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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
辣椒（Capsicum）起源于中南美洲热带地区，
栽培历史悠久，遗传资源丰富。我国是世界上辣椒
栽培面积最大的国家，目前我国辣椒年种植面积
130-160 万 hm2，总产值 270-300 亿元，需要杂交种
975-1 200 t［1］。环境、栽培措施和优良品种利用是
农业增产增收的主要贡献因素，而优良品种利用的
贡献率超过 60%。随着辣椒育种技术发展，辣椒品
种也迅速增多，而辣椒生产中品种和种子质量问题
也显得比较突出，在生产实践中，常常出现种子纯
度不高、活力下降，造成产量降低、品质变劣，严
收稿日期 ：2014-04-10
基金项目 ：云南省农业科学院优秀团队培育项目（YAAS2014YY002）
作者简介 ：管俊娇，女，硕士，助理研究员，研究方向 ：DUS 测试技术研究 ；E-mail ：guanjunjiao@163.com
通讯作者 ：张建华，研究员，研究方向 ：作物品种与种子质量评价 ；E-mail ：zhjhua6748@163.com
辣椒杂交种纯度鉴定的 SSR 核心引物筛选
管俊娇  张建华  张惠  马芙蓉  杨晓洪  王江民
（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明 650205）
摘 要 ： 旨在确定一套适于辣椒杂交种纯度鉴定的核心 SSR 引物，利用 17 对 SSR 引物对 100 份已知辣椒（Capsicum）杂交
种进行 DNA 指纹分析。根据多态性和杂合率两个指标，确定 Hpms1-214、Es395 和 Hpms1-5 为辣椒杂交种纯度鉴定的首选核心引
物，利用这 3 个引物进行筛选，97 个品种（占 97%）能够找到具有杂合带型的鉴定引物，确定 5 个引物 Es330、Es363、Epms923、
Es120 和 Es64 为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出 14 个品种的特异性引物，可进一步筛选每个辣椒杂交种的双亲互补
型引物。
关键词 ： 辣椒 SSR 杂交种 纯度鉴定 核心引物
Screening SSR Core Primers for Pepper Germplasm Hybrid Purity
Identification
Guan Junjiao Zhang Jianhua Zhang Hui Ma Furong Yang Xiaohong Wang Jiangmin
（Ministry of Agriculture/Quanlity Standard and Testing Technology Research Institute，Yunnan Academy of Agriculture Sciences，
Kunming 650205）
Abstract: In order to determine a set of SSR core primers fitting for pepper hybrids’ purity identification, 100 pepper（Capsicum）
hybrids were analyzed by 17 SSR primers. According to their polymorpism and heterogosite rate, three primers Hpms1-214, Es395 and Hpms1-5
were determined as preferred core primers for pepper hybrid purity identification. Using three preferred core primers, 97 hybrids（accounting for
97%）have heterozygosis band type in at least one primer. Five primers Es330, Es363, Epms923, Es120 and Es64 were determined as candidate
core primers for pepper hybrid purity identification. 14 varieties had specific primers within the 100 varieties. Primers with complementary band
types were further screened for pepper purity identification.
Key words: Pepper germplasm SSR Hybrid Purity identification Core primers
重影响其经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度
检测工作显得尤其重要。
随着分子标记技术的发展，分子标记技术已经
开始在辣椒品种纯度鉴定中得到应用，其中，RAPD
标记和 SSR 标记是应用较多的标记技术。然而，在
