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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
S-腺 苷 甲 硫 氨 酸（S-adenosylmethionine，SAM）
是所有生物体中都存在的一种重要分子［1］，由 SAM
收稿日期 ：2013-03-11
基金项目 ：广西大学科研基金资助项目（XBZ120010）
作者简介 ：秦秀林，女，博士，讲师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：xiulinqin@gxu.edu.cn
通讯作者 ：钱江潮，女，博士，教授，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：jiangchaoqian@ecust.edu.cn
利用间隔肽促进 S-腺苷甲硫氨酸合成酶
在毕赤酵母中的分泌表达
秦秀林1  钱江潮2  储炬2
（1. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004 ；2. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是所有生物体中都存在的一种重要分子，对维持生物体功能具有重要的作用，已经被广泛
地用于治疗肝脏疾病、关节炎和忧郁症等多种疾病。利用巴斯德毕赤酵母 KM71 构建基因工程菌 K/9KM，在 AOX1 启动子调控下
分泌表达达观链霉菌（Streptomyces spectabilis）来源 SAM 合成酶（MAT）。为促进 MAT 的分泌，在信号肽 Kex2p 切割位点后引入间
隔肽 G-Spacer（NTTEEGEPK），构建重组菌 K/GM，其重组蛋白（GM）表达量达到 84.7 mg/L，分泌效率提高了 92%，MAT 比酶活
提高了 58%。在重组蛋白 GM 的 C 端融合表达 His-tag，构建重组蛋白 GMH 表达重组菌 K/GMH，GMH 的 MAT 比酶活比 GM 下降
13%，但分泌效率无显著改变。因此，间隔肽 G-Spacer 对 MAT 的酶活及分泌有显著的促进作用，而 His-tag 会降低 MAT 的酶活力
但不影响其分泌效率。所构建的 MAT 分泌表达基因工程菌 K/GMH，在目的蛋白 C 端融合表达 His-tag 可减少分离纯化步骤和产物
损失，易于酶促转化法生产 SAM。
关键词 ： S-腺苷甲硫氨酸合成酶　分泌表达　毕赤酵母　间隔肽　异源表达
The Influence of Spacer Peptide and C-Terminal His-tag on
Activity and Secretion of MAT from Pichia pastoris
Qin Xiulin1 Qian Jiangchao2 Chu Ju2
（1. College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004 ；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East
China University of Science & Technology，Shanghai 200237）
Abstract:  S-adenosylmethionine synthetase（MAT）catalyzes the synthesis of S-adenosylmethionine（SAM）from L-methionine and
ATP in all living organisms. SAM is an important biochemical molecule participating in a variety of biochemical reactions, and has attracted
much interest in clinical research because of its potential to cure many diseases, such as depression, liver disease, and osteoarthritis. Accordingly,
to develop a simple and effective way to enzymatically synthesize and produce SAM, the MAT gene（sam2）from Streptomyces spectabilis
was expressed successfully under the control of the AOX1 promoter in the recombinant yeast Pichia pastoris KM71. Introduction of a spacer
peptide（G-Spacer ：NTTEEGEPK）after the α-factor, creating a G-spacer of the N-terminal extension of the MAT（GM）, greatly increased
the MAT spectivity activity of GM to 158% and concomitantly improved the secretion level of the GM by 92%. In contrast, the MAT activity
of the recombinant GM with C-terminal His-tag（GMH）was decreased by 13% as compared to that with the GM. Conclusively, the G-Spacer
seem to be of crucial importance in determining the secretion efficiency and activity of MAT in P. pastoris. The C-terminal region of the MAT
might also be important to the active protein structure.
