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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):218-222
成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，
FGF）是一类由 FGF 基因家族成员编码的结构相关
蛋白质。目前，已经发现其家族有 23 个成员，其
中心区域都含有一段同源性为 30%-70% 的氨基酸
序列［1］。庞大的 FGF 家族成员可调节生物代谢 ；
调控细胞增殖、迁移和分化 ；参与肿瘤的发生和发
展［2，3］。FGF21 是 FGF 家族的一个新成员，是一种
可分泌的蛋白［4］，近年来已经成为国际上研究肥胖
和糖尿病的热点基因之一。FGF21 可以降低血糖浓
度，其对糖代谢的调节既不依赖于胰岛素，又能够
增强胰岛素的敏感性，促进胰岛 β 细胞的存活，还
可以降低胰岛素的使用浓度，改善胰岛素抵抗［5-9］。
同时，FGF21 可以调节脂代谢，改善脂蛋白图谱，
降低血浆中低密度脂蛋白胆固醇，甘油三酯水平，
并提高高密度脂蛋白胆固醇［10］。多项研究证明，糖
尿病患者血清 FGF21 的表达量增高［11-13］，且 FGF21
水平增高是 2 型糖尿病独立危险因素［14］。此外，在
肥胖个体中 FGF21 的血清水平上升［12］。 本研究拟
收稿日期 ：2014-09-25
基金项目 ：贵州省科技计划项目资助课题（黔科合 LG 字［2011］012 号）
作者简介 ：张礼林，女，硕士研究生，研究方向 ：基因工程药物 ；E-mail : 2751628863@qq.com
通讯作者 ：雷霆雯，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：基因工程药物 ；E-mail ：leitw@sina.com
李红梅，女，副教授，博士，研究方向 ：基因工程药物 ；E-mail ：gylhm@gmc.edu.cn
人 FGF21 原核表达载体的构建及重组蛋白表达
张礼林1  唐青蓝2  许庆忠1  雷霆雯1  李红梅1
（1. 贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室，贵阳 550004 ；2. 海南省第三人民医院检验科，三亚 572000）
摘 要： 构建人 FGF21（fibroblast growth factor，FGF）cDNA 的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总 RNA 后，
经 RT-PCR 扩增获得目的片段，构建其 T 载体进行保存。再构建重组原核表达载体 pET-28a（+）-hFGF21，重组质粒转化至大肠杆
菌菌株 BL21（DE3）中，在 IPTG 诱导下得到可溶性表达，采用亲和层析法纯化表达产物后，进行 Western blot 鉴定。成功构建重
组质粒 pET-28（+）-hFGF21，对其进行可溶性表达后成功纯化出 his-hFGF21，经 Western blot 鉴定该融合蛋白可与 FGF21 抗体特
异性结合。成功构建 pET-28（+）-hFGF21，并可溶性表达 his-hFGF21 蛋白。
关键词 ： 人成纤维细胞生长因子（FGF21）；克隆 ；原核表达 ；蛋白纯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.032
Preparation of Prokaryotic Expression Construct of Human FGF21
cDNA and Its Recombinant Protein Expression
Zhang Lilin1 Tang Qinglan2 Xu Qingzhong1 Lei Tingwen1 Li Hongmei1
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004 ；2. Department of Clinical Laboratory，
the Third People’s Hospital of Hainan Province，Sanya 572000）
Abstract: Preparation of prokaryotic expression constructs of human FGF21（fibroblast growth factor，FGF）cDNA and induction of
recombinant hFGF21 protein expression. Total RNA was extracted from human liver, and the target cDNA fragment was obtained using RT-
PCR. The amplified cDNA fragment was cloned into pMD19-T for preservation. Then the expression construct pET-28a（+）-hFGF21 was
successfully constructed and expressed with IPTG induction, and the his-hFGF21 protein was purified with histide-selective nickel affinity gel
and identified by Western blot. Western blot analysis showed that the fusion protein had specific binding with a FGF21 antibody.
