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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
家蝇（Musca domestica）是世界性分布的蝇种，
属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科，是我国大
部分地区最常见、数量最多的一种媒介昆虫。其从
幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境里，表现出极
强的适应恶劣生存环境的能力，以机械性传播和生
物性传播两种方式在人类和其它动物之间传播多种
疾病，如痢疾、伤寒、霍乱等，但是家蝇自身鲜见
收稿日期 ： 2014-01-08
基金项目 ：国家科技支撑计划（2011BAC06B12），国家自然科学基金项目（81360254），贵州省科学技术基金项目（黔科合 J 字 [2012]2038 号）
作者简介 ：魏川川，男，硕士研究生，研究方向 ：昆虫分子免疫学研究 ；E-mail ：752308241@qq.com
通讯作者 ：吴建伟，男，教授，博士生导师，研究方向 ：昆虫分子免疫学研究 ；E-mail ：wjw@gmc.edu.cn
家蝇变应原 Tropomyosin 基因的克隆、序列分析及
诱导表达
魏川川  修江帆  王宇  国果  彭传林  吴沁怡  吴建伟
（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）
摘 要 ： 对家蝇变应原原肌球蛋白（Tropomyosin）基因进行同源克隆，序列分析 ；构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。
从家蝇幼虫 cDNA 文库中筛选获得 Tropomyosin 基因。以该基因的 cDNA 文库质粒为模板，进行 PCR 扩增，获得家蝇 Tropomyosin
完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚
细胞定位等方面进行预测和分析。构建 pEASY-E1-Tropomyosin 重组质粒，转化到大肠杆菌 OrigamiB（DE3）中进行诱导表达。
Tropomyosin 基因 ORF 全长 828 bp，编码 275 个氨基酸，理论分子量 31.6 kD ；等电点为 4.65，具有 Tropomyosin 家族的蛋白保守结
构域。成功构建重组原核表达 pEASY-E1-Tropomyosin 并诱导表达重组蛋白。
关键词 ： 家蝇 Tropomyosin 克隆 生物信息学 变应原
Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Musca
domestica Allergen Tropomyosin Gene
Wei Chuanchuan Xiu Jiangfan Wang Yu Guo Guo Peng Chuanlin Wu Qinyi Wu Jianwei
（Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）
Abstract:  It was to probe into the homologous cloning of the Musca domestica allergen Tropomyosin gene, and then construct the
prokaryotic expression vector which was expressed in Escherichia coli. Screening and isolation of Musca domestica Tropomyosin gene from Musca
domestica cDNA library was carried out. The gene and encoded protein sequence of Tropomyosin was analyzed by bioinformatics methods ,
including general physical and chemical properties, signal peptide, secondary structure, tertiary structure, epitope and subcellular localization.
Then plasmid pEASY-E1-Tropomysin were transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells for expression. The open reading frames
of the Tropomyosin gene was 828 bp that encded a putative protein with 275 amino acids. The protein, with predicted molecular weight 31.6 kD