Key words:  S-adenosylmethionine synthetase　Secretory expression　Pichia pastoris　Spacer peptide　Heterologous expression
合成酶（EC2.5.1.6，SAM synthetase，MAT）催化 L-
甲硫氨酸（L-methionine，L-Met）和 ATP 反应合成。
2013年第6期 141秦秀林等 ：利用间隔肽促进 S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达
SAM 参与 3 个重要生化途径，即转甲基作用［2］、转
硫作用［3］和多胺合成作用［4］。鉴于 SAM 对维持生
物体功具有重要的作用，已经被用于有效治疗肝脏
疾病［5］、关节炎［6，7］和忧郁症［8］等多种疾病，也
被开发为保健品。SAM 的生产方法主要有化学合成
法、发酵法和酶促转化法 3 种。化学合成 SAM 所
用反应底物价格昂贵、环境污染严重［9］，且存在
少量非对映体难以分离的缺点。而利用微生物发酵
生产 SAM 存在着终产物积累量低，分离提纯步骤
较复杂等缺点。较前面两种方法，酶促转化法具有
终产物积累量高、分离提纯容易及反应周期短等优
点，是较为有效的工业化生产方法。将 SAM 合成酶
（MAT）进行固定化，不仅可以提高产量，还能降低
成本减少工艺环节。His-tag 标记的酶，可利用固定
化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity
chromatography，IMAC）便于酶的纯化和固定［10］，
为酶促转化法大规模生产 SAM 奠定基础。
目前，MAT 的表达主要采用大肠杆菌和毕赤酵
母表达系统，但前者表达的重组酶 MAT 蛋白量和
酶活力均较低［11，12］，且大部分重组酶以包涵体形
式存在［13］；而毕赤酵母只有少数内源蛋白分泌到胞
外［14］，可获得较高的 MAT 表达量和利于表达产物
的分离纯化，是较理想的 MAT 表达系统［15，16］。为
了促进毕赤酵母目的蛋白的分泌表达，Kjeldsen 等［17］
在 α-factor 信号肽的 Kex2p 位点和目的蛋白间引入
一段间隔肽（含 3 个 Glu-Ala 二肽和赖氨酸 Lys 的短
肽 EAEAEAK），显著提高了发酵上清中胰岛素前体
的量。王晖等［18］在信号序列和目的蛋白 N 端间插
入间隔短肽，提高了 exendin-4 类似物串联体 EXA
在重组毕赤酵母中的分泌表达水平，与不含间隔肽
序列的 EXA 表达对照菌相比，插入含有糖基化位点
（NTTEEGEPK）和富含带电荷极性氨基酸（DDDDK）
的间隔肽后，蛋白表达水平分别提高了 4 倍和 9 倍。
同样，在人工合成的前引导肽（pro-leader）和目的
蛋白间增加一段间隔肽，重组酿酒酵母和毕赤酵母
的目的蛋白（胰岛素前体）产量分别提高了 2.6 倍
和 2.1 倍［19］，同时胞内残余的胰岛素前体浓度明显
降低，说明在目的蛋白Ｎ端增加间隔肽能促进目的
蛋白的分泌。
为了获得高效分泌表达 MAT 的重组菌，本研
究首先利用巴基德毕赤酵母 KM71 构建分泌表达重
组 MAT（M）的基因工程菌 K/9KM。其次，为促进
MAT 的分泌，在信号肽 Kex2p 切割位点后引入间隔
肽 G-Spacer（NTTEEGEPK），构建重组菌 K/GM。然
后，在重组蛋白 GM 的 C 端融合表达 His-tag（即构
建重组蛋白 GMH 表达重组菌 K/GMH）以便 MAT 的
分离纯化，并研究了间隔肽 G-Spacer 和 His-tag 对
MAT 重组酶分泌效率和酶活的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种质粒 大肠杆菌 DH5α 购自 TaKaRa 宝生
物工程有限公司。巴斯德毕赤酵母 KM71、GS115 和
表达载体 pPIC9K、pPICZ A 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 酶与试剂 EcoR I、Not I、T4 DNA 连接酶、
Taq DNA 聚合酶和去糖基化酶 Endo H 购自 TaKaRa
宝生物工程有限公司 ；DNA 胶回收试剂盒购上海生
物工程公司。PCR 引物均委托上海生物工程公司合
成。SAM 标准品购自 Sigma 公司。细胞裂解缓冲液：
50 mmol/L pH7.4 的磷酸钾缓冲液，5% 甘油（V/V），
5 mmol/L 的巯基乙醇和 1 mmol/L 的 EDTA（加入 1
mmol/L 的苯甲咪和 1 mmol/L 的 PMSF 作为蛋白酶抑
制剂）。
1.1.3　主要培养基 大肠杆菌培养使用 LB 或 LLB
培养基，毕赤酵母培养使用 YPG 培养基，筛选毕
赤酵母重组菌用 MD 固体培养基，培养毕赤酵母重
组菌用 BMGY 培养基，诱导毕赤酵母重组菌产酶用
BMMY 培养基，以上培养基均参照 Invitrogen 公司的
