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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
核苷类家族不仅包含多种天然核苷，还包括碱
基或糖基被修饰过的核苷类似物［1］。核苷类似物
的化学结构与天然核苷有着不同程度的相似性，在
细胞代谢中，可与正常核苷形成竞争关系，具有干
扰核酸的合成及抑制相关聚合酶结合的作用，进而
收稿日期 ：2014-03-31
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21176138），国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金项目（J1103506，J1030622，J1310020）
作者简介 ：王玺，女，硕士，研究方向 ：生物转化及生物催化 ；E-mail ：wangxi1822@163.com
通讯作者 ：王洪钟，男，博士，副教授，研究方向 ：生物转化及生物催化 ；E-mail ：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn
自诱导系统在酶促合成 2’-脱氧胞苷中的应用
王玺1  段胜林2  熊舒莉1  郑桂兰1  张贵友1  王洪钟1
（1. 清华大学生命科学学院，北京 100084 ；2. 中国食品发酵工业研究院，北京 100015）
摘 要 ： 旨在高效合成 2’-脱氧胞苷（dCyd）。DCyd 作为一类重要的药物中间体，能够用于合成吉西他滨（dFdC）、扎西他
滨（ddC）等多种抗病毒或抗肿瘤的药物。采用 ZYM-Fe-5052 自诱导培养基对含有 N-脱氧核糖转移酶 II（NDT）的大肠杆菌 BL21
（DE3）进行诱导，所得完整菌体直接用于催化合成 dCyd。结果表明，自诱导系统不仅无需额外添加诱导剂，还能够达到较高的菌
体密度，且与 LB 诱导系统所得菌体在合成 dCyd 方面具有同样高效的催化活性。2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为 1∶3 时，
产物转化率可高达 86.5%。合成 dCyd 的最适反应条件为 ：2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为 1∶1.5，pH6.5 的磷酸缓冲液，
1 mg/mL 的菌体量，终体系 10 mL，30℃条件下反应 1 h，产物转化率可达 71.9%。此方法还可用于制备其他核苷类似物，具有广
泛的适用性和应用前景。
关键词 ： 生物催化 N-脱氧核糖转移酶 2’-脱氧胞苷 自诱导系统 核苷类似物
Application of Auto-induction System in the Synthesis of
2’-deoxycytidine
Wang Xi1 Duan Shenglin2 Xiong Shuli1 Zheng Guilan1 Zhang Guiyou1 Wang Hongzhong1
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084 ；2. China National Research Institute of Food and
Fermentation Industries，Beijing 100015）
Abstract: This experiment was carried out in order to synthesize 2’-deoxycytidine（dCyd）more efficiently. DCyd is a significant
intermediate for many antiviral and anticancer drugs such as Gemcitabine（dFdC）, Dideoxycytidine（ddC）, etc. A convenient and efficient
bioprocess was reported here to synthesize dCyd by E.coli BL21（DE3）containing gene of N-deoxyribosyltransferase Ⅱ（NDT）over-
expressed using ZYM-Fe-5052 auto-induction system. The results showed that auto-induction system could make the addition of inducer during
cultivation unnecessary and obtain a higher cell density. The recombinant cells from auto-induction system were as efficient as that from LB
system on the conversion yields of dCyd. When the ratio of 2’-deoxythymidine（dThd）and cytosine was 1∶3, the conversion yield could
be 86.5%. The substrates ratio of 2’-deoxythymidine (dThd) and cytosine as 1∶1.5 and 1 mg/mL recombinant cells which were dissolved in
phosphate buffer of pH6.5, then cultured at 30℃ for 1 h were selected as the suitable reaction conditions，and the conversion yield could be
71.9%. This method also has potential for the preparation of other nucleoside analogues.
