全 文 ：·综述与专论· 2013年第6期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
酶的固定化方法和技术研究是酶工程研究的重
点之一，其核心是如何将游离的酶通过一定的方式
与水不溶性的载体相结合，同时保持酶的催化活性
和催化特性。固定化酶的概念自 1953 年由德国科学
家 Gubhofen［1］提出以来，先后经过了实验室研发到
工业化生产的重大转折，并建立了传统的固定化酶
的基本方法，如包埋法、交联法、吸附法和共价结
合法［2］。近年来，随着结构生物学、蛋白质工程及
材料科学的不断发展，在酶的固定中出现了一些新
型载体和新型技术，从而使酶在负载能力、酶活力
和稳定性等方面获得了极大提高，且降低了酶在工
农业应用中的催化成本。这些载体和技术包括交联
酶聚集体、“点击”化学技术、多孔支持物和最近的
以纳米粒子为基础的酶的固定化［3］。纳米材料作为
收稿日期 ：2012-11-27
基金项目 ：河南省科技厅科技攻关项目（112102210299），河南省教育厅自然研究计划项目（2011A180026）
作者简介 ：高启禹，男，硕士，讲师，研究方向 ：酶与酶工程 ；E-mail ：gaog345@163.com
纳米材料固定化酶的研究进展
高启禹1  徐光翠2  陈红丽1  周晨妍1
（1. 新乡医学院生命科学技术学院 河南省遗传性疾病与分子靶向药物重点实验室培育基地，新乡 453003 ；
2. 新乡医学院公共卫生学院，新乡 453003）
摘 要 ： 纳米材料在蛋白酶及核酶的固定化研究领域进展迅速，主要包括各种磁性纳米载体及非磁性纳米载体。目前在固
定化纳米载体的特性、固定化方法及固定化效果上已进行了广泛探讨。综述以纳米载体的研究现状为基础，分析纳米载体固定化
酶的应用前景及纳米载体固定对酶学性质的影响，并对该技术的研究进行介绍和展望。
关键词 ： 纳米材料 固定化酶 磁性载体 非磁性载体 核酶
Research Progress of Nanoparticles for Immobilized Enzymes
Gao Qiyu1 Xu Guangcui2 Chen Hongli1 Zhou Chenyan1
（1. College of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Henan Key Laboratory of Hereditary Disease and Molecular Target
Drug Therapy（Cultivating Base），Xinxiang 453003 ；2. College of Public Health，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）
Abstract:  Immobilization of protease and ribozyme by nanometer carrier are researched as a more useful means, including of the magnetic
nanoparticle and nonmagnetic nanoparticles. Currently, the types of immobilized carrier and methods and results of nanoparticles are discussed.
In this paper, we describe the current application of immobilized enzyme by nanocarrier, the effect of nanoparticles matrix to enzymatic properties
and the prospect of application for the above mentioned technology were introduced, and the direction of the development of nanoparticles
immobilization of enzyme was analyzed.