毕赤酵母操作手册进行。
1.2　方法
1.2.1　MAT 表达载体的构建　使用限制性内切酶
EcoR I 和 Not I 双酶切质粒 pPIC3.5K/ST［20］ 以获得
达观链霉菌（Streptomyces spectabilis）S-腺苷甲硫氨
酸合成酶（MAT）基因 sam2 片段，该片段与经相
同酶切后质粒 pPIC9K 连接，获得质粒 p9KM。以
质粒 pPIC9K 为模板，采用引物 α-MF F 分别和引物
α-MF R、α-MF A1、α-MF A2（表 1）进行 3 轮 PCR
扩 增， 在 α-MF 的 C 端（ 即 MAT 的 N 端 ） 引 入 肽
链 NTTEEGEPK（将其命名为间隔肽 G-Spacer）［17］，
将 PCR 扩增改造后的 α-MF 经 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期142
双酶切并与质粒 pPIC9K 连接，构建载体 pG9K，并
由上海生物工程公司测序鉴定。将 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ
双酶切的 sam 基因片段插入质粒 pG9K 获得重组质
粒 pGM。以质粒 pGM 为模板，用引物 SsM F 和 SsM
RH（表 1）扩增 C 端带有 His-tag 的 sam 基因片段，
将 PCR 产物经 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，替换载体
pGM 中的 sam 基因，测序鉴定，获得 sam 基因表达
框序列正确的载体 pGMH。
表 1 引物及其序列
引物名称 碱基序列（5-3） 酶切位点
α-MF F GCGGATCCAAACGATGAGA BamH I
α-MF R CTCAGTAGTGTTTACGTAAGCTTCAGC
α-MF A1 GCTCACCCTCCTCAGTAGTGTTTA
α-MF A2 GAATTCCTTTGGCTCACCCTCCTCA EcoR I
SsM F CCGGAATTCGTGTCCCGCCGTCTCTTC EcoR I
SsM RH AATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTG-
GTGGTGGTGAACAAGCGGCAGGAG
Not I
5’AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3’AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC
1.2.2 重组毕赤酵母构建及重组 MAT 的诱导表达
将 重 组 质 粒 p9KM、pGM 和 pGMH 用 限 制 性 酶
Bpu1102 I 酶切线性化后，分别电转毕赤酵母 KM71、
GS115，涂布 MD 平板，30℃倒置培养 3-5 d，直到
转化子长出。利用 5’AOX/3’AOX 引物菌落 PCR 鉴
定转化子，阳性克隆分别命名为 K/9K、K/9KM、K/GM
和 K/GMH ；G/9K、G/9KM、G/GM 和 G/GMH。挑取
经菌落 PCR 鉴定的阳性转化子于 3 mL YPD 培养基
中，30℃过夜培养后，取 1 mL 菌液保存甘油菌，
余 下 接 种 于 25 mL BMGY 培 养 基 中，30 ℃ 培 养 至
OD600 ≈15，4 000 r/min 离心 5 min，收集的菌体重悬
于 25 mL 诱导培养基 BMMY 中，30℃诱导表达 96 h
（KM71 和 GS115 系列重组菌每隔 12 h 补加甲醇分别
至终浓度 0.5% 和 1%）。然后 4℃，12 000 r/min 离
心 10 min，分别收集培养基上清及菌体分别用于重
组酶胞外和胞内 MAT 酶活测定。
1.2.3 玻璃珠法破碎菌体 取摇瓶培养液离心，得
到菌体沉淀，加入 1 mL 细胞裂解缓冲液（Breaking
Buffer）重悬。加入等体积酸洗玻璃珠（直径 0.5
mm），振荡 30 s 随后立刻冰浴中放置 30 s，重复 8
次。4℃，12 000 r/min，离心 10 min，取上清，-20℃
保存待检测。
1.2.4　重组菌胞内和胞外 MAT 活力测定　胞内外
MAT 粗酶液的制备 ：取 1 mL 培养液经 12 000 r/min，
4℃，10 min 离心，上清为胞外 MAT 粗酶液 ；培养
液离心后收集菌体，并用细胞裂解缓冲液清洗一次，
加入菌体等体积的酸洗玻璃珠（直径 0.5 mm）和 1
mL 细胞裂解缓冲液，采用玻璃珠法破碎细胞，吸
取细胞破碎液，并将粗抽提液经 12 000 r/min，4℃，
10 min 离心，上清液即为胞内粗酶液。MAT 酶活通
过 HPLC 检测［21］。酶活的计算 ：1 个酶活单位定义
为 37℃下，1 min 内转化生成 1 μmol 的 S-腺苷甲硫
氨酸（SAM）所对应的酶量。
1.2.5 蛋白浓度测定及 SDS-PAGE 分析 发酵液于