Key words: Biocatalysis N-deoxyribosyltransferase 2’-deoxycytidine Auto-induction system Nucleoside analogues
阻断肿瘤细胞和病毒的复制［2］。大部分的核苷类
似物可以在治疗癌症和病毒感染的疾病中发挥重要
作 用［3-5］。 其 中，2’-脱 氧 胞 苷（2’-deoxycytidine，
dCyd）就是一类重要的药物中间体，能够用于合成
抗癌药物吉西他滨（dFdC）、抗 HIV 病毒药物扎西
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期226
他滨（ddC）及生化试剂脱氧胞苷 -5’-单磷酸（5’-
dCMP）［6］等。目前，制备核苷类似物的方法主要有
化学合成法和生物转化法。传统的化学合成法存在
步骤繁多，反应条件苛刻，产物纯度低、分离困难，
收率不高等缺点［7，8］，故在工业生产中很少使用。
生物转化法主要用到两种酶 ：核苷磷酸化酶和 N-脱
氧核糖转移酶，前者通过 2 步反应可逆地催化核苷
（或脱氧核苷）生成核糖-1-磷酸和碱基，核糖-1-磷
酸再与另一种碱基结合生成新的核苷，但此酶不能
用于催化合成胞嘧啶核苷类化合物［9］；后者主要来
源于大肠杆菌、莱氏乳细菌和瑞士乳杆菌［10］，可通
过一步催化反应高效地合成核苷类似物，反应过程
中无中间体的产生［9］，且底物适用范围更广。
N-脱氧核糖转移酶最先是由 MacNutt 在瑞士乳
杆菌中发现的［11］。随后有研究者利用亲和层析的方
法从瑞士乳杆菌中纯化得到含有两种不同活性的 N-
脱氧核糖转移酶［12］：I 型（PDT），只能催化两种嘌
呤碱基之间的转换反应（Pur ↔ Pur）；II 型（NDT），
不仅可以催化两种嘌呤之间的转换，还能够催化
嘧啶与嘧啶、嘌呤与嘧啶之间的相互转换（Pur ↔
Pur，Pur ↔ Pyr，Pyr ↔ Pyr）［13，14］。N-脱氧核糖转
移酶 II（NDT）的底物识别范围较广，能够用于合
成多种有重要药用价值的核苷类似物［15，16］，但其更
倾向于催化以脱氧嘧啶核苷为底物的反应［17］。已有
文献报道，NDT 基因的开放阅读框由 474 个核苷酸
组成，用于编码 158 个氨基酸［18］。本试验即利用分
子生物学手段构建得到含有 NDT 的原核表达菌，以
脱氧胸苷和胞嘧啶为底物，在重组菌体的催化下高
效合成 2’-脱氧胞苷。
IPTG 是对于 lac 基因簇十分有效的诱导剂，人
们对其的研究已经比较成熟［19］。但由于 IPTG 具
有价格昂贵、细胞毒性大等缺点，在菌种的大规
模培养中不太适用［20］，而乳糖相对廉价且可以代
替 IPTG 诱导乳糖操纵子的表达［21］。本试验即利用
含有乳糖的 ZYM-Fe-5052 自诱导培养基诱导培养构
建得到的重组大肠杆菌 BL21/pET28a-ntd（BN）细
胞，收集得到的全菌体直接用于催化 2’-脱氧胞苷的
合成。此自诱导培养基是由 Studier 在标准 5052 培
养基的基础上改良得到的［22］，其中 0.5% 的甘油、
0.05% 葡萄糖和 100 μmol/L FeCl3 有利于菌体的高密
度培养［23］，而 0.2% 的乳糖可以诱导酶的过量表达。
本试验对比传统 LB 诱导系统与自诱导培养途径获
得的菌体的生物转化活性，并对全菌体催化合成 2’-
脱氧胞苷的反应条件进行优化，旨在为自诱导培养
基的进一步应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 胞嘧啶、胸腺嘧啶、脱氧胸苷和脱氧
胞苷均购自于上海得恩德医药科技有限公司，Ex
Taq DNA 聚合酶、Nde I 和 EcoR I 限制性内切酶均购
自于 TaKaRa 生物技术有限公司，DNA 回收试剂盒