and pI of 4.65, has the conserved Tropomyosin domain so belongs to Tropomyosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic
expression vector pEASY-E1-Tropomysin was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli.
Key words:  Musca domestic Tropomyosin Cloning Bioinformatics Allergen
被病原物感染的情况［1］，即使在高密度人工饲养的
条件下也不会因大规模感染而死亡，说明家蝇有其
独特的免疫防御机制，比生活环境单一化的昆虫更
有效地抵御病原菌的感染［2］。
原肌球蛋白（Tropomyosin）是肌肉收缩过程中
重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中，
在许多无脊椎动物中都被鉴定为一种重要的过敏原，
2014年第8期 109魏川川等 ：家蝇变应原 Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达
它能引起过敏性疾病。研究表明，家蚕［3］、疥螨［4］、
甲壳类动物［5］和蟑螂［6，7］体内普遍存在原肌球蛋白，
是一种过敏原。然而，蟑螂［8］和家蝇的粪及其肢体
碎屑同样具有致敏性。斑马鱼原肌球蛋白基因，经
免疫学鉴定发现其具有过敏原性［9］。
由于蟑螂重组变应原较天然蟑螂变应原更容易
标准化，制备方便，Santos 等［10］已经将重组的蟑螂
蛋白应用于蟑螂的过敏诊断，并取得良好效果。研
究表明，以重组变应原用于免疫治疗，可以显著降
低患者的 IgE 结合能力，具有良好的治疗功效［11］。
研究证实，重组过敏原可以达到甚至超过对应的抽
提制备过敏原与人 IgE 结合的能力。在支气管霉菌
性过敏症血清学诊断中，使用重组过敏原已经证实
优于天然过敏原［12］。
本课题组在前期采用菌落活性染色法［13］，构
建家蝇三龄幼虫热胁迫状态下的 cDNA 文库［14］，并
从中筛选到一条 Tropomyosin 基因，经序列分析及
BLAST 比对，提示该基因为原肌球蛋白家族。本研
究克隆出家蝇的 Tropomyosin 基因，并且在大肠杆菌
中表达及进行生物信息学分析，旨在为进一步研究
其免疫学功能及临床上脱敏治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 家蝇三龄幼虫为本实验室饲养，
幼虫均重 26.5 mg，饲养温度 28℃，相对湿度 65%，
光照周期 10N∶14D。
1.1.2 主 要 试 剂 总 RNA 提 取 试 剂 盒（RNAiso
PLUS）、逆转录试剂盒、Taq DNA 聚合酶、DNA 标
志物（DL2 000 DNA Marker）、pMD18-T 质粒、琼脂
糖等购置于 TaKaRa 公司 ；pEASY-E1 质粒购置于北
京全式金生物公司，大肠杆菌 BL21（DE3）由中山
大学病原生物学实验室馈赠，其余试剂购置于上海
生工生物公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 合成 总 RNA 的抽提
按照 TaKaRa 公司的 RNAiso PLUS 说明书进行操作。
总 RNA 经电泳检测，GeneQuant 公司核酸定量分析
仪测定 A260/A280 比值及浓度，选取 A260/A280 的比值
范围为 1.95-2.00 的样本，以 1 μg 总 RNA 为模板，
按照 cDNA 合成试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。
1.2.2 Tropomyosin 基 因 全 长 cDNA 的 获 得 从
课题组前期构建的家蝇三龄幼虫热胁迫 cDNA 文
库［15-18］ 中 筛 选 到 克 隆（002C03） 进 行 测 序， 获
得 Tropomysin 的 完 整 ORF 序 列， 运 用 Primer
Premier 5.0 设计特异性引物。上游引物（Trop-F）：
5-ATGAAAATCGACAAGGATGCGGCC-3，下游引物
（Trop-R）：5-TTATTCCTTGAGGATGAGCTCGACG-3；
进 行 PCR 扩 增。 将 其 PCR 产 物 纯 化 后 亚 克 隆 入
pMD18-T 载体，阳性克隆送上海生工生物公司测序
鉴定。
1.2.3 Tropomyosin 基 因 的 生 物 信 息 学 分 析 通 过
NCBI 网站（http ：//www.ncbi.blastX）对处于不同进
化地位的其它物种 Tropomyosin 的同源蛋白序列进
行序列比对，分析该基因蛋白的氨基酸序列与其他
蛋白质氨基酸序列的相似性 ；用 DNAclub 软件分析
cDNA 序列和开放阅读框 ；运用 Signal P 分析信号肽
序列 ；运用 EMBL-EBI 的在线分析工具 InterProScan
4 分析蛋白保守结构域及活性位点 ；利用蛋白分析
