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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
抗坏血酸（ascorbaic acid，AsA）是一种广泛存
在于生物体内的高丰度的小分子抗氧化物质，也是
植物体自身代谢过程中必不可少的化合物。在植物
的生长发育中抗坏血酸发挥着重要作用，如清除活
性氧对植株的伤害、参与光合反应及响应胁迫等。
抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AO，EC-
1.10.3.3）属于多铜氧化酶的一个小的多基因家族，是
一个同型二聚体铜蛋白定位于细胞壁的离子结合性
蛋白［1］，其将抗坏血酸（AsA）氧化为单脱氢抗坏
血 酸（monodehydroascorbate acid，MDHA），MDHA
收稿日期 ：2013-02-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260039），农业部转基因专项（2009ZX08005-027B），兵团种质资源创新专项（2012BB050）
作者简介 ： 冉茂飞，男，硕士研究生，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：1069585529@qq.com
通讯作者 ： 李鸿彬，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：lihb@shzu.edu.cn
棉花 GhAO3 基因的克隆、功能序列分析及原核表达
冉茂飞1  贺怡1  钱雯婕1  王斐1  李鸿彬1，2
（1. 石河子大学生命科学学院，石河子 832000 ；2. 石河子大学农业技术重点实验室，石河子 832000）
摘 要 ： 通过 RT-PCR 方法从处于快速伸长发育时期（开花后 15 d）的棉花纤维组织中克隆得到棉花抗坏血酸氧化酶 3
（Ascorbate oxidase 3，GhAO3）基因的全长开放读码框，该基因全长读码框为 1 758 bp，编码包含 585 个氨基酸的蛋白质。通过序列
功能分析和同源序列比对，GhAO3 蛋白具有较高的保守性，包括 3 个多铜氧化酶结构域以及跨膜信号序列，进化树比对结果显示
GhAO3 与大豆 GmAO 的亲缘关系较近。将 GhAO3 基因与原核表达载体 pET32a 相连构建重组载体 pET32a-GhAO3，把重组载体转
入大肠杆菌 BL21（DE3）中，用 IPTG 诱导重组菌，经 SDS-PAGE 电泳分析，获得分子量约为 64 kD 的重组 GhAO3 蛋白。
关键词 ： 棉花抗坏血酸氧化酶 基因克隆 功能序列分析 原核表达
Cloning，Functional Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of
Cotton GhAO3 cDNA
Ran Maofei1 He Yi1 Qian Wenjie1 Wang Fei1 Li Hongbin1，2
（1. College of Life Science of Shihezi University，Shihezi 832000 ；2. Key Laboratory of Agrobiotechnology of
Shihezi University，Shihezi 832000）
Abstract:  A cotton ascorbate oxidase（GhAO3）full-length open reading frame（ORF）cDNA was cloned from elongating fiber tissue
（15 DPA）by RT-PCR method, GhAO3 ORF contains 1 758 bp nucleotides and codes a protein of 585 amino acids. Through sequence function
analysis and homology sequence alignment, GhAO3 protein includes three multi-copper oxidase domain and transmembrane signal sequence
with a high conservation. Phylogenetic tree analysis showed that GhAO3 has a similar relationship with GmAO protein. Prokaryotic expression
vector pET32a-GhAO3 was constructed and transformated into E. coli BL21（DE3）. Recombinant GhAO3 protein was obtained after induction
by IPTG and SDS-PAGE analysis with a MW of 64 kD, and had a higher enzymatic activity.