4℃，12 000 r/min 离心 15 min，上清液经 0. 45 μm
的微滤膜去除残余菌体，随后采用截留分子量为 10
kD 的超滤膜（Millipore 公司，美国）进行浓缩（约
5 倍）。发酵上清的蛋白浓度测定采用 Bradford 蛋白
定量试剂盒，按说明书操作。采用 Bio-Rad 蛋白电
泳试剂盒操作，分离胶浓度为 12%，浓缩胶浓度为 5%
的 SDS-PAGE 分析发酵上清重组蛋白。
2 结果
2.1 MAT表达载体和重组菌的构建
将载体 pPIC3.5K/ST 中的 S-腺苷甲硫氨酸合成
酶（MAT）基因 sam 片段克隆至 pPIC9K 质粒，获得
重组酶 M（重组 S-腺苷甲硫氨酸合成酶）表达的载
体 p9KM（图 1-A）。在重组酶 M 的 N 端融合一段间
隔肽 G-Spacer，构建了重组酶 GM 表达的载体 pGM
（图 1-B）。为了便于重组酶的分离纯化，构建了重
组酶 GM 的 C 端带有 His-tag 的表达载体 pGMH，重
组酶 GMH 的表达框如图 1-B 所示。
将重组质粒 pPIC9K、p9KM、pGM 和 pGMH 用
限制性酶 Bpu1102 I 酶切线性化后，分别电转毕赤酵
母 KM71、GS115，获得系列重组菌 ：K/9K、K/9KM、
K/GM 和 K/GMH ；G/9K、G/9KM、G/GM 和 G/GMH。
2.2 MAT 分泌表达对重组菌生长的影响
各重组菌中的 MAT 基因 sam2 均由 AOX1 启动
子调控，需甲醇诱导表达。在整个发酵期间，重组
菌 G/9KM、G/GM 和 G/GMH 的生长趋势与对照菌 G/9K
相似（图 2-A），MAT 诱导表达后并未影响细胞生长。
2013年第6期 143秦秀林等 ：利用间隔肽促进 S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达
α MF α MF
BamH I EcoR I
p9KM
10506 bp
Not I
pGM ATG
G-Spacer
sam TAA
Not IEcoR IBamH I
PAOX
α MFpGMH ATG
G-Spacer
sam TAA
6×His-tag
Not IEcoR IBamH I
PAOX
P AO
X sam
HI
S
4
Kan
pBR322
A
m
p
A B
图 1 重组质粒 p9KM 图谱（A）及重组酶 GM、GMH 表达框（B）
50
60
40
O
D
60
0
30
20
0 24
䈡ሬᰦ䰤h
48 72 96
A
50
60
70
40O
D
60
0
30
20
0 24
䈡ሬᰦ䰤h
48 72 96
B
G/9KM
G/GM
G/GMH
G/9K
K/9KM
K/GM
K/GMH
K/9K
重 组 菌 K/9KM、K/GM 和 K/GMH 也 是 同 样 的 结 果
（图 2-B）。结果表明，MAT 的诱导分泌表达对菌体
生长无显著影响。
2.3 MAT在重组毕赤酵母中的分泌表达
将质粒 pPIC9K、p9KM、pGM 和 pGMH 用限制
性酶 Bpu1102 Ⅰ酶切线性化，分别电转化毕赤酵
母 KM71 和 GS115 构建对应的系列重组基因工程菌
K/9K（对照菌）、K/9KM、K/GM、K/GMH、G/9K（对
照菌）、G/9KM、G/GM 和 G/GMH。
对照菌 K/9K 和 G/9K 发酵上清未检测到 MAT
活性，而重组菌发酵上清都检测到 MAT 酶活（图 3）。
KM71 系列重组菌（K/9KM、K/GM 和 K/GMH）胞外
MAT 酶活均比 GS115 系列重组菌高，其中 K/9KM、
K/GM 和 K/GMH 的酶活分别达到了 157.4、440.6 和
376.5 U/L，而 G/9KM、G/GM 和 G/GMH 的酶活分别
只有 38.2、85.5 和 82.3 U/L。这表明毕赤酵母 KM71
A ：重组菌 G/9K、G/9KM、G/GM 和 G/GMH 每间隔 12 h 补入 1% 无水甲醇（V/V）进行 MAT 的胞外诱导表达 ；
B ：重组菌 K/9K、K/9KM、K/GM 和 K/GMH 每间隔 12 h 补入 0.5% 无水甲醇（V/V）进行 MAT 的胞外诱导表达
图 2 重组蛋白 MAT 的分泌表达对重组菌生长的影响
更适于 MAT 的分泌表达。因此，后续的研究主要针
对 KM71 系列重组菌 ：K/9KM、K/GM 和 K/GMH。
500
400
300
200
100
M
AT
䞦⍫
U/L

G/
9K
M
G/
GM
G/
GM
H
K/
9K
M
K/
GM
K/
GM
H
0
图 3 重组菌胞外 MAT 酶活
SDS-PAGE 分析重组菌分泌表达的重组 MAT 分
子量约为 50 kD（图 4），比理论分子量（45 kD）偏
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期144
大，可能是 MAT 分泌过程的过度糖基化修饰造成
的。 用 软 件 NetNGlyc1.0 分 析（http ：//www.cbs.dtu.
