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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(1):51-60
转录因子（Transcription factor，TF）又称反式
作用因子，是直接或间接与基因启动子区域顺式作
用元件发生特异性结合、对基因的转录起调节作
用的一类蛋白质。转录因子一般具有 4 个功能结构
域 ：DNA 结 合 区（DNA-binding domain，DBD）， 是
转录因子上识别并结合顺式作用因子的一段氨基
酸序列，可与靶位点特异性结合 ；寡聚化位点区
（Oligomerization site，OS），是不同转录因子间发生
相互作用的功能域 ；核定位信号区（Nuclear location
收稿日期 ：2014-04-14
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31340052），辽宁省自然科学基金项目（2013020069）
作者简介 ：宿明星，女，硕士研究生，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：sumingxing8866@163.com
通讯作者 ：李秋莉，女，博士，教授，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：skyliqiuli@163.com
植物非生物胁迫相关转录因子研究方法
宿明星  孙颖颢  施鹤  李秋莉
（辽宁师范大学生命科学学院 辽宁省植物生物技术重点实验室，大连 116081）
摘 要 ： 转录因子是一类能够与启动子区域顺式作用元件特异性结合的蛋白质，是一大类转录调控因子，也是植物中最大
的基因家族之一。转录因子可以调节众多下游基因的表达，对植物的生长发育、形态建成、激素调节，以及抵抗多种生物和非生
物胁迫具有重要作用。结合近年来转录因子的研究进展，归纳总结了植物非生物胁迫相关转录因子研究的主要策略和方法，包括
转录因子结构域、亚细胞定位、转录激活作用、转录因子复合体以及转录因子功能的研究，为植物转录因子的相关研究提供理论
和方法的参考。
关键词 ： 非生物胁迫 ；转录因子 ；瞬时表达 ；转录激活 ；转基因植物
DIO ： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.008
Research Methods of Abiotic Stress-related Transcription
Factors in Plants
Su Mingxing Sun Yinghao Shi He Li Qiuli
（Key Laboratory of Plant Biotechnlogy of Liaoning Province, College of Life Sciences, Liaoning Normal University，Dalian 116081）
Abstract: Transcription factor is a kind of proteins which bind to the cis element region of the promoters specifically and a kind of
transcription regulatory factors, and it is also one of the biggest gene families in plants. Many transcription factors can regulate the expression of
downstream genes, and play important roles on plant growth and development, morphogenesis, hormone adjustment, and resistance to a variety
of biological and abiotic stress. In combination with the research progress of transcription factors in recent years, we have summarized main
strategies and methods of transcription factors to the abiotic stress, including the transcription factor domain structure, subcellular localization
and transcriptional activation, transcription factor complex and functions of transcription factors, to provide related research theories and methods
to plant transcription factors for reference.
Key words: abiotic stress ；transcription factor ；transient expression ；transcriptional activation ；transgenic plants
signal，NLS），可将转录因子定位于细胞核内的某些
区域 ；转录调控区（Transcription regulation domain，
TRD），决定着转录因子对靶基因的调控特征，分为
转录激活域（Activation domain，AD）和转录抑制域
（Repression domain，RD），对靶基因的转录起激活
或抑制作用。
转录因子在植物的生长发育、形态建成及对生
物和非生物胁迫中起着重要的作用，在植物基因表
达调控系统中转录因子一直备受关注，我们结合近
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.152
年来非生物胁迫相关转录因子的研究进展，归纳、
总结了非生物胁迫相关转录因子研究的主要方法和
策略，以期为植物转录因子的鉴定、功能分析及靶
基因研究提供理论和技术上的参考。
1 转录因子结构域分析
1.1 生物信息学分析转录因子保守结构域
转录因子序列通常具有保守性，这些保守的
结构域（Conserved domains，CD）在进化过程中氨
基酸序列变化很小，因此可以利用生物信息学方法
对序列进行分析，预测转录因子的结构域。随着生
物信息学技术的发展，各种分子生物学数据库提供
了大量的核苷酸和氨基酸序列，常用的大型生物
数 据 库 包 括 NCBI、EBI 和 DDBJ 等 都 为 转 录 因 子
的研究提供了大量的数据。转录因子有其自己的数
据 库， 如 TRANSFAC（http ：//www.gene-regulation.