Key words: human FGF21 ；molecular cloning ；prokaryotic expression ；protein purification
2015,31(3) 219张礼林等：人 FGF21 原核表达载体的构建及重组蛋白表达
构建人 FGF21 的原核表达载体，并对其进行诱导表
达和纯化，以获得人 FGF21 的融合蛋白，为后期进
一步研究 FGF21 的活性、作用及其与原发性高血压
相关性研究奠定试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株 质粒 pMD-19-T 载体购自宝生物
工程（大连）有限公司，受体菌 E.coli DH5α 菌株、
E.coli BL21（DE3）菌株、pET-28a（+）质粒由本实
验室提供。
1.1.2 酶与主要生化试剂 总 RNA 提取试剂盒购自
天根生化科技有限公司，M-MuLV 第一链 cDNA 合
成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，Premix
Taq、 限 制 性 内 切 酶 Xho Ⅰ 及 BamH Ⅰ、T4 DNA
Ligase、X-gal、IPTG、 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 片 段 纯 化
试剂盒、DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有
限 公 司，Trizol、 质 粒 DNA 小 量 提 取 试 剂 盒 购 自
OMEGA 公司，蛋白 marker 购自 Fermentas MBI，超
级感受态细菌制备试剂盒购自上海碧云天生物技术
有限公司，DMF、DMSO 购自 AMRESCO 公司，过
硫酸胺（APS）、叠氮化钠、溶菌酶、甘氨酸、Triton
X-100、咪唑、PMSF、考马斯亮兰 R-250、TRIS、丙
烯酰胺购自 Solarbio 公司，HIS-Select Nickel Affinity
Gel 购自 Sigma-aldrich 公司、FGF-21 Antibody rabbit
polyclonal IgG、Goat anti-rabbit IgG-HRP 购 自 Santa
Cruz Biotechnology 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物序列的设计 根据 GenBank 中人 FGF21
（NM_019113.2、GI ：68215584）基因序列，设计引
物 扩 增 人 FGF21cDNA 从 235 至 777 之 间 的 共 543
个碱基的片段，引物由宝生物工程（大连）有限公
司合成。H 上游 ：CGGGATCCCACCCCATCCCTGAC-
TCCAGT（下划线为 BamH I 酶切位点，前两个为保
护性碱基），H 下游 ：CCCTCGAGTCAGGAAGCGTA-
GCTGGGGCT（下划线为 Xho I 酶切位点，前两个为
保护性碱基）。
1.2.2 RT-PCR 获取目的片段与 T 载体构建 试剂
盒法提取人肝脏总 RNA（人肝组织取自于贵阳医学
院附属医院肝胆外科行肝脏切除术者。），经 M-MuLV
酶合成人源型 cDNA 第一链，以 cDNA 第一链为模板，
加 入 H 上 游、H 下 游 引 物 各 0.5 μL（10 μmol/L），
Premix Taq 12.5 μL，加水至总体积 25 μL。扩增条件：
94℃预变性 5 min 后进入循环 ；94℃ 30 s，60℃ 30
s，72℃ 1 min，循环 30 次 ；72℃延长 10 min。扩增
出人 FGF21 cDNA 从 235 至 777 之间的共 543 个碱
基的片段，构建于 pMD19-T 载体，经蓝白斑筛选出
阳性克隆子，对其进行菌落 PCR 鉴定，并送上海生
物工程公司测序，将测序正确的阳性克隆子命名为
pMD19-T-hFGF21 保存备用。
1.2.3 人 FGF21cDNA 表达载体的构建 以 pMD19-
T-hFGF21 为模板，加入 H 上游（10 μmol/L）、H 下