Key words:  Cotton ascorbate oxidase Gene cloning Functional sequence analysis Prokaryotic expression
不稳定，可以转变为脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate
acid，DHA），从而调节植物质外体抗坏血酸库的氧
化还原态进一步调控植物生长发育［2］。目前，该基
因已经在黄瓜、苜蓿、水稻及烟草等经济作物中相
继获得，其对细胞伸长及能够促进细胞膨大和分裂
的功能也逐渐被发现［3-5］。
棉花纤维是一个无分支的长单细胞，其细胞的
长度和纤维的强度韧性决定着棉花的品质［6］，许多
研究表明 ：抗坏血酸氧化酶由于其独特的定位与作
用，与细胞的分裂、伸长发育等过程密切相关。本
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期52
研究从棉花纤维组织中克隆得到 GhAO3 基因，对该
基因编码的蛋白质结构和序列进行功能分析并预测
该基因可能的功能，进一步构建原核表达载体，获
得重组 GhAO3 蛋白并进行酶活力分析，旨在为深入
研究 GhAO3 的功能及其参与棉花纤维发育过程的作
用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
陆地棉徐 -142 品种为本实验保存。凝胶回收试
剂盒、质粒提取试剂盒、Taq DNA 酶购自 TIANGEN
公司，RNA 反转录试剂盒、限制性内切酶 Sma I、
Xba I，T4 DNA ligase 购自 TaKaRa 公司，Trizol 购自
Invitrogen 公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 棉花纤维总 RNA 的提取 所用研钵均经过
DEPC 水处理且经过 121℃高温高压灭菌及高温烘
烤 4 h，其他器皿均用 DEPC 水处理并高压［7］；棉花
RNA 的提取采用改良的 CTAB 法［8］，提取棉花开花
后 15 d 纤维组织中的 RNA。
1.2.2 GhAO3 基因的克隆 将所提取的 RNA 反转录
成 cDNA，利用设计的特异性引物，选择 BamH I 和
Hind III 为酶切位点（下划线所示），以反转录产物
为模板进行 PCR 扩增克隆棉花 GhAO3 的基因全长
ORF。
上游 ：5-CGGGATCCATGATCTTTAGCAATATG-
GT-3 ；下 游 ：5-CCCAAGCTTGCCTGTAAAGACCT-
TGA-G-3。
PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，
72℃ 1 min 40 s ；72℃ 10 min，4℃存放。
1.2.3 序列结构域分析及蛋白质序列比对 通过
www.expasy.org 网站及 NCBI 网站的在线蛋白质序列
分析程序和 DNAMAN 软件完成序列的结构分析，用
MEGA 软件进行蛋白质序列比对。
1.2.4 pET32a-GhAO3 原核表达载体的构建 将 PCR
克隆到的 GhAO3 目的片段的回收产物与 pGM19T 载
体连接，16℃过夜。转化大肠杆菌 E.coli 感受态细胞，
挑取单克隆菌斑摇菌进行菌液 PCR 鉴定并提质粒双
酶切鉴定，鉴定正确的送华大基因测序。选择构建
正确的 pGM19T-GhAO3 与原核载体 pET32a 同时用
BamH I 和 Hind III 进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后
选择回收大小片段进行连接，16℃过夜。
1.2.5 重组 pET32a-GhAO3 蛋白的诱导表达和 SDS-
PAGE 分析 将构建好的原核表达载体用热激法转
入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，37℃培养
12-16 h。挑单克隆酶切鉴定后选择正确的单克隆活
化扩大培养，摇菌至 OD600=0.4-0.6，加入 IPTG 诱
导至终浓度 0.5 mol/L，收集 0、3 和 6 h 的菌液各 10
mL，4 ℃，5 000 r/min，10 min 离 心 收 集 菌 体， 加
入 1 mL 0.01 mol/L 冰 PBS 磷酸缓冲溶液悬浮菌液 10
min 后 加 入 1 mL 的 5×SDS-PAGE 混 匀， 沸 水 浴 5
min，12 000 r/min 离心 2 min，分别取上清、沉淀及
混合以 20 μL 分装进行 SDS-PAGE 电泳。
1.2.6 抗坏血酸氧化酶的酶活力测定 将 50 μg 蛋白
加入到 2 mL 反应缓冲液中（含 50 mmol/L Tris-HCl，
0.2 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L 抗 坏 血 酸，pH7.5），
利用紫外分光光度计测定反应液在 256 nm 下吸光度
的变化，以每分钟每毫克蛋白催化 1 μmol AsA 定义
为 1 个酶活力单位（μmol/min/mg protein）。
2 结果
2.1 棉花GhAO3基因克隆
用改良的 CTAB 法提取棉花纤维快速伸长发育
时期组织（开花后 15 d）的总 RNA，经电泳后呈现
3 个条带（图 1-A），表明提取的 RNA 质量较好，可
以进一步用于反转录 cDNA 及后续试验。以 cDNA
为模板进行 PCR 扩增出特异性条带（图 1-B，箭
头所示），经测序正确后获得棉花 GhAO3 基因全长
ORF 为 1 758 bp，编码 585 个氨基酸的蛋白质。
28S
1
A B
2 M 3
18S
2000
bp
5S
A. 棉花纤维组织总 RNA 提取 ；1，2 ：纤维组织 RNA 电泳条带 ；B. GhAO3
基因的 PCR 扩增 ；M ：DNA marker Ⅲ ；3 ：PCR 扩增条带 .