dk/services/NetNGlyc/）达观链霉菌 MAT 基因，发现
两 个 N-糖 基 化 位 点（165 NGTI 和 243 NPTG）。 将
分泌到胞外的重组 MAT 经 Endo H 去糖基化处理后
SDS-PAGE 检测（图 4），分子量降低，约为 45 kD
与理论分子量一致。结果表明，SDS-PAGE 检测到
的重组 MAT 分子量比理论分子量偏大是由于糖基化
修饰造成。
显著影响，但降低了其酶活性。
为了研究间隔肽 G-Spacer 和 C 端 His-tag 对重
组蛋白 MAT 分泌效率（胞外 MAT 酶活与胞内外总
酶活之比）的影响，检测了重组菌 K/9KM、K/GM
和 K/GMH 胞内外 MAT 酶活。重组菌 K/9KM、K/GM
和 K/GMH 细胞内均检测到了 MAT 酶活（表 2），说
明重组菌细胞内均有未分泌至胞外的 MAT 蛋白。分
析比较 K/9KM、K/GM 和 K/GMH 中 MAT 分泌效率，
较 K/9KM 而言，重组菌 K/GM 和 K/GMH 重组 MAT
分泌效率分别提高了 92% 和 85%（表 2），间隔肽
G-Spacer 确实有效地提高了 MAT 的分泌效率，并且
重组蛋白 GM 的 C 端融合表达 His-tag 对重组 MAT
（GMH）的分泌并没有显著影响。
3 讨论
SAM 合成酶（MAT）的大量获得，对于酶促法
大规模合成 SAM 至关重要。本研究所构建的毕赤
43
66.2
kD
 K/9KM  K/GM   MK/GMH
箭头所示条带为重组 MAT 蛋白 ；- ：未去糖基化处理 ；+ ：经 Endo H 去糖
基化处理 ；M ：蛋白 Marker
图 4 重组菌胞外蛋白经 Endo H 去糖基化处理
2.4 诱导时间对MAT酶活和分泌表达量的影响
为了确定重组菌表达 MAT 的最佳诱导时间，将
重组菌在 BMMY 培养基中利用甲醇诱导 96 h，诱导
24 h 后每间隔 12 h 取发酵上清检测 MAT 酶活并进
行 SDS-PAGE 分析。结果（图 5）显示，随着诱导
时间的增加，各重组菌 MAT 的酶活和表达量都有所
提高。诱导 72 h 时，胞外 MAT 的酶活（图 5-A）和
蛋白表达量（图 5-B）达到最高，重组菌 K/9KM、
K/GM 和 K/GMH 的 MAT 酶活分别达到 157.4、440.6
和 376.5 U/L。说明重组菌分泌表达 MAT 最适诱导
时间为 72 h。
2.5 间隔肽G-Spacer和His-tag对MAT酶活、蛋白表
达量和分泌效率的影响
分 析 了 重 组 菌 K/9KM、K/GM 和 K/GMH 胞 外
MAT 酶活及蛋白浓度（表 2），以研究间隔肽 G-Spacer
和 C 端 His-tag 对 重 组 蛋 白 MAT 比 酶 活 及 蛋 白 表
达 量 的 影 响。 与 重 组 菌 K/9KM 相 比，K/GM 胞 外
MAT 表达量、比酶活分别提高了 80% 和 58% ；而
K/GMH 胞外的 MAT 酶活较 K/GM 减少了 13%，但
对 MAT 的表达量无显著影响。以上结果表明 ：间隔
肽 G-Spacer 能显著提高重组酶 MAT 的酶活及分泌表
达量 ；而 C 端 His-tag 对重组蛋白 MAT 表达量没有
500
400
300
200
100
0
24 36 48
䈡ሬᰦ䰤h
M
AT
䞦⍫
U/L

60 72 84 96
K/9KM
K/GM
K/GMH
A
K/9KM
0 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h M
66.2
kD
43
K/GM
0 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h M
66.2
kD
43
K/GMH
0 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h M
66.2
kD
43
B