和质粒提取试剂盒购自于北京全式金生物技术有限
公司。
1.1.2 仪 器 Waters 600 series 高 效 液 相 色 谱 仪，
PCR 仪，SDS-PAGE 蛋白电泳系统，DY Ⅲ 20A 型水
平电泳槽，紫外分光光度计，恒温摇床，离心机等。
1.1.3 菌 种 和 质 粒 瑞 士 乳 杆 菌（Lactobacillus
helveticus）购自于中国普通微生物菌种保藏管理中
心，pMD18-T 质粒，克隆菌株大肠杆菌 DH5α 和表
达菌株大肠杆菌 BL21（DE3）均购自于全式金生物
技术公司，pET-28a（+）质粒购自于 Novagen 公司。
1.1.4 培养基
1.1.4.1 MRS 液体培养基 蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，
葡萄糖 0.5%，酵母提取物 0.5%，柠檬酸二铵 0.2%，
乙酸钠 0.5%，吐温 80 0.1%，磷酸氢二钾 0.2%，硫
酸镁 0.02%，硫酸锰 0.005%，碳酸钙 2%。用氢氧
化钠溶液调节 pH 值为 6.8，121℃灭菌 15 min。
1.1.4.2 LB 液体培养基 酵母提取物 0.5%，蛋白胨
1%，氯化钠 1%，121℃灭菌 15 min。
1.1.4.3 ZYM-Fe-5052 自诱导培养基 蛋白胨 1%，
酵 母 提 取 物 0.5%， 甘 油 0.5%，0.2% 乳 糖，0.05%
葡萄糖，25 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NH4Cl，25
mmol/L KH2PO4，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，
100 μmol/L FeCl3，121℃灭菌 15 min。
配制相应的固体培养基时，加入 1.5% 左右的
琼脂后灭菌。
将含有目的基因片段的瑞士乳杆菌在 MRS 培养
基中复苏培养［24］。构建完成的原核表达菌株利用两
种诱导系统进行诱导表达 ：LB 培养基加 IPTG 诱导
2014年第11期 227王玺等：自诱导系统在酶促合成 2’-脱氧胞苷中的应用
剂和 ZYM-Fe-5052 自诱导培养系统。
1.2 方法
1.2.1 表 达 菌 株 的 构 建 将 瑞 士 乳 杆 菌 干 粉 于
MRS 液体培养基中复苏培养 24 h 后，传代进行 2
次培养，以此菌液为模板进行 PCR 来扩增目的片
段。利用 GenBank 中查找得到的瑞士乳杆菌 N-脱
氧 核 糖 转 移 酶 II 基 因（ndt） 的 核 酸 序 列（ 登 录
号 ：NC-010080）， 设 计 一 对 扩 增 引 物 ：ndt（+）：
5-CGCCATATGATGAACAAGAAAAAGAC-3 和 ndt
（-）5-CGGGAATTCTTAATATACAGCTCCG-3，下划
线标注序列分别为 Nde I 和 EcoR I 限制性酶切位点。
PCR 反 应 体 系 中 包 含 10×Ex Taq 缓 冲 液 II 5 μL，
dNTP 5 μL，引物各 0.5 μL，菌液模板 1 μL，Ex Taq
DNA 聚合酶 0.25 μL，补加 ddH2O 至终体积 50 μL。
PCR 反应条件 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，
56℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，30 个循环 ；72℃保
温 10 min，4℃保存。
利用 DNA 胶回收试剂盒对 PCR 产物中的目的
片段进行回收，与 pMD18-T 克隆载体在 16℃条件下
连接 8 h 后，转化进入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，