Key words:  Nanoparticle cartie Immobilized enzymes Magnetic nanoparticles Non magnetic nanoparticles Ribozyme
酶固定化的新型载体，能够体现良好的生物相容性、
较大的比表面积、较小的颗粒直径、较小的扩散限制、
有效提高载酶量及在溶液中能稳定存在等优点［4］。
固定化的微粒状态根据纳米材料物理形态的差异性
可分为纳米粒（包括纳米球、纳米囊）、纳米纤维
（包括纳米管、纳米线）、纳米膜及纳米块等。目前，
用于酶固定化的纳米形态以纳米粒（Nanoparticles，
Nps）最为常见，纳米粒通常指粒子尺寸在 1-1 000
nm 范围内的球状或囊状结构的粒子。而用于酶固定
的纳米载体材料有磁性纳米载体、非磁性纳米载体
等［5］。但是，在进行相关固定化设计时，仍然需严
格遵循固定化酶的主要任务，即一方面要满足应用
上的催化要求 ；另一方面又要满足在调节控制及分
离上的非催化要求。
2013年第6期 21高启禹等 ：纳米材料固定化酶的研究进展
1 用于酶固定化的磁性纳米载体
作为磁性纳米材料由于其良好的活性功能基团
（ 如 -OH、-COOH、-CHO、-NH 和 -SH 等 ） 可 结 合
各种功能分子，因而在酶的固定化领域已获得了一
定的应用（表 1），同时磁性材料在生物医学（临床
诊断、靶向药物和酶标）、细胞学（细胞标记和细胞
分离等）和生物工程（酶的固定化）及分离工程等
方面发展迅速［6］。这种应用与纳米材料的结构特性
紧密相关，如表面较平滑、单分散性好、结构疏松
等。除此之外，磁场能提供一种有效的酶回收的方法，
可通过一定的磁力作用对具有磁性的纳米载体进行
回收，从而提高了产物的纯度，避免了最终产品的
表 1 磁性纳米载体在生物技术上的应用
载体 固定化酶 应用 参考文献
磁性 SiO2 纳米颗粒 漆酶 废水处理、生物漂白 ［7］
Fe3O4 纳米微粒 胆固醇氧化酶 血清中总胆固醇分析 ［8］
Fe3O4 纳米微粒 脂肪酶 对硝基苯磷酸二钠的水解 ［9］
纳米磁性聚乙二醇微粒 纤维素酶 水解秸秆 ［10］
Fe2O3 包被的硅微粒 卤烷烃脱卤素酶 含脱卤素酶序列的融合蛋白质的生产 ［11］
AlN（氮化铝）纳米颗粒 β-葡萄糖苷酶 纤维素的降解、食品风味的改善 ［12］
ZnO 纳米微粒 β-半乳糖苷酶 乳糖水解 ［13］
离子液体修饰的超顺 Fe3O4 磁性纳米颗粒 青霉素 G 酰化酶 催化青霉素 G 分解为 6APA 和苯乙酸 ［14］
酶污染。
采用磁性纳米载体进行酶的固定对酶的酶活力
和稳定性、酶结构和功能、酶特异性等酶学性质有
一定的提高，但在生物催化过程中需充分考虑生物
催化剂的回收利用、经济效益及副产物的处置等，
以达到最优的固定化设计。Wang 等［15］ 通过共沉淀
法对 Fe3O4 纳米粒子进行了表面不同链长度的烷基
硅烷的修饰，获得了改性的 Fe3O4 粒子，通过对脂
肪酶的固定发现，固定化酶的活性及稳定性与增加
烷基链的长度有关。Sachin 等［16］用新型磁性交联的
CLEAs 颗粒固定了 α-淀粉酶，研究发现 α-淀粉酶被
固定化后，其对底物的亲和力得到增强，同时也提
高了酶的热稳定性和贮存稳定性，即使在贮存 42 d
后仍能保持近 100％的酶活。Zhang 等［17］成功地将
腺苷脱氨酶固定在金纳米（AuNP）微粒上，并用标
记检测证实了二者的连接。动力学研究表明，AuNP
固定的腺苷脱氨酶仍具有较好的稳定性和催化活性。
Natalia 等［18］探讨了利用聚合有聚乙二醇的 Fe3O4 磁
性纳米粒子固定 α-半乳糖苷酶的固定化效果。研究