图 1 GhAO3 基因的克隆
2013年第8期 53冉茂飞等 ：棉花 GhAO3 基因的克隆、功能序列分析及原核表达
2.2 序列比对与进化树构建
将 GhAO3 的氨基酸序列与下列物种的 AO 基因
氨基酸序列进行比对：大豆（GmAO）、烟草（NtAO）、
粳稻（JrAO）、琴杆菌（LsAO）、羊草（LcAO）、拟
南芥（AtAO）、甜瓜（CoAO1）、南瓜（CmAO）等。
棉花 GhAO3 氨基酸序列比对结果显示，抗坏血酸氧
化酶家族基因序列保守性较高，具有典型的保守结
构域。图 2 中黑色部分为高度保守结构域，灰色部
分为一般保守序列。进化树分析（图 3）显示棉花
GhAO3 与大豆 GmAO 在进化上亲缘关系较近。
2.3 GhAO3功能序列分析
保守结构域分析表明，棉花 GhAO3 氨基酸序
列中存在 3 种不同属细胞色素 C 氧化酶亚基 II 中的
周质域的多铜氧化酶结合位点 ：在氨基酸残基 176-
336 处存在多铜氧化酶信号 1，在氨基酸残基 399-
565 处存在多铜氧化酶信号 2，在氨基酸残基 44-
161 处存在多铜氧化酶信号 3 ；GhAO3 的 C 末端还
存在抗坏血酸氧化酶的保守域核心氨基酸。疏水性
分析表明棉花 GhAO3 蛋白是一个跨膜蛋白，在第 1-
第 33 个氨基酸残基处存在跨膜区，跨膜螺旋存在于
图 2 棉花 GhAO3 的氨基酸序列比对
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
20 40 60 80 100
220200180160140120
240 260 280 300 320
440420400380360
460
580 600
480 500 520 540 560
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
GmAO :
TAO :
GhAO3 :
JrAO :
LsAO :
AtAO :
LcAO :
CmAO1 :
CAO :
: 107
: 107
: 11
: 97
: 92
: 109
: 92
: 111
: 105
: 215
: 216
: 222
: 209
: 204
: 221
: 204
: 223
: 217
: 317
: 318
: 325
: 313
: 308
: 326
: 315
: 326
: 320
: 428
: 429
: 436
: 423
: 417
: 435
: 424
: 436
: 429
: 535
: 536
: 543
: 533
: 524
: 542
: 531
: 543
: 535
: 577
: 578
: 585
: 574
: 570
: 588
: 577
: 591
: 579
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期54
图 3 GhAO3 的进化树分析
2000
bp
A M 1
2000
B
bp
M 102 3 4 5 6 7 8 9
M ：DNA marker Ⅲ ；1-7 ：PCR 产物 ；8 ：阳性对照 . ；9 ：阴性对照 ；10 ：重组子双酶切结果
图 5 pET32a-GhAO3 原核表达载体构建（A）及双酶切鉴定（B）
0.1
63
100
100
100
100
100 LsAo
LcAO
CoAO1
CmAO
JrAO
NtAO
GmAO
GhAO3
AtAO
ཊ䬌≗ॆ䞦࣏㜭ฏ3˗ ཊ䬌≗ॆ䞦࣏㜭ฏ1˗ ཊ䬌≗ॆ䞦࣏㜭ฏ2˗
䐘㟌ؑਧNㄟᒿࡇ˗ 䐘㟌ؑਧCㄟᒿࡇ˗ 䞦ۜॆս⛩˗ ᣇൿ㹰䞨≗ॆ䞦ս⛩
图 4 GhAO3 蛋白功能序列分析
第 19 个与第 29 个氨基酸残基之间，1-18 为跨膜信
号的 N 端，30-33 为跨膜信号的 C 端。同时对氨基