以往的研究中，为解决少数杂交种的纯度鉴定，往
往需要进行大量的引物筛选工作，才能找到适合的
鉴定引物［2］。能否确定一套适于纯度鉴定的核心引
物，并构建已知品种纯度鉴定标准 DNA 指纹图谱，
对已知品种的纯度鉴定至关重要。有了核心引物就
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期98
不再需要进行繁琐的引物筛选，即使对未知品种，
也只需进行少量的筛选，就能迅速找到合适的鉴定
引物。SSR 标记具有操作简便和稳定可靠等优点，
加之具有大量的等位差异，多态性十分丰富，在杂
交种子纯度检测中有广阔的应用前景。
杂交种纯度鉴定的两个目的［2］：最主要的目的
是验自交苗，仅需要 1 对双亲互补型引物即可 ；其
次是验异型株，需要用特异引物或引物组合，使得
出现相同带型品种的概率足够低，从而能有效地区
分出异型株。基于这两点，适于纯度鉴定的核心引
物必须具备以下两个特征 ：（1）杂合率高，从而具
有较强的区分自交苗的能力，能够比较容易筛选到
双亲互补型的引物 ；（2）多态性高，从而具有较高
的区分异型株的能力。只有这样，才能保证预筛时
仅采用少数引物就可以比较容易找到符合要求的引
物。据此，王凤格等［2］把引物分为 3 类 ：（1）多态
性高，且杂合率高 ；（2）多态性高或中，且杂合率
高或中 ；（3）多态性低或中，或杂合率低。其中，
第 1 类引物最适于纯度鉴定，其次是第 2 类，对于
第 3 类引物，一般不推荐作为纯度鉴定优先选用的
引物。
本研究通过对 100 个国内辣椒杂交种的 DNA 指
纹分析，确定适于纯度鉴定的核心引物的评估指标，
进而确定一套辣椒杂交种纯度鉴定核心引物，确定
特定品种的纯度鉴定的特异引物，旨在为构建辣椒
杂交种纯度鉴定标准 DNA 指纹图谱奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 供试材料为辣椒杂交种，共 100 份。
包括全国主要育种单位的辣椒品种，如中国农科院
蔬菜花卉研究所、湖南湘研种业、江苏农科院、海
花公司、河北省农科院、中国热带农业科学院、湖
南省蔬菜研究所、四川省农科院等培育的骨干品种。
这些品种基本上能代表目前国内辣椒新品种的情况。
1.1.2 SSR 引物 根据赵久然等［3］提出的核心引
物的筛选原则，经网上初筛和实验室复筛，确定
了 17 对多态性、稳性、重复性等综合性状好的引
物， 包 括 Es330、Es363、Epms923、Hpms1-214、
Epms697、Es110、Es120、Es285、Es292、Es297、
Es395、Hpms1-106、Epms712、Es417、Es321、
Es64 和 Hpms1-5［4-6］。 采 用 此 17 对 SSR 引 物 进 行
进一步的引物评估与筛选，以确定适于纯度鉴定的
引物。引物正义链 5 末端分别标记 TAMRA、HEX、
ROX、6-FAM 四种荧光，利用 DNA 分析仪检测不同
等位变异的扩增片段大小。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 每个品种随机取 5 个单株幼嫩组
织，采用周春阳等［7］改进的 CTAB 法进行单株提取
DNA。
1.2.2 SSR 扩增 反应体系 ：20 μL 的反应体积，含
每种 dNTP 0.25 mmol/L，正反向引物各 0.3 mmol/L，
Taq DNA 聚合酶 0.4 U，1×PCR 缓冲液（含 Mg2+），
DNA 模板 50 ng。SSR 荧光引物由上海生工合成。
反应程序 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性 45 s，
55℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，共 35 个循环 ；72℃
延伸 10 min，4℃保存。PCR 扩增在 AB9700 上进行。
1.2.3 电泳检测 PCR 产物变性后在 ABI 3130 测序
仪上分离，每个反应重复 2 次。
1.2.4 据统计分析 使用 DNA 分析仪的片段分析软
件，读出每个位点每个样品的等位变异大小数据。
由于辣椒是二倍体及 SSR 标记的共显性特征，因此
每个供试品种在每个引物位点上的基因型用纯合位
点的等位变异记录为 X/X，杂合位点的等位变异记
录为 X/Y，其中 X、Y 为该位点上两个不同的等位
变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等
位变异的大小记录为 0/0。
评估引物多态性高低的指标用多态性信息量
（Polymorphism information content，PIC）：PICi=1-
∑ P2ij，式中，Pi 和 Pj 分别代表第 i 个和第 j 个等位基
因的频率，且 i ≠ j。
评估引物位点杂合程度的指标用杂合率 ：ᵲਸ⦷ 䈕ᕅ⢙ս⛩кާᴹᵲਸᑖරⲴ૱⿽ᮠᙫ૱⿽ᮠ
2 结果
2.1 适于纯度鉴定用引物的选择
利用 17 对 SSR 引物建立了 100 个辣椒品种的
DNA 指纹图谱，根据图谱数据统计分析引物的基因
频率及基因分布的基本信息及多态性和杂合表现。