通过测序及序列比对筛选获得阳性克隆菌株。然后
用 Nde I 和 EcoR I 限制性内切酶分别对 pMD18-T-ndt
和 pET-28a 质粒在 37℃水浴锅中进行双酶切，所需
酶切片段进行 DNA 回收后 16℃条件下连接 8 h，并
转化导入表达菌株 BL21（DE3）中，筛选得到重组
大肠杆菌 BL21-pET28a-ndt（BN）阳性表达菌株。
1.2.2 N-脱 氧 核 糖 转 移 酶 II 基 因 的 表 达 及 SDS-
PAGE 检测 表达菌株 BN 在两种诱导系统中进行
诱导培养，利用分光光度计分别测定两种诱导途径
所产生的菌体密度的增长曲线。用于获得含酶菌体
的两种诱导方法为 ：①将 1 mL 过夜复苏培养的 BN
菌液加入到 50 mL 含有 50 μg/mL 卡那霉素的传统
LB 培养基中，培养至 OD600 为 1.0 左右，加入 0.1
mmol/L 的 IPTG，继续诱导培养 4 h。②将 1 mL 过夜
复苏的 BN 菌液加入到 50 mL 含有 50 μg/mL 卡那霉
素的 ZYM-Fe-5052 自诱导培养基中，培养总时间与
LB 诱导系统相同。诱导结束后，6 000×g 离心 10
min 收菌，用 pH7.0 的磷酸缓冲液冲洗一次，菌体
保存于 -20℃待用。
诱导前及诱导后分别取 1 mL 菌液，用于 SDS-
PAGE 检 测。 取 样 菌 液 在 12 000 r/min 离 心 2 min，
弃上清，沉淀用 30 μL 的无菌水和 10 μL 4× 蛋白
SDS-PAGE 上样缓冲液重悬，并将重悬溶液于沸水
中煮 10 min，12 000 r/min 离心 2 min，取 2.5 μL 上
清用于检测目的蛋白是否成功表达，并以含有空白
pET-28a（+）质粒的 BL21（DE3）表达菌株作为对照。
所用 SDS-PAGE 分离胶浓度为 15%。
1.2.3 N-脱氧核糖转移酶 II 的活性测定 以脱氧胸
苷和胞嘧啶为底物，利用表达 N-脱氧核糖转移酶 II
的完整菌体催化合成脱氧胞苷，通过高效液相色谱
仪（HPLC）检测酶蛋白的催化活性，其反应式如图
1 所示。
O O
2 -˃deoxythymidine 2 -˃deoxythymidine
ON
OH
OH
NH
HN
N NH2
cytosine thymine
NDT
N
N
OH
OH
H2N
O
O
O
O
O
N
H
N
H
图 1 合成 2’-脱氧胞苷的反应式
初 定 的 标 准 反 应 体 系（ 终 体 积 10 mL） 为 ：
30 mmol/L 脱氧胞苷和 45 mmol/L 胞嘧啶（底物比
1∶1.5）溶于 50 mmol/L 的磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，
在 5 mg/mL 完整细胞的催化下，40℃恒温摇床中进
行反应。反应结束后，将反应液于沸水中保温 5 min
以终止酶反应，冷却至室温，然后用超纯水稀释 20
倍，并用 0.45 μm 的滤器过滤上清液，用于 HPLC
的上样检测。
HPLC 检测条件为 ：色谱柱选用 Diamonsil C18
柱，5 μm（φ250×4.6 mm）， 紫 外 检 测 波 长 为 245
nm， 流 动 相 为 15% 的 甲 醇 和 85% 的 水， 流 速 1
mL/min，进样量 10 μL，柱温为 25℃。
HPLC 图谱中目的产物的峰面积和产物的产量
成正比，本试验以此为基础制定了脱氧胞苷的标准
曲线。利用标准曲线及反应结束后目的产物的峰面
积，可以计算得到产物的转化率。转化率（T）的计
算方法为 ：T=（实际脱氧胞苷的产物峰面积 / 理论
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期228