游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL，Premix Taq 12.5 μL，
加水至总体积 25 μL。扩增条件 ：94℃预变性 5 min
后进入循环 ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，循
环 30 次；72℃延长 10 min。大体系扩增出目的片段，
将 PCR 产物割胶回收后用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切，
回收酶切片段，并与用同样两种酶处理的 pET-28a
（+）质粒进行连接，连接产物转化 E. coli BL21（DE3）
感受态细胞，LK 平板筛选阳性转化子，PCR 鉴定后，
挑单菌落接种培养，抽提质粒，经双酶切鉴定正确
后送上海生物工程公司测序。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达 将测序正确的质粒转
化 Ecoli.BL21DE3 感受态细胞，LK 平板筛选阳性菌
落，挑取单菌落，在 LK 液体培养基中 37℃ 200 r/min
过夜培养。按 1∶500 的比例取上述菌液转接于 LK
液体培养基中，37℃ 200 r/min 振摇，至 OD600 达到
0.4 时， 加 入 IPTG（ 终 浓 度 为 0.2 mmol/L），23℃
120 r/min 诱导 4 h，收集菌体。将菌体蛋白进行 12%
SDS-PAGE 电泳鉴定。
1.2.5 融合蛋白的纯化 按上述条件诱导表达大量
表达载体，收集菌体后，100 mL 菌体沉淀中加入 8
mL 裂解液、60 μL PMSF（0.1 mol/L）吹打混匀，振
荡混匀 20 min。冰浴超声破碎 1 h，4℃，12 000 r/min
离心 20 min，收集上清与沉淀，将上清与沉淀分别
进行 12% SDS-PAGE 电泳鉴定。取超声破碎上清，
4℃ 12 000×g 离心 10 min 后取 100 μL 裂解上清液与
200 μL 不含咪唑的平衡缓冲液，轻柔颠倒混匀数次。
4℃ 5 000×g 离心 30 s，小心弃上清，并留样少许保
存。向凝胶中加入 1 mL 预冷的不含咪唑的清洗缓冲
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3220
液清洗 3 次。轻柔混合亲和凝胶 30 s，4℃ 5 000×g
离心 30 s，小心弃上清，留样少许，重复 3 次。最
后，向凝胶中加入 100 μL his 洗脱缓冲液，轻柔旋
转混匀 1 min，4℃ 5 000×g 离心 30 s，小心吸取上清，
留样保存，重复操作 2 次。将纯化的蛋白液、留样
的 漂 洗 液、 洗 脱 液 分 别 进 行 12% SDS-PAGE 电 泳
鉴定。
1.2.6 Western blot 鉴 定 分 别 取 BL21（DE3） 菌
株诱导表达蛋白裂解液、未纯化的蛋白裂解液和纯
化 his-hFGF21 蛋白液经 SDS-PAGE 凝胶泳后，将蛋
白条带转至 PVDF 膜上，经 Western blot 封闭液封闭
后，依次加入兔源性 FGF21 多克隆一抗，羊抗兔二
抗，最后用 ECL-Plus 发光试剂显色，干燥后扫描图
像保存。
2 结果
2.1 RT-PCR 获取目的片段与T载体构建
2.1.1 RT-PCR 获取目的片段 以人肝组织 cDNA 第
一链为模板，经 PCR 扩增人 FGF21 基因的完整开放
阅读框区，结果表明成功地从人 FGF21 cDNA 扩增
出目的片段。
2.1.2 T 载体的构建 通过 T-A 克隆将 PCR 产物与
pMD-19T 载体连接，将重组 pMD-19T-hFGF21 载体
经蓝白斑筛选挑选出阳性菌落进行 PCR 鉴定，结果
见图 1，初步验证了所构建 T 载体上带有目的基因。
2.1.3 测序鉴定 将菌落 PCR 鉴定正确的阳性菌落
扩大培养 12 h 后，取 1 mL 送基因公司进行序列分
析，经测定表明 pMD19T-hFGF21 基因碱基序列与
GenBank 公布的人 FGF21cDNA 序列一致，即可确认