酸功能分析表明其存在多个酶催化位点（图 4）。
2.4 pET32a-GhAO3原核表达载体的构建
将测序正确的 pGM19T-GhAO3 质粒与 pET32a
载体质粒同时用 BamH I 和 Hind III 进行双酶切，回
收目的基因片段和载体大片段，连接产物转化 E.coli
DH5α 感受态细胞，挑单克隆进行菌液 PCR 鉴定（图
5-A），并提质粒进行双酶切鉴定（图 5-B），成功构
建 pET32a-GhAO3 原核表达载体。
2.5 重组GhAO3蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
将构建成功的 pET32a-GhAO3 重组子转入大肠
杆菌表达菌株 BL21（DE3）中，经 PCR 筛选鉴定
后，进行扩大培养并利用 IPTG 诱导菌体表达，提取
蛋白质后进行 SDS-PAGE 电泳分析，获得了大小约
为 64 kD 的重组 GhAO3 蛋白（图 6-A，箭头所示）。
通过对重组 GhAO3 蛋白的酶活力分析，诱导的重
组 GhAO3 蛋白具有较高的将还原型抗坏血酸（AsA）
氧化的能力，重组蛋白的抗坏血酸氧化酶（AO）的
酶活力在诱导 3 h 后有了显著的升高并趋于稳定（图
6-B）。
3 讨论
抗坏血酸参与植物的生长发育的众多过程，抗
2013年第8期 55冉茂飞等 ：棉花 GhAO3 基因的克隆、功能序列分析及原核表达
坏血酸的氧化 / 还原比则是调控这些过程的重要因
素［9，10］。抗坏血酸氧化酶能够氧化抗坏血酸生成单
脱氢抗坏血酸，最终变成脱氢抗坏血酸，进而影响
植物质外体抗坏血酸库的氧化还原态，与细胞内抗
坏血酸代谢及氧化 / 还原比密切相关［6，11］。本研究
克隆了棉花纤维中的 GhAO3 基因，AO 属于一个小
的多基因家族，一般在一个物种有 2-4 个亚克隆，
且具有较高的保守性，AO 基因已在许多高等植物中
获得，如番茄、黄瓜、甜瓜和水稻等［12］。对 GhAO3
蛋白进行了功能序列分析，GhAO3 具有一个跨膜信
号肽，是一种定位于细胞壁的多铜氧化酶 ；具有保
守的功能结构域，并且具有多种酶的催化位点，这
与其他植物中的 AO 研究结果相似［13，14］。
AO 与植物的众多生理发育过程密切相关，如
植物抗逆性、抗氧化性和敏感性等［15，16］。由于抗坏
血酸库的整体性、复杂性和抗坏血酸氧化 / 还原比
的精细调控，AO 在植物代谢途径中可能会通过响应
激素信号，如乙烯、SA 和 NAA 等的信号来影响植
物的抗性和生长［17］。另外，许多研究表明 ：AO 基
因参与到细胞的分裂和伸长发育过程［4，5］，棉化纤
维是不分支的单细胞结构，纤维的伸长发育分子机
制一直也不是十分清楚。本研究从快速伸长发育的
棉纤维中克隆了 GhAO3 基因并进行了原核表达，这
为深入研究 GhAO3 基因多样的功能及其参与棉纤维
伸长发育过程的重要作用奠定了一定基础。
4 结论
从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克
隆得到 GhAO3 基因。GhAO3 拥有保守的多铜氧化酶
家族、抗坏血酸氧化酶结合位点和跨膜信号肽等保
守结构，这些功能结构或可能与棉花的生长发育及
响应非生物胁迫的能力相关。构建了原核表达载体
pET32a-GhAO3，转化大肠杆菌，通过诱导表达及
SDS-PAGE 分析获得了大小约为 64 kD 的 GhAO3 重
组蛋白质，该重组蛋白具有较高的酶催化活力。
参 考 文 献
［1］ Tullio MC. Ascorbic acid oxidase ：an enzyme in search of a
role［J］. Biologia Plantarum, 2004, 48（2）：161-166.