所得脱氧胞苷的产物峰面积）×100%。
1.2.4 酶催化条件的优化 依据 N-脱氧核糖转移酶
II 的酶学性质［25］及考虑其他可能影响产物生成率
的因素，在试验中分别测定了不同菌体量（1、2.5、
5 和 10 mg）、不同反应温度（20℃、30℃、40℃、
50℃和 60℃）对 dCyd 转化率的影响。并且依据已
有文献报道，N-脱氧核糖转移酶 II（NDT）在 pH 接
近 7.0 时催化活性最高［8］，故选择测定了酸碱度在
中性左右的 4 组不同 pH 的磷酸缓冲液（5.8、6.5、
7.0 和 7.8）对催化反应的影响。另外，在可逆反应
中，不同的底物浓度比对目的产物的转化率也会存
在不同程度的影响。本研究选用相对廉价的脱氧胸
苷和胞嘧啶为底物来合成 2’-脱氧胞苷，其中，胞嘧
啶的价格低于脱氧胸苷。考虑经济因素，选择测定
了 5 组不同的底物浓度比（2’-脱氧胸苷∶胞嘧啶为
1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2 和 1∶3）对 dCyd 转化
率的影响。
2 结果
2.1 N-脱氧核糖转移酶II基因的克隆及重组菌株
的构建
本试验以瑞士乳杆菌全菌体为模板通过 PCR 得
到 N-脱氧核糖转移酶 II 的基因片段，目的片段回收
后的电泳条带（图 2-A）显示，其大小在 500 bp 左
右。NDT 基因与 pMD18-T 质粒连接后，转化导入大
肠杆菌 DH5α 中，得到阳性克隆菌株菌落鉴定结果
（图 2-B），经测序后与 GenBank 中查找到的序列对比，
结果表明序列一致。提取质粒，经双酶切后，将目
的片段与 pET-28a（+）质粒相连接，导入表达菌
BL21（DE3）中，获得序列一致的阳性表达菌 BN，
其菌落鉴定结果（图 2-C）表明，已成功构建得到
含有 NDT 的原核表达菌株。
2.2 N-脱氧核糖转移酶II基因的表达及SDS-PAGE
检测
表达菌株 BN 在两种诱导体系中培养相同时间
后，离心收集菌体。菌体总蛋白经 SDS-PAGE 分析
（图 3）表明，两种诱导途径均能成功诱导得到目的
蛋白。由于重组 N-脱氧核糖转移酶 II 的 N 端连接一
段 约 2 kD 的 His 标 签， 故 重 组 酶 蛋 白 的 大 小 在
20 kD 左右，SDS-PAGE 图中目的条带位置与预测的
一致。
750
bp
M 1 M 2 M 3
500
750
bp
500
750
bp
A B C
500
M ：DNA Marker ；1 ：ndt PCR ；2 ：DH5α-pMD18-T-ndt 菌落鉴定 ；
3 ：BL21（DE3）-pET28a-ndt 菌落鉴定
图 2 ndt 的 PCR 扩增及菌落鉴定
100
kD M 1 2 3 4 5 6
70
55
40
35
25
15
10
M ：标准蛋白 ；1，3 ：利用 LB 诱导系统诱导后和诱导前 ；2，4 ：利用自诱
导系统培养与 1 和 3 相同的时间；5，6：含有空白质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）
诱导前和诱导后，作为对照组
图 3 重组 NDT 的 SDS-PAGE 检测
另外，在 OD600 的条件下，菌体密度测定的结
果（图 4）表明，加入 0.1 mmol/L 的 IPTG 之后，菌
体量的增长也会受到抑制。BN 菌株在两种诱导培养
基中诱导 4 h 后，自诱导培养基中的菌体密度明显
高于 LB 诱导系统，在诱导结束后，NDT 酶的总含
量也有相应的提高（图 3）。
0
0
2
O
D
60
0
nm
4
6
8
3 6 ᰦ䰤h9 12 15from LB mediumfrom ZYM-Fe-5052 medium
图 4 两种诱导途径的菌体生长曲线
2014年第11期 229王玺等：自诱导系统在酶促合成 2’-脱氧胞苷中的应用