人 FGF21 基因成功克隆到 pMD-19T 载体，将正确的
克隆命名为 pMD19T-hFGF21。
600
500
bp
M 1 2
M ：100 bp ladder marker ；1，2 ：人 FGF21 PCR 产物 543 bp
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测人 FGF21 重组载体 pMD19T-
hFGF21 菌落 PCR
2.2 人FGF21基因表达载体的构建
2.2.1 人 FGF21 重组表达载体连接 大体系扩增人
FGF21 目的片段后，对其与表达载体 pET-28a（+）
分别进行双酶切，分别回收双酶切片段，进行连接
反应，连接产物转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态
细胞，涂布于 LK 平板筛选阳性菌落，结果见图 2，
初步表明人 FGF21 重组表达载体构建成功。
图 2 人 FGF21 重组表达载体 Kan 抗性筛选平板
2.2.2 人 FGF21 重组表达载体酶切鉴定 将 LK 平
板筛选的阳性菌落接种于 LK 液体培养基中，37℃
200 r/min 培养 14 h 后提取质粒，双酶切处理，酶切
结果见图 3，由此鉴定人 FGF21 重组表达载体构建
成功，将其命名为 pET-28a（+）-hFGF21。
600
500
bp
M1 1 M2
M1 ：100 bp ladder marker ：M2 ：wide range 1 000 bp ladder marker ；1 ：pET-
28a（+）-hFGF21 的酶切产物
图 3 琼脂糖凝胶电泳检测人 FGF21 重组表达载体酶切图
2.2.3 测序鉴定 双酶切鉴定正确的质粒 DNA 定量
后取 30 μg 送基因公司进行序列分析，经测定表明
pET-28a（+）-hFGF21 基因碱基序列与 GenBank 公
布的人 FGF21 基因序列一致，即可确认人 FGF21 基
因成功克隆到 pET-28a（+）表达载体上，将正确的
克隆命名为 pET-28a（+）-hFGF21。
2015,31(3) 221张礼林等：人 FGF21 原核表达载体的构建及重组蛋白表达
2.3 融合蛋白的诱导表达
取 pET-28a（+）-hFGF21 的 BL21DE3 阳 性 菌
经抗生素筛选后取单菌落接种于 LK 液体培养基
中，37℃ 200 r/min 振摇过夜，扩大培养至 OD600 为
0.4 时， 在 IPTG 终 浓 度 为 0.2 mmol/L、1 mmol/L 的
条件下，以 23℃ 120 r/min 振摇后 4 h，收集菌体沉
淀，用 2×sample buffer 变性处理，SDS-PAGE 鉴定
（图 4）发现在 22 kD 左右均出现明显目的蛋白条带。
2.5 Western blot鉴定FGF21蛋白
一抗为兔抗 FGF21 多克隆抗体，二抗为辣根
过氧化物酶标记鼠抗兔 IgG，进行 Western blot 免疫
印迹分析，化学发光显色后结果如图 7 所示，his-
hFGF21 蛋白与兔抗 FGF21 多克隆抗体呈阳性反应，
在约 22 kD 处有特异性蛋白反应条带。
22 kD
70
kD
M 1 2 3 4
55
40
35
25
15
M ：预染蛋白 marker ；1 ：BL21（DE3）菌株诱导表达作为阴性对
照 ；2 ：pET-28a（+）-hFGF21 的 BL21（DE3）菌株未诱导 ；3，4 ：
pET-28a（+）-hFGF21 的 BL21（DE3） 菌 株 在 0.2 mmol/L IPTG、
1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白产物
图 4 SDS-PAGE 电泳检测 hFGF21 蛋白诱导表达产物
70
kD
M 1 2
55
40
35
25
15
22 kD
M ：预染蛋白 marker ；1，2 ：分别为诱导表达后菌体破碎的上清液和沉淀液
图 5 SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白可溶性分析
3 讨论
FGF21 是由肝、胰、脂肪和骨骼肌、心脏、胸