com/pub/ databases.html）和 PlnTFDB（http ：//plntfdb.
bio.unipotsdam.de/v3.0/），为转录因子的鉴定、结构
和功能预测提供了新的方法［1］。植物转录因子数据
库 PlantTFDB database（http ：//planttfdb.cbi.pku.edu.
cn/）中包含多种植物特有的转录因子。Kato 等［2］
将 ANAC036 基因的核苷酸序列输入 NCBI 数据库中，
进 行 在 线 Blast（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
cgi），预测 ANAC036 氨基酸序列具有典型的 NAM
保守结构域，确定为 NAC 类转录因子。Lu 等［3］研
究的 SbSNAC1 转录因子，是从 PlantTFDB 数据库中
提取出的编码 NAC 类的转录因子，SbSNAC1 转录因
子具有典型的 NAC 结构域，具有抵抗干旱的作用。
Zhao 等［4］以 DREB 转录因子保守的 AP2 结构域为
筛选标准，从苹果（Malus pumila Mill.）基因组数
据 库（http ：// genomics. research. iasma. it/ ） 中 获 得 多
个苹果中 DREB 转录因子，并构建了本地 BLASTP
搜索，为后续对苹果中 DREB 转录因子家族全基
因组分析及表达特性分析奠定基础。模式生物拟
南芥（Arabidopsis thaliana L.）和水稻（Oryza sativa
L.）等有自己的转录数据库，如拟南芥的转录数据
库 RARTF（http ：//rarge.gsc.riken.jp/rartf/）和 AGRIS
（http ：//arabidopsis.med.ohio-state.edu/AtTFDB/）， 为
转录因子的研究提供了大量的数据。Sun 等［5］利
用水稻基因组数据库（http ：// rice. plantbiology. msu.
edu/） ，对分离出的 ONAC122 和 ONAC131 进行 BL-
ASTn 和 BLASTp 比对，并对 ORF（Open reading fra-
me）进行分析，结果显示两基因 N 末端都具有高度
保守的 NAC 结构域，并包含 NAC 的 5 个亚结构域，
C 末端具有特异性，确定 ONAC122 和 ONAC131 属
于 NAC 转录因子家族。本实验室 Li 等［6］利用生物
信息学分析辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis K.）中的
一个 NAC 转录因子 SlNAC1 发现，其具有 NAM 结
构域，属于 NAC 家族中的 TIP 亚家族，Yang 等［7］
利用此方法分析 SlNAC2 发现，其具有 NAM 结构域，
属于 NAC 家族中的 ATAF 亚家族。目前，对转录因
子结构域分析的方法比较局限，生物信息学分析是
最常见也是最普遍的方法。
1.2 定点突变分析转录因子结构域的功能位点
定点突变（Site-directed mutagenesis）是在体外
增添、缺失或者替换 DNA 序列中特定碱基的技术，
是分析蛋白质中特定的单个或成簇的氨基酸功能的
一种方法，也是分析转录因子结构域功能的常见方
法。定点突变研究转录因子结构域可在 DNA 水平和
蛋白质水平两个方面进行。DNA 水平进行定点突变
的方法主要有 ：（1）寡核苷酸介导的基因突变，是
指以含有突变碱基的寡核苷酸片段为引物，在 DNA
聚 合 酶 的 催 化 下 启 动 DNA 复 制， 该 方 法 保 真 度
高，但操作复杂且周期长 ；（2）盒式突变，是利用
一段含突变序列的人工合成寡核苷酸片段取代野生
型基因中的相应序列，该方法简单易行且突变效率
高，但需合成多条引物且受到酶切位点的限制 ；（3）
PCR 介导的基因突变，是在基因的 5 和 3 末端产
生突变，PCR 延伸后再利用另一对引物进行重叠延