2.3 N-脱氧核糖转移酶II的活性测定
为计算产物的转化率，测定了 2’-脱氧胞苷标
准样的质量与 HPLC 图谱峰面积之间的关系，制定
了标准曲线（图 5）。为了测定酶是否具有催化活性，
利用标准反应体系在 30℃条件下反应 15 min 后，对
反应样品进行 HPLC 检测，结果（图 6）表明含有
NDT 的完整细胞能够成功催化 2’-脱氧胞苷的合成。
此外，本试验还测定了不同量的菌体对产物生
成率的影响，结果（图 7-A）表明诱导后的重组细
胞具有很高的催化活性，1 mg/mL 的菌体量就足以
快速催化产物的合成，而菌体用量越多，杂酶的含
量也相应增多，从而引发更多的副反应，导致产物
量随着反应时间的延长而下降。对比两种诱导途径
得到的相同的菌体量对产物转化率的影响（图 7-B
和图 7-C），并对各个时间点的两组平行数据进行方
差分析和 T 检验，统计学分析的结果显示两组数据
在 0.05 水平上不具备显著性差异，表明自诱导培养
途径得到的完整菌体与传统培养基诱导得到的菌体
具有同样高效的催化活性。
2.4 合成2 -脱氧胞苷的催化条件的优化
2.4.1 反应温度对产物转化率的影响 试验测定了
不同反应温度对催化合成 2’-脱氧胞苷的影响，反应
1 h 后的结果（图 8-A）表明，在 30℃反应条件下，
产物转化率较高且产物量相对比较稳定。
2.4.2 缓冲液 pH 对产物转化率的影响 不同酸碱
度的缓冲液的影响（图 8-B）表明，构建得到的全
菌体在弱酸性条件下的催化活性较高，即 pH 为 6.5
的条件下能够获得较高的产物转化率。
2.4.3 底物浓度比对产物转化率的影响 测定两种
底物浓度比的影响（图 8-C）表明，两种底物间浓
度比越大，产物的转化率越高，当脱氧胸苷∶胞嘧
啶为 1∶3 时，2’-脱氧胞苷的转化率可高达 86.5%。
3 讨论
本试验通过分子生物学手段构建得到含有 NDT
的重组菌株，用于高效一步反应催化合成 2’-脱氧
胞苷（dCyd）。构建菌株的诱导表达采用了两种不同
的诱导培养系统 ：传统 LB 培养基加 IPTG 和 ZYM-
Fe-5052 自诱导系统，其中自诱导培养基由于含有少
量的甘油及 FeCl3 等成分，有利于获得更高的菌体
密度及目的酶量［22］。同时，α-乳糖作为诱导剂，其
价格和毒性均低于 IPTG。
本研究是首次采用自诱导培养基对含有 NDT 的
重组菌体进行诱导，并用诱导后的完整菌体催化合
成 dCyd。相关结果表明，试验构建的表达菌株能够
高效催化底物转化为目的产物，但产物量会随反应
时间的延长有所降低，原因可能是表达菌株内固有
0.0
0.0
3.0×106
6.0×106
Pe
ak
a
re
aμV*s 9.0×1061.2×1071.5×107
0.2 0.4 0.6
dCydmg/mL 0.8 1.0 1.2
图 5 2’-脱氧胞苷（dCyd）的标准曲线
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Retention timemin2.0 4.0 6.0 8.0 10.0Retention timeminThymineCytosine0.8
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
B
A
0.6
0.4
A
bs
AUAbsAU
0.2
0.0
dThd
Thymine
Cytosine
dThd
dCyd
A ：构建表达菌在 30℃条件下催化反应 15 min ；B ：利用含空白质粒的菌体
在同样条件下催化反应，作为对照。其中，dCyd 表示 2’-脱氧胞苷，dThd
表示 2’-脱氧胸苷
图 6 表明 NDT 催化活性的具有代表性的 HPLC 图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期230