［2］ Sanmartin M, Drogoudi PD, Lyons T. Over-expression of ascorbate
oxidase in the apoplast of transgenic tobacco results in altered
ascorbate and glutathione redox states and increased sensitivity to
ozone［J］. Planta, 2003, 216 ：918-928.
［3］ Sanmartin M, Pateraki I. Diverential expression of the ascorbate
oxidase multigene family during fruit development and in response to
stress［J］. Planta, 2007, 225 ：873-885.
［4］ Kato N, Esaka M. Expression of transgenic tobacco protoplasts
expressiong Pumpkin asocbrate oxidase is more rapid than that of
wild-tpye protoplasts［J］. Plant, 2000, 210 ：1018-1022.
［5］ Kato N, Esaka M. Changes in asocrbate oxidase gene expression
and ascorbatelevels in cell division and cell elongation in tobaocc
cells［J］. Physiol Plant, 1999, 105 ：321-329.
［6］ Li HB, Qin YM, Pang Y, et al. A cotton ascorbate peroxidase
is involved in hydrogen peroxide homeostasis during fibre cell
development［J］. New Phytologist, 2007, 175 ：462-471.
［7］ 蒋建雄 , 张天真 . 利用 CTAB/ 酸酚法提取棉花组织总 RNA［J］.
棉花学报 , 2003, 15 ：166-167.
［8］ 胡根海 , 喻树迅 . 利用改良的 CTAB 法提取棉花叶片总 RNA
［J］. 棉花学报 , 2007, 19（1）：69-70.
117
kD
M 1 2 3 4 5
64
kD
85
49
34
25
19
12
8
4
0
3 0 3 6
pET32a-GhAO3Vector
䈡ሬᰦ䰤h
䞦⍫
࣋μ
m
ol
/m
in
/m
g
pr
ot
ei
n
A
B
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：pET32a 空载体（IPTG 诱导 3 h）；
2 ：未诱导的蛋白表达 ；3-5 ：诱导 0、3 和 6 h 的蛋白表达
图 6 GhAO3 重组蛋白的诱导表达、SDS-PAGE 分析（A）
和酶活力分析（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期56
［9］ 陈坤明 , 宫海军 , 王锁民 . 植物抗坏血酸的生物合成、转运及
生物学功能［J］. 西北植物学报 , 2004, 24（2）：329-336.
［10］ Conklin PL, Saracco SA, Norris SR, Last RL. Identification of
ascorbic acid-deficient Arabidopsis thaliana mutants［J］.
Genetics, 2000, 154 ：847-856.
［11］ Sanmartin M, Drogoudi PA, Lyons T, et al. Over-expression of
ascorbate oxidase in the apoplast of transgenic tobacco results
in altered ascorbate and glutathione redox states and increased
sensitivity to ozone［J］. Planta, 2003, 216（6）：918-928.
［12］ Glen L, Mark A, Smirnoff N. The biosynthetic pathway of vitamin C
in higher plants［J］. Nature, 1998, 393 ：365-369.
［13］ Ohkawa J, Okada N, Shinmyo A, Takano M. Primary structure of
cucumbei（Cucumis sativus）ascorbate oxidase deduced from
cDNA sequences bomology with blue copper proteins and tissue-
specific expression［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86（4）：
1239-1243.
［14］ Mol J. Refined crystal structure of ascorbate oxidase at 1.9 A
resolution［J］. Biol, 1992, 224（1）：179-205.
［15］ Sanmartin M, Pavlina D, Lyons T. Over-expression of ascorbate
oxidase in the apoplast of transgenic tobacco results in altered
ascorbate and glutathione redox states and increased sensitivity to
ozone［J］. Planta, 2003, 216 ：918-928.
［16］ Yammaoto A, Bhuiyan NH, Waditee R, et al. Suppressed expression
of the apoplastic ascorbate oxidase gene increases salt tolerance in
tobacco and Arabidopsis plants［J］. J Exp Bot, 2005, 56 ：1785-
1796.
［17］ Pignocchi C, John M. The function of ascorbate oxidase in tobacco
［J］. Plant Physiology, 2003, 132 ：1631-1641.
（责任编辑 狄艳红）