发现，酶与载体进行了有效的偶联，但偶联效率受
纳米粒子直径大小等理化性质的影响，同时在酶的
热稳定性上得到了提高。Gardimalla 等［19］研究了固
定在 Fe2O3 磁性纳米微粒上的假丝酵母脂肪酶在稳
定性方面的改变，结果发现，采用 Fe2O3 磁性纳米
微粒固定脂肪酶可以获得比游离酶更长的可重复利
用时间。Hong 等［20］发现在空间位阻和静电的共同
作用下，结合在表面修饰的纳米金颗粒表面的 α-胰
凝乳蛋白酶对携带正电荷的底物表现出很强的亲和
性，同时具有较高的催化活力，而对携带负电荷的
底物仅表现很低的亲和力和催化活力，对中性底物
的亲和力和催化能力居中。
2 非磁性纳米载体上酶的固定化
非磁性纳米载体通常由天然高分子材料和人
工合成高分子材料制备，目前最常用的方法是利用
反胶团进行聚合反应从而制备纳米级高分子载体，
然后再通过共价交联或吸附的方法对酶进行固定
化［21］。根据高分子材料的性质可将其分为无机纳米
载体、有机纳米载体和复合物纳米载体等［22］。非磁
性材料的磁电阻效应一般都比较低，因此在特殊的
环境中能为酶的应用提供相对容易的调控，而且作
为纳米级的生物催化体系，在表面积 / 体积比上具
有独一无二的天然优势。目前，采用非磁性纳米载
体进行酶的固定已取得了系列研究成果（表 2），同
时随着材料科学的进一步发展，必将有更多的新材
料被应用于酶的固定化。
使用非磁性纳米载体进行酶的固定前需用傅利
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期22
叶变换红外光谱、电镜扫描、核磁共振、电感耦合
技术及 X 射线光电子能谱等对纳米微球体作性质测
定。同时为提高非磁性纳米载体的固定化效果，通
常需对载体表面进行相关的分子修饰（图 1），特别
在以壳聚糖修饰的纳米载体方面研究较为深入［32］。
黄赋等［33］用静电纺丝法制备了丙烯腈 / 丙烯酸共
聚 物（PANCAA） 纳 米 纤 维 膜， 以 1-乙 基 -3-（N，
N-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 /Ⅳ-羟基丁二酰亚胺
（EDC/NHS）为偶联剂，在纤维膜表面引入壳聚糖
修饰层，通过戊二醛将过氧化氢酶固定到壳聚糖修
饰的 PANCAA 纳米纤维膜上，研究结果表明，在壳
聚糖浓度为 25 mg/mL 及戊二醛质量分数为 5％条件
下，壳聚糖修饰膜的固定化酶活性比空白膜提高了
41.7％，稳定性也得到了不同程度的提高。Eldin 等［34］
采用沉淀聚合法将乙二胺与聚丙烯腈 - 共 - 甲基丙
烯酸纳米微粒共价联接，制备了聚丙烯腈 - 共 -甲
基丙烯酸甲酯（PAN-co-MMA）微球，通过对 β-半
乳糖苷酶的固定化发现，其催化活性、反应稳定性、
热稳定性、贮藏稳定性都有所提高。Liu 等［35］报
道了 NAD（H）与 SiO2 纳米微粒的共价联接，并发
现连接了 NAD（H）的 SiO2 纳米微粒可进行多酶共
固，如将谷氨酸盐脱氢酶、乳酸脱氢酶和 NAD（H）
固定后通过耦合反应用来催化生成 α-酮戊二酸和
乳酸，各种被固定的酶仍具有较好的活性和催化特
性。Neri 等［36］报道了用固定在聚硅氧烷 -聚乙烯醇
（POS-PVA）上的 β-半乳糖苷酶来合成低聚半乳糖，
研究发现，在 pH4.5，温度为 40℃条件下，低聚半
乳糖的合成浓度较高，而且固定化酶可重复利用 10
次，并保留有原酶活性的 84%。
3 纳米颗粒对核酶的固定化
脱氧核糖核酸（DNA）作为生命体的生物大分
子，在生物体内发挥着储存、复制及传递遗传信息
的重要功能，其碱基序列的变异与人类许多遗传疾
病相关，基于 DNA 探针的基因传感器、基因芯片的