2014年第9期 99管俊娇等：辣椒杂交种纯度鉴定的 SSR 核心引物筛选
表 1 显示，辣椒 SSR 引物的多态性和杂合率均不高，
且 PIC 值和杂合率这两个值不完全具有协同性，如
Epms697 的 PIC 值（0.51）较高，但杂合率（0.23）
相对较低。
按分类标准，把引物分为 3 类 ：（1）多态性高，
且 杂 合 率 高 ：Hpms1-214、Es395 和 Hpms1-5 ；（2）
多态性高或中，且杂合率高或中 ：Es330、Es363、
Epms923、Es120 和 Es64 ；（3）多态性低或中，或杂
合 率 低 ：Epms697、Es110、Es285、Es292、Es297、
Hpms1-106、Epms712、Es417 和 Es321。
采用 Hpms1-214、Es395 和 Hpms1-5 三个引物，
100 个品种中 97 个具有杂合带型，3 个品种（超级
十六号、兴蔬 201、博辣 4 号）不具有杂合带型，
增加 Es 64 对这 3 个品种进行检测，均具有杂合带型。
2.2 纯度鉴定特异引物的确定
特异引物是在特定品种范围内，利用单个引物
检测，某品种的基因型仅出现 1 次（称为特异带型）
或者根据基因频率表，预测基因型频率低于一定值
的基因型，可将该引物作为该品种在特定品种范围
内的特异引物。如果作为纯度鉴定的特异引物，还
需限定其基因型应为杂合基因型。
表 2 汇总了所有 100 个辣椒杂交种利用 17 个
引物检测的结果，累计 14 个品种的基因型仅出现
1 次，具有特异引物，其中 Hpms1-214 和 Hpms1-5
作为特异引物的次数最多，分别为 5 个和 7 个，而
Es395 没有作为特异引物。从多态性和杂合率上看，
Es395 属于多态性和杂合率较高的引物，而 Es292
属于多态性和杂合率较低的引物，表明能否找到特
异引物与引物的多态性和杂合率没有直接的线性关
系，而与引物不同等位基因出现频率的均匀程度关
系较大。计算出的这些特征带型的实际基因型频率
应为 1.00E-02（1/100），而理论基因型频率最高的
为 2.50E-02，最低的为 6.00E-04，7 个品种的理论基
因型频率高于实际基因型频率。
表 3 列出了每个引物理论上所具有的最低基因
型频率及对应的基因型，单个引物基因型频率最低
的为 1.00E-04。如果将预测基因型频率低于 1.00E-02
（即 1/100）的基因型作为特异基因型，则 Es120、
Es285、Es297 和 Epms712 对任何品种均不可能成为
特异引物，而其它 13 个引物则有可能成为具有特定
基因型的品种的特异引物。
3 讨论
3.1 SSR分子标记在辣椒杂交种品种鉴定及纯度
检测中的应用
SSR 分子标记已被广泛用于品种鉴定、指纹图
表 1 SSR 引物的基本评估信息
引物 等位基因数 理论基因型数 实际基因型数 PIC 值 杂合率 最大基因频率 最小基因频率
Es330 4 10 7 0.52 0.40 0.71 0.02
Es363 5 15 6 0.49 0.30 0.50 0.01
Epms923 4 10 7 0.44 0.36 0.54 0.01
Hpms1214 8 36 14 0.65 0.67 0.68 0.02
Epms697 3 6 5 0.51 0.23 0.62 0.04
Es110 3 6 4 0.42 0.10 0.95 0.01
Es120 5 15 11 0.55 0.44 0.59 0.01
Es285 2 3 3 0.34 0.29 0.85 0.42
Es292 5 15 6 0.25 0.12 0.98 0.01
Es297 2 3 3 0.34 0.15 0.89 0.23
Es395 4 10 7 0.52 0.51 0.51 0.01
Hpms1-106 3 6 4 0.37 0.27 0.77 0.01
Epms712 3 6 4 0.50 0.29 0.66 0.03
Es417 6 21 9 0.33 0.34 0.92 0.01
Es321 5 15 7 0.42 0.12 0.95 0.01
Es64 4 10 5 0.43 0.33 0.70 0.01
Hpms1-5 11 66 25 0.66 0.45 0.60 0.01
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期100
谱、分子辅助育种等研究中，但是由于辣椒育种背
景狭窄，SSR 分子标记在辣椒杂交种中多态性较低
（最高 PIC 值为 0.66），杂合率也不高（最高杂合率
为 0.67），难以区分更多的辣椒杂交种，也不利于在
杂交种纯度检测，因此需要开发更多的多态性标记。
3.2 辣椒杂交种纯度鉴定用核心引物的筛选
适于纯度鉴定的核心引物必须具备以下两个特
征 ：杂合率高、多态性高。在本研究评估的 17 个引
物中，综合表现最好的 3 个引物 Hpms1-214、Es395
和 Hpms1-5，采用这 3 个引物进行筛选，97% 的品
种均可以找到具有杂合带型的引物，满足检验自交
苗的需要，且这 3 个引物多态性高，具有较高的验
杂能力。因此，这 3 个引物可以推荐作为纯度鉴定
的首选核心引物。其它 5 个中等表现的引物 Es330、
Es363、Epms923、Es120 和 Es64，尽管综合表现比