伸进行基因的定点突变，该方法操作简单突变率高，
但后续工作复杂且 Taq DNA 聚合酶保真性偏低。蛋
白质水平进行定点突变的方法主要有两种 ：丙氨酸
置换法和基团置换法。由于丙氨酸疏水性小，侧链
碳原子少，因此可作为侧链缺失突变的类似物 ；基
团置换法中用带有突出侧链的氨基酸替代野生型残
基的位置，如将 Arg 替换为 Asp，这种方法可以消
除原先的接触，又可在空间或化学上破坏蛋白质之
间的相互作用。Duan 等［8］利用 DNA 定点突变技术
鉴定出 AtWRKY1-C 的 DNA 结合结构域位于 β2 和
2015,31(1) 53宿明星等：植物非生物胁迫相关转录因子研究方法
β3 链上。 Tavares 和 Ling 等［9，10］利用氨基酸定点突
变的方法鉴定 AtMYB30 转录因子的 Cys49 和 Cys53
是亚硝基化作用位点，并且是 DNA 结合域的关键位
点。定点突变的方法能够鉴定转录因子结构域中的
功能位点，是分析转录因子结构域的重要方法。
2 转录因子亚细胞定位分析
真核生物转录过程主要发生在细胞核中，因而
转录因子一般定位在细胞核中，但由于线粒体和叶
绿体中也含有少量的 DNA 和 RNA，转录过程在线
粒体、叶绿体中也有发生，因此转录因子也可能定
位在线粒体或叶绿体中。植物蛋白质亚细胞定位的
研究方法有很多，如融合报告基因定位法，免疫组
织化学定位法，共分离标记酶辅助定位法，蛋白质
组学定位技术等。此外生物信息技术的利用是蛋白
质亚细胞定位预测的常用方法。在植物转录因子的
研究中，生物信息学分析以及融合报告基因定位法
是预测和鉴定转录因子亚细胞定位最常见的方法。
2.1 生物信息学分析转录因子的亚细胞定位
蛋白质的 N 端或 C 端有一段指导蛋白质寻靶
的氨基酸序列，称为信号序列，可以指导蛋白质
的亚细胞定位，如核定位信号（Nuclear localization
signal，NSL）能指导蛋白质定位于细胞核中。因
此根据蛋白质中的信号序列，利用生物信息学分析
可以预测蛋白质的亚细胞定位。主要预测蛋白质亚
细胞定位的软件有 WoLF-PSORT（http ：// wolfpsort.
seq. cbrc. jp/ ）、NNPSL（http ：//predict.sanger.ac.uk.
nnps）、SubLoc（http ：// www.bioinfo.tsinghua. edu.cn/
SubLoc） 和 TargetP（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/
TargetP/），为蛋白质亚细胞定位提供了大量的实验数
据。Puranik 等［11］利用 WoLF-PSORT 预测 SiNAC 转
录因子上存在核定位信号、C 末端存在 α 折叠，预
测 SiNAC 的亚细胞定位位于细胞核和质膜上，经实
验验证 SiNAC 转录因子同时存在于细胞核和质膜上。
生物信息学分析转录因子的亚细胞定位操作简便，
快捷。
2.2 融合报告基因定位法分析转录因子的亚细胞
定位
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）
在 488 nm 的激发光下会发出绿色荧光，将目的转
录因子基因与绿色荧光蛋白基因串联，形成融合表
达载体，基因枪法将表达载体导入洋葱表皮细胞
中，在共聚焦显微镜下通过观察 GFP 的位置，从
而确定转录因子的亚细胞定位。常用的表达载体
有 pEGAD、pCAMBIA1302 等。Puranik 等［11］ 利 用
pCAMBIA1302 载体分别构建 GFP-SiNAC Full length、
缺 失 C 末 端 的 GFP-SiNACΔC1-158 表 达 载 体， 在
CaMV35S 启动子作用下，以 GFP 为对照，基因枪
法瞬时转化至洋葱表皮细胞，融合表达 48 h，共聚
焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的位置，在明场、488