研究正成为其中的一个研究热点。特别自 1989 年，
诺贝尔化学奖授予 Thomas R. Cech 及 S.Altman 以来，
核酸分子的自我剪切或自我剪接的分子机制得到了
进一步的研究和阐述，可对于核酶的固定化目前仍
处于起始阶段，但相对于其它固定化载体而言，由
于通过表面修饰的纳米颗粒与 DNA 具有良好的生物
相容性，从而增加了 DNA 的固定量，增强了固定
化 DNA 的稳定性和定向性。目前 DNA 常用的固定
化方法包括吸附法（直接吸附法、恒电位吸附法、
静电吸附法、LB 膜技术）、自组装膜（self-assembly
SA）法及亲和素 - 生物素反应系统固定法［37］。常
用到的纳米颗粒有纳米金、碳纳米管、纳米 SiO2 及
ZrO2 等
［38］。孔德领等［39］以球形纤维素为载体，经
环氧氯丙烷活化后共价偶联小牛胸腺 DNA，制备
DNA 免疫吸附剂，利用抗体抗原特异结合原理，通
过血液净化，可有效地清除患者体内 DNA 抗体及
抗体复合物，达到治疗目的。Li 等［40］则利用嵌在
表 2 非磁性纳米载体对酶的固定及应用
载体 固定化酶 应用 参考文献
壳聚糖纳米胶囊 α －淀粉酶 淀粉水解 ［23］
POS-聚乙烯乙醇 β-乳糖酶 低聚半乳糖的合成 ［24］
泡沫陶瓷 脂肪酶 乙酸乙酯的分解 ［25］
聚苯烯纳米微粒 α-糜蛋白酶 蛋白质裂解 ［26］
硫醇盐金纳米微粒 葡萄糖氧化酶 降解葡萄糖 ［27］
芳香胺 -邻醌聚合物 多酚氧化酶 多酚物质氧化 ［28］
Ag/P（St-MMA）高分子纳米微球 青霉素酰化酶 青霉素钾盐水解 ［29］
MCM-41 纳米材料 木瓜蛋白酶 酒液中蛋白的脱除 ［30］
聚苯乙烯纳米微粒 脂肪酶 酯类物质分解 ［31］
NH2
NH2
OO
O
OH
H
H
HH
HO H
nNH2 NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
图 1 壳聚糖结构及壳聚糖修饰的纳米粒模式图
2013年第6期 23高启禹等 ：纳米材料固定化酶的研究进展
SiO2 基质中垂直分布的碳纳米管端口的羧基共价固
定 DNA。刘盛辉等［41］用了氨基乙硫醇在金电极表
面形成自组装单分子膜，然后用水溶性的碳化二亚
胺作为偶联活化剂，ssDNA 的 5 端磷酸基与电极表
面自组装膜上的氨基以磷酸氨基酯键的形式共价结
合，从而在金电极表面形成 ssDNA 单分子层，从而
有效地对 DNA 进行了固定。Cai 等［42］把多壁碳纳
米管羧基化，从而在玻碳电极的表面形成了均匀的
薄膜，使电极的有效面积得到了增加，再以吡咯为
介质在电极表面通过电聚合包埋法固定 DNA，利用
杂交前后电极阻抗的变化实现了 DNA 的无指示剂杂
交检测。
4 结语
随着纳米新材料的不断出现，特别是对复合纳
米材料性质及特性的研究，为纳米材料在酶固定化
领域取得更加丰硕的成果成为可能。作为纳米载体
固定的酶，在酶与底物及产物的分离、酶的生物相
容性、免疫活性和稳定性等方面具有独特的优势，
而且由于引入的表面修饰剂的功能基团易于测定和
掌握，因而为酶的定向固定提供了极佳的设计思路，
同时也使多酶共固变得更加实际。但由于纳米载体
的设计相对比较困难，而且作为固定化材料在生产
成本及能源消耗等方面还存在一定的劣势，因而在
后期采用纳米材料进行酶的固定过程中，应改进现
有纳米材料制备的方法，同时，进一步优化纳米材
料的比表面积及力学特性，增强其亲和力和生物活
性，从而为改善酶的性能及提高酶的应用奠定坚实
的基础。
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（责任编辑 狄艳红）