70
kD
M 1 2 4 5 7 6
55
40
35
25
15
22 kD
M ：预染蛋白 marker ；1 ：菌体破碎上清液与凝胶结合后余下蛋白液 ；2-4 ：
分别为目的蛋白液与凝胶结合后第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ次漂洗液 ；5-7 ：分别为目的
蛋白用相应洗脱液第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ次洗脱的目的蛋白
图 6 SDS-PAGE 电泳检测纯化蛋白 his-hFGF21
2.4 融合蛋白的纯化
2.4.1 菌 体 破 碎 取 pET-28a（+）-hFGF21 的 BL-
21DE3 菌种抗生素平板接种过夜后，挑取单菌落
于 LK 液体培养基中振摇过夜，按 1∶500 的比例取
20 μL 菌液加入 100 mL 新鲜抗生素液体培养基中，
37℃ 200 r/min 振摇至 OD600 达到 0.4 时，加入 IPTG
使其终浓度为 0.2 mmol/L，23℃ 120 r/min 振摇 4 h，
收集菌体沉淀加入 8 mL 裂解液、PMSF 后振荡混匀
20 min，冰浴超声破碎 1 h，离心后分离上清与沉淀，
变性后 SDS-PAGE 鉴定（图 5），由染色结果可知，
his-hFGF21 蛋白在上清液中大量表达。
2.4.2 FGF21 蛋白纯化 将裂解后的 his-hFGF21 蛋
白裂解上清液与 his 镍亲和凝胶结合后，将未结合的
蛋白漂洗除去，再用 his 洗脱缓冲液，将 his 融合蛋
白从凝胶上洗脱下来，即得到纯化的 his-hFGF21 融
合蛋白。将洗脱液、漂洗液变性后进行 SDS-PAGE
鉴 定（ 图 6）， 均 可 见 到 明 显 的 目 的 蛋 白， 纯 化
成功。
35
kD
M 1 2 3
20
15
22 kD
M ：为蛋白 marker ：1 ：纯化的蛋白 ；2 ：BL21（DE3）菌株诱导表达蛋白裂
解液作为阴性对照 ；3 ：未纯化的蛋白裂解液
图 7 Western blot 鉴定 his-hFGF21 蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3222
腺产生，可能从外周组织中以活化形式分泌［15-19］。
FGF21 mRNA 主要在肝脏中高水平表达［19］。本研究
获得了 his-hFGF21 融合蛋白，his-hFGF21 的分子量
约为 22 kD，纯化后的融合蛋白经 Western blot 免疫
印迹鉴定正确，说明关于 his-hFGF21 融合蛋白制备
成功。
目前，关于 FGF21 的研究多集中在其糖尿病的
相关性研究中，且将 FGF21 用于治疗糖尿病已经进
入 2 期临床研究阶段［20］，但尚未发现关于人 FGF21
与原发性高血压的相关性报道。本研究获得了人
FGF21 的表达，其表达产物 his-hFGF21 融合蛋白具
有免疫原性，其活性还有待进一步研究。
4 结论
本试验成功构建了 pET-28（+）-hFGF21，并可
溶性表达出 his-hFGF21 蛋白。
参 考 文 献
［1］Kharitonenkov A. FGFs and metabolism［J］. Curr Opin Pharmacol,
2009, 9（6）：805-810.
［2］Kharitonenkov A, Shanafelt AB. Fibroblast growth factor-21 as a
therapeutic agent for metabolic diseases［J］. Biodrugs, 2008, 22
（1）：37-44.
［3］Nicholes K, Guillet S, Tomlinson E, et al. A mouse model of
hepatocellular carcinoma ectopic expression of fibroblast growth
factor 19 in skeletal muscle of transgenic mice［J］. Am J Pathol,
2002, 160（6）：2295-2307 .