专 家 系 统（Expert Protein Analysis System，ExPASy）
的 在 线 分 析 软 件 Protparam， 分 析 预 测 蛋 白 质 的
氨基酸残基性质、分子量及理论等电点等 ；利用
PREDICTPROTEIN 在线分析软件预测蛋白质中包含
的结构域和氨基酸功能位点 ；利用 SWISS MODEL
在线预测网站预测蛋白质的三级结构。利用 PSORT
Ⅱ在线分析网站分析蛋白质在细胞内的定位 ；通过
IEDB Analysis Recource 分析蛋白抗原表位。
1.2.4 家蝇 Tropomyosin 重组蛋白表达
1.2.4.1 pEASY-E1-Tropomyosin 重组质粒的构建 以
家蝇 pMD18-T-Tropomyosin 质粒为模板，进行 PCR
扩增，胶回收 PCR 产物。将纯化产物与 pEASY-E1
载体 25℃连接 10 min，并转化至感受态大肠杆菌
Trans1-T1，挑取阳性克隆，放入含苄青霉素（50
mg/mL）的 LB 液体培养基中培养过夜，提取质粒选
用载体 T7 启动子上游引物（T7F）、T7 终止子下游
引物（T7R）及 Trop-F、Trop-R 进行 PCR 及测序鉴定。
将阳性质粒转化至感受态大肠杆菌 BL21（DE3）中，
挑取阳性克隆，进行 PCR 鉴定，试验中所需的各引
物序列见表 1。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期110
表 1 引物名称及序列
引物名称 引物序列（5-3）
Trop-F ATGAAAATCGACAAGGATGCGGCC
Trop-R TTATTCCTTGAGGATGAGCTCGACG
T7F TTAATACGACTCACTATAGGGG
T7R TAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAG
　　
1.2.4.2 pEASY-E1-Tropomyosin 重 组 蛋 白 的 表 达 及
鉴定 取过夜培养的菌液 60 μL，加入含有氨苄青霉
素的 LB 液体培养基中，37℃、250 r/min 震摇约 5 h
至 OD600=0.6，加入 IPTG 诱导表达，取过夜诱导表
达菌液，SDS-PAGE 电泳检测。
2 结果
2.1 家蝇Tropomyosin全长cDNA的获取
以家蝇三龄幼虫 cDNA 为模板，使用特异性引
物进行 RT-PCR 扩增，所得产物经 1.5% 琼脂糖电泳
鉴定，可见 828 bp 左右条带（图 1）；经测序鉴定，
证实获得家蝇 Tropomyosin 全长 cDNA，该序列已上
传至 GenBank（登录号 ：KF974800）。
86.73，总亲水性平均系数 GRAVY-0.998，蛋白质总
体疏水性系数高。
信号肽预测结果表明该蛋白不含信号肽，属于
非分泌型蛋白。跨膜结构预测显示 Tropomyosin 蛋
白 没 有 跨 膜 区，PREDICTPROTEIN sec 预 测 组 成
Tropomyosin 多肽链的二级结构有 2 种类型，α 螺旋
（H）和无规则卷曲（L）的比例为 98.55∶1.45，α
螺旋占绝大多数。通过 Swiss-model 预测 Tropomyosin
蛋白的三级结构，结果（图 3）显示，其结构为线性，
主要由 α-螺旋构成与二级结构预测所得结果能较好
地吻合。保守结构域分析显示，家蝇 Tropomyosin 蛋
白 中 含 有 Tropomyosin 的 功 能 域（1-272 aa），5 个
保守位点分别位于 74-91 aa，110-130 aa，135-163
aa，165-188 aa，221-246 aa ；活 性 位 点 位 于 222-
230 aa，属于 Tropomyosin 家族。
亚细胞定位分析结果显示，其分布在细胞核的
可能性为 73.9%，分布在细胞骨架的可能性为 17.4%
分布在细胞质的可能性为 4.3%，分布在线粒体的可
能性为 4.3%。
根据蛋白质抗原表位在线分析工具预测其主
要线性抗原决定簇的位置分别是 8-9 aa，14-35 aa，
41-42 aa，44-51 aa，61-74 aa，89-98 aa，101-115
aa，125-133 aa，147-154aa，166-178 aa，199-213
aa，223-231 aa，244-245 aa，257-264 aa。
750
1000
2000
bp
1 2M 3 4 5 6 7
500
250
100
M：DL 2000 DNA Marker；1：cDNA 模板阳性对照（特异引物）；2：菌液 PCR（特
异引物）；3 ：T7F 和 Trop-R（重组质粒）；4 ：Trop-F 和 T7R（重组质粒）；5 ：
T7F 和 T7R（重组质粒）；6 ：pEASY-E1-Tropomysin 重组质粒 ；7 ：菌液阴性
对照（特异引物、以空载菌液作模板）
图 1 cDNA 模板及重组质粒 PCR 鉴定
2.2 家蝇Tropomyosin基因的生物信息学分析
家蝇 Tropomyosin 基因编码区长度为 828 bp，编
码 275 个氨基酸（图 2）。预测蛋白的理论分子量