nm 激 发 光 和 DAPI 染 色 下，GFP-SiNAC Full length
定位在细胞膜和细胞核中，GFP-SiNACΔC1-158 定位
在细胞核中（图 1），确定 SiNAC 上存在核定位信号，
C 末端与膜定位密切联系。Liu 等［12］构建 TaPIMP1-
GFP 融合表达载体，基因枪法转化至洋葱表皮细胞，
结果显示 TaPIMP1 蛋白质仅定位在细胞核中，属于
核蛋白。Sun 等［13］亚细胞定位试验表明胁迫相关的
一个 MYB 转录因子定位在细胞核中。本实验室 Li
等［6］构建 GFP-SlNAC1 融合表达载体，基因枪法转
化至洋葱表皮细胞，结果显示 GFP-SlNAC1 定位在
细胞核中 ；Yang 等［7］ 构建 GFP-SlNAC2 融合表达
载体，基因枪法转化至洋葱表皮细胞，SlNAC2-GFP
同样定位在细胞核中。该方法灵敏度高，并且对细
胞无毒害，可广泛利用。由于基因枪瞬间转化设备
十分昂贵，在一定程度上阻碍了该方法的广泛应用，
也可采用农杆菌介导进行转化，但转化效率较低。
3 转录因子转录激活作用分析
转录因子的转录激活活性通常在酵母细胞中进
行检测。常用方法是构建转录激活表达载体，转化
至酵母菌中，在营养缺陷型培养基上培养，能够生
长的酵母菌具有转录激活活性，通过 β-半乳糖苷酶
染色可进一步确定转录因子的转录激活作用。常用
的载体有 pGBKT7、pDBLeu 等。为检验转录因子具
体是哪一段序列具有转录激活活性，可构建多个转
录激活载体。Peng 等［14］为了鉴定 CarNAC5 转录因
子的激活域位置，分别构建了 pDBLeu-F、pDBLeu-N
和 pDBLeu-C 表达载体，以 pDBLeu 为对照，转入酵
母菌 AH109 中，在 His 单缺培养基上仅 pDBLeu-F
和 pDBLeu-C 的酵母菌才能够生长（图 2），β-半乳
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糖苷酶染色表明 CarNAC5 转录因子的激活域位于 C
末端。Sun 等［15］ 根据 AtbZIP1 转录因子上的模体
不同，分别构建 pGBKT7-AtbZIP1，pGBKT7-AtbZ1，
pGBKT7-AtbZ2、pGBKT7-AtbZ3 及 pGBKT7-AtbZ4，
以 pGBKT7-AtDREB1A 作 为 阳 性 对 照， 用 醋 酸 锂
介导法转化将表达载体转化至酵母菌中，在 Trp 单
缺培养基上带有表达载体的酵母细胞均能正常生
长，而在 Trp-His-Ade 三缺培养基上只有 pGBKT7-
AtbZIP1、pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-AtbZ3 能生长，将
酵母菌进行 β-半乳糖苷酶染色，pGBKT7-AtbZIP1 蓝
色最深，转录激活最强 ；pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-
AtbZ3 颜色较浅，活性相对弱，结果显示 AtbZIP1 转
录因子的 N 末端和靠近 C 端的第 92-145 个氨基酸
对转录激活活性是十分必要的。本实验室 Li 等［6］
利用此方法鉴定 SlNAC1 具有转录激活活性，Yang
等［7］鉴定 SlNAC2 具有转录激活活性。该方法简单
易行，无需分离纯化蛋白，且酵母菌属于真核生物，
表达的蛋白质处于自然构象，克服了体外研究蛋白
质时的非自然构象，因而灵敏度高，并便于检测。
该方法的缺点是一方面会出现待鉴定转录因子可能
与酵母内源转录因子相互作用从而激活报告基因表
达的假阳性结果 ；另一方面是酵母菌表达的融合蛋
白对细胞有毒或蛋白不能在细胞中稳定表达而造成
的假阴性结果。
GFP-SiNAC Full lcngth
GFP-SiNAC △C1-158
GFP
A B C D
E F G H
I J K L