［4］付宏岐 , 李海燕 , 庞实锋 , 等 . 利用转基因番茄表达人成纤维细
胞生长因子 21（FGF21）［J］. 西北农林科技大学学报 ：自然
科学版［J］. 2011, 39（7）：163-170.
［5］张谢 , 王周光 , 李晓霞 , 等 . 一个新的代谢调节因子——成纤维
细胞生长因子 21［J］. 药物生物技术 , 2011, 18（3）269-272.
［6］Xu J, Lloyd DJ, Hale C, et al. Fibroblast growth factor 21 reverses
hepatic steatosis, increases energy expenditure, and improves insulin
sensitivity in diet-induced obese mice［J］. Diabetes, 2009, 58（1）：
250-259.
［7］ Mashili FL, Austin RL, et al. Direct effects of FGF21 on glucose upt-
ake in human skeletal muscle ：implications for type 2 diabetes and
obesity［J］. Diabetes Metab Res Rev, 2011, 27（3）：286-297.
［8］Kharitonenkov A, Wroblewski VJ, Koester A, et al. The metabolic
state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor
21［J］. Endocrinology, 2007, 148（2）：774-781.
［9］Wang H, Xiao Y, Fu L, et al. High-level expression and purification
of soluble recombinant FGF21 protein by SUMO fusion in
Escherichia coli［J］. BMC Biotechnololy, 2010, 10 ：14.
［10］Seo JA, Kim NH. Fibroblast growth factor 21 ：a novel metabolic
regulator［J］. Diabetes Metab, 2012, 36 ：26-28.
［11］ Chen WW, Li L, et al. Circulating FGF-21 levels in normal subjects
and in newly diagnosed patients with Type 2 diabetes mellitus［J］.
Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2008, 116 ：65-68.
［12］Zhang X, Yeung DC, Karpisek M, et al. Serum FGF21 levels are
increased in obesity and are independently associated with the
metabolic syndrome in humans［J］. Diabetes, 2008, 57 ：1246-
1253.
［13］李思明 , 沙长青 , 高扬 , 等 . 中国东北地区妊娠期糖尿病妇女
与妊娠健康妇女血清成纤维细胞生长因子（FGF21）表达量
差异性研究［J］. 黑龙江科学 , 2013, 4（8）：23-25.
［14］Chen C, Cheung BM, Tso AW, et al. High plasma level of fibroblast
growth factor 21 is an independent predictor of type 2 diabetes ：
A 5. 4-year population-based prospective study in Chinese
subjects［J］. Diabetes Care, 2011, 34（9）：2113-2115.
［15］Nishimura T, Nakatake Y, Konishi M, et al. Identification of a novel
FGF, FGF-21, preferentially expressed in the liver［J］. Biochim
Biophys Acta, 2000, 1492（1）：203-206.
［16］Yasuhiro I, Holly AB, Noriyuki O, et al. FGF21 is an Akt-regulated
myokine［J］. FEBS Letters, 2008, 58（2）：3805-3810.
［17］Wang H, Qiang L, Farmer SR, et al. Identification of a domain
within peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulating
expression of a group of genes containing fibroblast growth factor
21 that are selectively repressed by SIRT1 in adipocytes［J］. Mol
Cell Biol, 2008, 28（1）：188-200.
［18］ Wente W, Alexander M, Efanov, et al. Fibroblast growth factor-21
improves pancreatic β-cell function and survival by activation of
extracellular signal-regulated kinase 1/2 and akt signaling Path-
ways［J］. American Diabetes Association, 2006, 55（9）：2470-
2478.
［19］柳景华 , 吕昀 , 等 . 成纤维细胞生长因子 21 基因在心脏中表
达的研究［J］. 心肺血管病杂志 , 2009, 28（6）：415-418.
［20］Zhao Y, Dunbar JD, Kharitonenkov A. FGF21 as a therapeutic
reagent［J］. Adv Exp Biol, 2012, 728 ：214-228.
（责任编辑 李楠）