箭头所示条带为重组 MAT 蛋白 ；M ：蛋白 Marker
图 5 诱导时间对重组菌 MAT 活性（A）和分泌表达
量（B）的影响
2013年第6期 145秦秀林等 ：利用间隔肽促进 S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达
酵母基因工程菌 K/9KM 成功分泌表达了具有活性
的 MAT 重组酶（M），在重组酶 M 的 N 端融合了间
隔肽 G-Spacer 后（即构建重组酶 GM 和 GMH）发
酵上清液中的比酶活和分泌效率均有显著提高。在
重组酶 GM 的 C 端融合了 His-tag 后（即构建重组酶
GMH）比酶活略有下降，对分泌效率并无显著影响。
这说明重组酶 GM 和 GMH 比酶活和分泌效率的提高
主要是 N 端的 G-Spacer 所导致。最后，构建的重组
酶 GMH 可利用 IMAC 实现 GMH 的一步纯化和固定，
大幅减少了产物损失和后继工艺的操作时间，并且
MAT 经固定化后其酶稳定性也可大幅提升［15］。
利用大肠杆菌表达 MAT，只能获得少量具有
MAT 酶活性的重组酶。Alvarez 等［13］在大肠杆菌中
表达老鼠肝脏来源 MAT 时发现，尽管重组酶的表达
量达到了细胞总蛋白量的 30%，但大部分 MAT 重组
酶以包涵体形式存在，导致 MAT 酶活性较低。酿酒
酵母 sam2 基因编码的 MAT 在大肠杆菌中表达也遇
到同样的问题，MAT 的表达量和酶活性都很低［12］。
这主要是因为大肠杆菌是原核表达系统，无法实现
真核蛋白质转录后修饰和蛋白质的正确折叠，因此
不适于表达真核来源的 MAT。而毕赤酵母作为真核
表达系统，可实现蛋白质的糖基化、磷酸化修饰，
二硫键的形成，蛋白质的正确折叠，更适于 MAT
的表达［15，22］。由于本研究中所表达的达观链霉菌
MAT 蛋白中存在两个 N-糖基化位点（165 NGTI 和
243 NPTG），在分泌表达过程中经糖基化修饰，导
致 MAT 重组酶分子量比理论分子量偏大，这是毕赤
酵母表达外源蛋白时存在的一普遍现象［23，24］，但并
不影响其 MAT 酶活性。
在构建 MAT 表达的重组毕赤酵母重组菌时，我
们发现一有趣现象 ：以 KM71 为宿主菌构建的 MAT
表达重组菌其 MAT 表达量显著高于 GS115 重组菌。
也有类似报道［15］表明，在分泌表达酿酒酵母来源
的 MAT 时，基于 KM71 构建的重组菌 MAT 的表达
量最高可达到约 200 mg/L，显著高于 GS115 重组菌
的 MAT 表达量（约 49 mg/L）。
4 结论
构建的毕赤酵母基因工程菌成功分泌表达了
具有活性的重组酶 MAT（M）。在重组酶 M 的 N 端
融合 G-Spacer，即构建重组蛋白 GM，其分泌效率
和 MAT 比 酶 活 分 别 较 M 提 高 了 92% 和 58%。 为
了便于蛋白纯化，在重组酶 GM 的 C 端融合了 His-
tag，即构建重组酶 GMH，其比酶活略有下降（减少
13%），对分泌效率并没有显著影响。
参 考 文 献
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表 2 间隔肽 G-Spacer 和 His-tag 对 MAT 酶活、表达量和分泌效率的影响
菌株 胞外 MAT 酶活（U/L） 胞外蛋白浓度（mg/L） 胞外 MAT 比酶活（U/mg） 胞内 MAT 酶活（U/L） 分泌效率（%）
K/9KM 157.4±13.4 47.2±4.4 3.3±0.3 270.2±28.4 36.8±2.8
K/GM 440.6±26.2 84.7±5.8 5.2±0.2 184.8±22.8 70.5±4.4
K/GMH 376.5±22.4 83.8±5.2 4.5±0.2 177.5±24.7 68.0±5.6
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（责任编辑 马鑫）