Bright field Flourescence DAPI Merge
以 GFP 为阴性对照，共聚焦显微镜观察 GFP-SiNAC 和缺失 C 末端的 GFP-SiNAC ΔC1-158 表达载体在洋葱表皮细胞
中的亚细胞定位 ：A，E，I ：明视野 ；B，F，J ：绿色激发光 ；C，G，K ：DAPI 染色 ；D，H，L ：叠加
图 1 SiNAC 在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析［11］
pDBLeu-F
B
A
YPAD
GAL4 BD
GAL4 BD NAC domain
GAL4 BD NAC domain
GAL4 BD
SD/His
291
158
291
X-Gal
pDBLeu-N
pDBLeu-C
pDBLeu
pDBLeu-C
pDBLeu-N
pDBLeu-F
pDBLeu
A ：CarNAC5 转录激活表达载体构建示意图 ；B ：MV203 酵母菌中 CarNAC5 转录激活活性分析 ：转化后的
酵母分别培养在 YPDA、缺少组氨酸的单缺（SD/His）培养基上 30℃，3 d ；培养半乳糖苷酶染色（X-Gal）
图 2 CarNAC5 转录激活活性分析［14］
2015,31(1) 55宿明星等：植物非生物胁迫相关转录因子研究方法
4 转录因子复合体研究
转录因子作为一种蛋白质，在细胞内并不都
是独立存在、单独发挥作用的，它往往与其他蛋白
质结合，它们在结构上相互作用，最后以复合体的
形式行使功能。鉴定蛋白质与蛋白质之间相互作用
的方法有很多，其中酵母双杂交、双分子荧光互补
以及免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation，Co-
IP）、Pull Down 等方法最常见，此外还有串联亲和纯
化技术、寡沉淀等多种技术。这些方法均可用于植
物转录因子复合体研究。
4.1 酵母双杂交
Fields 和 Song［16］于 1989 年建立酵母双杂交系统，
用于真核生物蛋白质之间相互作用的研究。该方法
是将转录因子的 DNA 结合结构域和转录激活结构域
分别与待研究蛋白质融合表达，若蛋白之间存在相
互作用，则两个结构域在空间上靠近可激活报告基
因的表达（图 3）。郑甲成等［17］利用酵母双杂交技
术以 TaAIDFa 为诱饵，从 cDNA 文库中筛选到 84 个
与 TaAIDFa 相互作用的序列，Blast 比对获得 4 类候
选蛋白，经同源性分析预测与逆境胁迫相关。Li 等［18］
利用酵母双杂交鉴定拟南芥中 RCAR1/PYL9与一个
R2R3-MYB 类型的 AtMYB44 之间具有相互作用，促
进 AtMYB44 转录因子发挥作用。这种方法灵敏度高、
高通量化，但由于酵母菌内源蛋白质可能被激活而
存在着假阳性，且要求待测蛋白为核内蛋白，若在
核外发挥作用不能激活报告基因的表达，导致假阴
性结果。1998 年 Karimova 等、Ladant 等和姜茜等［19-21］
分别于 1998 年、2000 年和 2008 年建立细菌双杂交，
弥补了酵母双杂交的缺陷。
lementation，BiFC）方法是将两个不发光的荧光互补
片段与待测蛋白融合表达，在待测蛋白的相互作用
下，驱动荧光片段重新组装，恢复荧光特性。Li 等
和 Walter 等［18，22］利用 BiFC 方法鉴定出拟南芥中
RCAR1/PYL9 与一个 R2R3-MYB 类型的 AtMYB44 之
间具有相互作用，促进 AtMYB44 转录因子发挥作
用。Grinberg 等［23］利用该技术研究 3 个转录因子家
族 Myc、Max 和 Mad 在活细胞中蛋白质的相互作用，
观察到不同转录因子蛋白间竞争性二聚体的形成。
该技术可检测体内蛋白发挥作用的时间、强度及位
置等，其缺点是存在假阳性和假阴性结果。
4.3 免疫共沉淀
免疫共沉淀是利用抗原-抗体之间特异性识别
并结合的特点来研究体内蛋白质间相互作用的一种