为 31.599 kD，等电点为 4.65。在哺乳细胞体内表达
的半衰期为 30 h ；在酵母和大肠杆菌中体内表达的
半衰期分别大于 20 h 和 10 h。在溶液中的不稳定指
数为 39.06，预测在溶液中性质稳定。脂肪族指数
781
721
661
601
541
481
421
361
301
241
181
121
61
1
图 2 Tropomyosin 基因开放阅读框 cDNA 序列及对应编码
的氨基酸序列
2014年第8期 111魏川川等 ：家蝇变应原 Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达
2.3 家蝇Tropomyosin重组质粒构建及蛋白表达
2.3.1 家蝇 pEASY-E1-Tropomysin 重组质粒的构建
及鉴定 选用组合引物 ：Trop-F 和 Trop-R，T7F 和
Trop-R，Trop-F 和 T7R，T7F 和 T7R 进 行 菌 液 PCR
鉴定重组质粒 pEASY-E1-Tropomysin ；提取重组质粒
进行测序鉴定，与预期结果一致，确定插入片段连
接方向正确。所构建的重组质粒的表达产物带有 6
个 His 标签，方便蛋白的纯化。
2.3.2 家蝇 Tropomyosin 重组蛋白表达 将鉴定为阳
性的重组表达质粒导入到表达菌株 BL21（DE3）中，
经终浓度为 2 mmol/L 的 IPTG 诱导 5 h 获得重组蛋白。
SDS-PAGE 电泳分析（图 4）显示，在约 35 kD 处有
外源蛋白表达条带出现（pEASY-E1 载体 His 标签及
部分载体蛋白大小约为 3.2 kD），与预期分子量一致。
而未经诱导菌株与空载体阴性对照菌在此位置确缺
少该条带，表明目的蛋白重组表达成功。
（如麦蛾、灯蛾）、蝶类、蟑螂等较多见。这些昆虫
的肢体碎屑，鳞毛、排泄物、蜕皮、虫卵以及昆虫
自身散发的特殊气味，均可成为吸入性致敏原，通
过空气吸入而引起呼吸道过敏，亦有少数由昆虫叮
咬、螯刺而引起严重的过敏休克。为了解除昆虫类
致敏原对人类健康的危害，在临床上通常将致敏昆
虫通过处理制作成为抗原，对过敏病人进行皮试，
以查找过敏原。此法是变态反应临床工作开展特异
性诊断、治疗的手段。故昆虫变应原疫苗的制备质
量对于患者的临床诊断和脱敏治疗有着十分重要的
意义［19］。
原肌球蛋白在许多无脊椎动物中被鉴定为一种
重要的过敏原，例如屋尘螨，蟑螂［20］，鱿鱼，蜗
牛和牡蛎［21］，并且相互之间有交叉反应［22］。然而，
脊椎动物的原肌球蛋白虽然与无脊椎动物的原肌球
蛋白有较高的同源性，却不引起过敏。
大肠埃希菌原核表达系统由于其遗传背景清楚、
转化及表达效率高、成本低廉，被广泛地用于异源
蛋 白 的 表 达。 本 研 究 选 用 的 pEASY-E1 expression
vector 由 pET 载体改造而成，利用 5 min 快速 TA 克
隆技术克隆 PCR 产物，无需酶切，无需纯化，直接
克隆，提供氨苄青霉素筛选标记 ；利用 T7lac 启动
子严谨调控、高效表达目的基因 ；其 N 端含有 6-His
蛋白纯化标签，便于采用镍离子金属螯合剂亲和层
析柱［23］进行重组蛋白纯化。
本研究成功克隆出家蝇原肌球蛋白基因的全序
列，约为 828bp，编码 275 个氨基酸，序列已上传至
GenBank（登录号 ：KF974800.1），家蝇 Tropomyosin
蛋白中含有 Tropomyosin 的功能域（1-272 aa），5 个
保守位点分别位于 74-91 aa，110-130 aa，135-163
aa，165-188 aa，221-246 aa ；活 性 位 点 位 于 222-
230 aa，属于 Tropomyosin 家族。蛋白质抗原表位分
析 Tropomyosin 具有较强的抗原性，根据潜在的抗
原表位，可以获得低致敏变应原，从而降低重组蛋
白的致敏性，减弱脱敏治疗过程中可能诱发的过敏
反应 。
此外，成功构建家蝇 Tropomyosin 的高效原核表
达载体，得到相对分子质量为 35 kD 的重组原肌球
蛋白，并进行相关的生物信息学分析。这将为后续
家蝇原肌球蛋白的免疫学功能研究，以及由家蝇引
图 3 Tropomyosin 蛋白的三级结构预测
44.3
66.4
97.2
bp
1 2M 3 4 5
29.0
20.1
14.3
M ：蛋白 Marker ；1 ：空载未诱导 ；2 ：空载诱导 ；3 ：重组未诱导 ；4 ：重组
诱导 ；5 ：BL21 诱导
图 4 Tropomyosin 重组蛋白的诱导表达
3 讨论
自自然界中引起人们致敏的昆虫有蝇类、蛾类
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期112
起的变态性反应疾病的特异性诊断和治疗打下坚实
的基础。。
4 结论
本研究克隆出家蝇原肌球蛋白基因的全序列，
约为 828 bp。成功构建家蝇 Tropomyosin 的高效原核
表达载体，得到相对分子质量为 35 kD 的重组原肌
球蛋白，并进行相关的生物信息学分析。
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（责任编辑 李楠）