的转氨酶催化目的产物发生了分解反应，且转氨酶
在 60℃条件下的活性较高，但在 30℃条件下其活性
可以被有效抑制［26］。降低表达菌株中固有酶对催化
反应的影响，是很值得后续研究的方面，以便于在
核苷类似物的工业化生产过程中获得稳定的产物量。
试验测定了不同反应条件对产物转化率的影响，
结果表明重组酶具有很高的催化活性，能够在短时
间内达到较高产率。综合考虑经济因素和产物转化
率，认为脱氧胸苷∶胞嘧啶为 1∶1.5 时为较适宜的
底物浓度比。此浓度比与 1∶1 相比，底物中增加了
15 mmol/L 的胞嘧啶，但底物仍能够很好的溶解，而
且胞嘧啶价格低于胸腺嘧啶，此浓度比与 1.5∶1 条
80A
60
40
20
0
0 1 2 3ᰦ䰤hdCyd% 4
from LB medium
from ZYM-Fe-5052 medium
5 6
80B
60
40
20
0 ᰦ䰤hdCyd%
80C
60
40
20
0
0.25 0.5 1ᰦ䰤hdCyd% 3 6
0.25 0.5 1 3 6
from LB medium
from ZYM-Fe-5052 medium
1.0 mg/mL
5.0 mg/mL
2.5 mg/mL
10.0 mg/mL
A ：不同菌体量对产物转化率的影响 ；B，C ：分别对比两种培养途径获得的
1 mg/mL 和 5 mg/mL 的菌体量的催化活性，对同一时间点的两组数据进行方
差分析和 t 检验，P 值均 >0.05，表明两组数据无显著性差异
图 7 不同菌量及两种诱导途径对产物转化率的影响
A
B
C
5.5
30
40
dC
yd
% 50607030 20 30 40 50 60⑙ᓖć40dCyd
% 506070
0
45:30 30:30 30:45 30:60 30:90
2’-㝡≗㜎㤧㜎౗஦∄⦷20dCyd% 406080100
7.5 8.07.06.0
pH
6.5
A ：不同反应温度的影响 ；B ：不同缓冲液 pH 的影响 ；
C ：不同底物浓度比的影响
图 8 不同反应条件对产物转化率的影响
2014年第11期 231王玺等：自诱导系统在酶促合成 2’-脱氧胞苷中的应用
件下的产物生成率相当 ；而与 1∶2 相比，第 2 次增
加 15 mmol/L 的胞嘧啶对产物转化率的提升相对较
小 ；当浓度比为 1∶3 时，胞嘧啶不能较好地溶解，
底物浪费程度高。依据结果，合成 2’-脱氧胞苷适宜
的反应条件为 ：30 mmol/L 的脱氧胸苷和 45 mmol/L
的胞嘧啶，溶解于 pH6.5 的磷酸缓冲液中，加入 1
mg/mL BN 完整细胞在 30℃条件下反应 1 h，产物转
化率可达 71.9%。
到目前为止，自诱导培养基在酶蛋白的过量表
达方面使用较少，所以本研究可以为自诱导培养基
的广泛应用提供研究基础。此方法的优点在于无需
在培养过程中额外添加诱导剂，简化了诱导培养的
过程，减少了污染的可能性 ；乳糖作为诱导剂，其
价格和毒性都低于 IPTG ；使用全菌体进行反应，省
去了蛋白纯化的过程 ；自诱导培养系统还能够获得
更高的菌体密度及目的蛋白量，且此方法获得的全
菌体与传统诱导途径得到菌体的催化活性同样高效，
故更适宜应用于核苷类似物的大规模生产过程。本
试验还利用重组 BN 完整细胞成功催化 5-杂氮-2’-脱
氧胞苷的合成，表明此重组细胞及诱导方法适用于
多种核苷类似物的合成，因此具有很大的应用价值
及前景。
4 结论
本研究构建含有 NDT 酶的全菌体用于高效催化
合成 2’-脱氧胞苷。试验采用的自诱导方法操作简
便，无需额外添加诱导剂；与传统 LB 诱导方法相比，
在培养相同时间后，能够获得更高的菌体量及目的
蛋白量，并且相同菌体量的催化能力相似，为自诱
导培养基的进一步应用提供了研究基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）