上述两个引物略差，但基本上满足要求，因此，推
荐作为纯度鉴定的备选引物，补充解决上述两个引
物不能鉴定的品种。其它 9 个引物，多态性或杂合
率偏低，一般不建议作为纯度鉴定的引物。因此，
如果不考虑引物的多态性，即引物区分异型株的能
力，仅考虑引物区分自交苗的能力，这 8 个引物完
全可以满足纯度鉴定的需要，而且，优先选用其中
2-3 个引物（如 Hpms1-214 和 Es395）就可解决绝
大部分品种的纯度鉴定。从工作效率上看，纯度鉴
定每份样品一般检测 100 个单株，增加检测的引物
数量会造成工作量的成倍增加。因此，核心引物的
选择，极大地提高了检测的工作效率。
3.3 特定品种纯度鉴定所用特异引物筛选
确定特定品种的特异引物，其意义在于，对于
特定品种不需要多个引物的组合，而仅需一个引物
就可以同时检验自交株和异型株，从而大大减少纯
表 2 具有特异引物的辣椒品种及其基因型
特异引物 个数 品种 基因型 实际基因型频率 理论基因型频率
Hpms1-214 5 国禧 101 92 bp/95 bp 1.00E-02 2.50E-02
国塔 104 98 bp/101 bp 1.00E-02 7.50E-03
热辣 2 号 87 bp/95 bp 1.00E-02 6.00E-04
都椒一号 87 bp/92 bp 1.00E-02 1.20E-02
兴蔬嫩辣 92 bp/101 bp 1.00E-02 1.20E-02
Es110 1 热辣 2 号 138 bp/144 bp 1.00E-02 1.40E-03
Es292 2 京甜 1 号 119 bp/121 bp 1.00E-02 9.80E-03
国塔 106 121 bp/125 bp 1.00E-02 9.80E-03
Es417 1 国塔 112 79 bp/94 bp 1.00E-02 7.20E-03
Hpms1-5 7 湘妃 289 bp/301 bp 1.00E-02 6.50E-03
苏椒 11 号 299 bp/318 bp 1.00E-02 7.00E-04
苏椒 13 号 314 bp/318 bp 1.00E-02 4.44E-02
国塔 104 291 bp/305 bp 1.00E-02 1.40E-02
杭椒 1 号 305 bp/307 bp 1.00E-02 1.20E-03
都椒一号 305 bp/314 bp 1.00E-02 2.20E-02
福湘 5 号 289 bp/291 bp 1.00E-02 2.40E-02
表 3 引物具有最低基因型频率的基因型
引物 最低基因型 最低基因型频率
Es330 97 bp/121 bp 2.70E-03
Es363 85 bp/87 bp 4.00E-04
Epms923 287 bp/342 bp 1.30E-03
Hpms1-214 87 bp/101 bp 3.00E-04
Epms697 106 bp/118 bp 2.24E-02
Es110 138 bp/144 bp 1.40E-03
Es120 155 bp/157 bp 1.68E-02
Es285 118 bp/121 bp 4.30E-01
Es292 119 bp/125 bp 1.00E-04
Es297 116 bp/122 bp 2.25E-01
Es395 84 bp/93 bp 3.00E-03
Hpms1-106 142 bp/154 bp 5.30E-03
Epms712 126 bp/140 bp 1.89E-02
Es417 73 bp/79 bp 7.00E-04
Es321 106 bp/122 bp 1.00E-04
Es64 140 bp/168 bp 1.00E-04
Hpms1-5 299 bp/307 bp 3.00E-04
2014年第9期 101管俊娇等：辣椒杂交种纯度鉴定的 SSR 核心引物筛选
度鉴定的成本［8］。
作为某个特定品种的纯度鉴定特异引物，需满
足两个条件，一是具有双亲互补带型，检验自交株，
二是基因型频率足够低，可以区分异型株。如果主
要目的是检验自交苗（在实际鉴定中比较普遍），则
特异引物只需是双亲互补型。由于特异引物一般是
从推荐的核心引物中筛选到的，多态性较高，因此，
仍具有一定的区分异型株的能力，单个引物基本上
可以满足一般纯度鉴定的需要。只有在有必要的情
况下，才增加引物数检测。
本研究结果显示，一个品种可以有多个特异引
物，根据不同检测目标，不同研究者所使用的引物
也会不尽相同。在后续的研究中，还需要筛选更多
品种的特异引物，以期实现辣椒杂交种快速、低成
本的纯度检测。
4 结论
根据多态性和杂合率两个指标，确定 Hpms1-
214、Es395 和 Hpms1-5 为辣椒杂交种纯度鉴定的首
选核心引物，利用这 3 个引物进行筛选，97 个品种
（占 97%）能够找到具有杂合带型的鉴定引物，确定
5 个 引 物 Es330、Es363、Epms923、Es120 和 Es64
为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出 14
个品种的特异性引物，可进一步筛选每个辣椒杂交
种的双亲互补型引物。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）