱基 ,只扩增预扩增产物中和末端碱基相匹配的
1/4片段 ,本研究中的选择性引物上添加了 3个碱
基 ,则仅能扩增预扩增产物中 1 /4096的片段 ,增加了
其特异性。此外 ,本研究采用荧光标记选择性扩增引
物其检测的灵敏度比银染法高 [ 8] 。一些研究认为对
同种检材进行 AFLP分析 ,错误率小于 0.6%,与微卫
星标记的水平相近[ 9] 。由于荧光 AFLP技术用 PCR
技术代替了 RFLP技术中的 Southern杂交 ,同时兼有
快速 、灵敏 、稳定 ,所需 DNA量少 ,适用对各类微量植
物检材的检测 [ 8] 。
本研究从 64对 AFLP检测的通用引物中选取 6
对在罂粟 、大麻和虞美人样本中检出 27 ～ 46、5 ～ 20
和 4 ～ 31条扩增片段 ,结果显示在种系间存在显著差
异 ,其中 E-ACC/M-CTG引物对在大麻 DNA中检出
20条带 ,片段大小分布均匀;E-ACC/M-CTA引物对
在虞美人 DNA中则扩增出了 40条大小不同的片段 ,
表明上述 2引物对可适用于大麻和虞美人 DNA的
AFLP种属鉴定 。同属不同种的罂粟和虞美人 DNA
经 6对选择性扩增引物检测 ,其 AFLP扩增片段大小
和数量差异较小 ,而不同种属的罂粟和大麻扩增片段
大小和数量差异则较大 ,但由于本文样本量较少 ,是
否可以从 AFLP的检测图谱上判定植物种属关系还
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有待研究。 6引物对扩增同一罂粟植株根 、茎 、叶 、花
和果 DNA得到的片段大小和数目相同 。
综上 ,本研究获取的数据可为罂粟和大麻毒品原
植物的鉴定提供依据 ,而本文方法 DNA用量少 、引物
通用 、检测快速方便 ,也可望适用于法医学对各类未
知名植物检材的种属鉴别 。
(本文图见彩插 Ⅱ、Ⅲ )
【参 考 文 献】
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[ 5] 傅立国.中国高等植物 [ M] .青岛:青岛出版社 , 2000:
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[ 6] 陈其军 , 韩玉珍 , 傅永福 , 等.大麻性别的 RAPD和 SCAR
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Botanicalcontributiontoforensicsanddrugenforcement
[ J] .CroatMedJ, 2001, 42(3):340-345.
(收稿日期:2007-06-21;修回日期:2007-08-09)
【作者简介】李红卫(1967-), 男 , 河北冀县人 , 副主任法医师 ,
博士研究生 , 研究方向:法医病理损伤学。
根据创口射击残留物推断 “5.4”式手枪射击距离的研究
李红卫 1, 2 , 万立华1 , 马智华 2 , 何 锐2 , 张 中 2 , 喻永敏 2
(1.重庆医科大学临床医学检验系 , 重庆 400016;2.重庆刑事科学技术研究所 ,重庆 400042)
【摘要】目的 利用环境控制扫描电镜 /能谱仪(SEM/EDX)研究枪弹创射入口周围射击残留物与射击距离的关
系 ,探讨其能否用于射击距离的判断。方法 采用 “ 5.4”式手枪分别在 5、 10、 15、20、 30、40、 50、60、70、 80、90、 120cm
处射击乳猪皮肤 , 利用 SEM/EDX观察创口周围 GSR的分布和成分 , 并建立回归方程。结果 射击距离和 GSR颗粒
数量之间总体表现为直线关系 , 并建立了相应的回归方程。当射击距离为 10 ～ 90cm时 ,用该方程推断射击距离效果
较好。结论 检测创口周围 GSR可望用于判断 “ 5.4”式手枪的射击距离。
【关键词】法医病理学;射击残留物;射击距离;SEM/EDX;“ 5.4”式手枪
【文献标识码】A 【文章编号】 1001-5728(2008)03-0160-03
Studyaboutthepossibilityofestimatingfiringdistanceof“ 5.4” handgunaccordingtotheGSR
(■LIHong-wei, WANLi-hua, MAZhi-hua, etal./■FacultyofClinicalInspection, ChongqingUniversity
ofMedicalScience, Chongqing400016, China)
【Abstract】ObjectiveTostudytherelationshipbetweenGSRandfiringdistance, andtodiscus
whethertherelationshipcanbeusedtoestimatethefiringdistance.MethodsShotingporketswith“5.4”
handgunatthefiringdistanceof5, 10, 15 , 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120cmrespectively, then
observingthedistributingandelementofGSRwithSEM/EDXandfinalybuildingtheequationofregres-
sion.ResultsTherelationshipbetweenthequantityofGSRandfiringdistanceislinearandtheequationis
built.Whenthefiringdistanceisfrom10to90cm, theresultispreferably.ConclusionWecanestimate
the“ 5.4”handgunfiringdistancethroughtestingGSRaroundgunshotwounds.
【Keywords】Forensicpathology;Gunshotresidue;Firingdistance;SEM/EDX;“5.4”handgun
射击距离判断是犯罪现场重建的关键环节。射
击距离的判断的主要依据是射入口周围射击残留物
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