方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互
作用的有效方法。其基本原理是在细胞裂解液中加
入转录因子蛋白的抗体，孵育后加入与抗体特异结
合 的 Protein A 或 G，Protein A 或 G 结 合 于 Agarose
珠上，若细胞中存在与转录因子结合的目的蛋白，
就可以形成“转录因子-抗体 -Protein A 或 G-Agarose
珠-目的蛋白”复合物，变性后经免疫印迹或质谱
检测就可鉴定目的蛋白。Kawarazaki 等［24］利用免疫
共沉淀鉴定 AtSRC2 与 AtRbohF 的 N 末端相互作用。
Weis 等［25］鉴定拟南芥中的 95 个蛋白质与 GFP 相
作用。该方法优点是可以分离天然状态下相互作用
的蛋白质，缺点是对于低亲和力和瞬间的蛋白质—
蛋白质相互作用的复合体可能检测不到，因而可能
存在假阴性。
5 转录因子功能研究
对非生物胁迫相关转录因子功能的分析的方法
很多，包括通过生物信息学构建系统进化树对其功
能进行预测、胁迫条件下鉴定基因表达特性、在基
因缺失和过表达条件下检测植株的表型变化及生理
变化、检测过表达植株基因表达变化分析转录因子
调控的下游效应基因等。综合这些方法，可以对转
录因子功能进行全面的分析。
5.1 构建系统进化树预测转录因子功能
系统进化树已经是公认的一种生物进化模型，
其主要是依据 DNA 或氨基酸的相似度构建的。根
UAS
BD
GAL1-lacZ
? translation
X
Y
AD
AD ：转录激活域 ；BD ：转录结合域 ；X 和 Y ：待研究的转录因子和与其相
互作用的蛋白质
图 3 酵母双杂交原理示意图
4.2 双分子荧光互补
双分子荧光互补（Bimoleeular fluoreseence comp-
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据已知序列在线 Blast 比对的结果，找出与已知基因
相似度较高的相关基因，利用构建生物进化树的软
件，根据亲缘关系大小构建系统进化树，在进化树
中找出与该基因亲缘关系最相近的基因，通过相关
基因文献的阅读，推测已知基因可能具有的功能。
构建系统进化树的方法主要有两大类，距离法和离
散特征法。距离法中有 UPGM、邻接法（Neighbor-
Joining，NJ）等。距离法是根据距离的类聚算法，运
算量不大，但在进化树中无法确定进化分支的时间。
离散特征法根据最优原则不同，可分为最大似然法
（Maximum likelihood，ML）及最大简约法（Maximum
parsimony，MP），这种进化树最大的优点就是树中
有进化的时间。常用构建生物系统进化树的软件有
PHYLIP（http ：//evolution.genetics.washinton.edu/phy-
lip/software.html）、PAUP（ftp ：//onyx.si.edu/paup）、
MEGA（http ：//bioinfo.weizmann.ac.il/ databases/info/
mega.sof） 及 TreeView（http ：//taxonomy.zoology.gla.
ac.uk/rod/treeview.html） 等。Li 等［26］ 将 EsDREB2B
与 来 自 鹰 嘴 豆（Cicer arietinum L.） 中 的 CAP2 有
高达 80% 的相似度，且具有 DREB 转录因子典型
的 缬 氨 酸（V14） 和 谷 氨 酸（E19），EsDREB2B 属
于 AP2/ERF 蛋白亚家族，其他成员还包括 CAP2、
GmDREB2B、OsDREB2B 和 AtDREB2A， 这 几 个 转
录因子均具有抵抗干旱的作用，因此预测了 EsDRE-
B2B 也具有抵抗干旱的作用。Lu 等［27］将 ZmSNAC1
基因序列输入 NCBI 数据库中进行在线 Blast，找出
与 ZmSNAC1 基因相似的序列，利用 ClustalW 软件
将这些相关序列进行多序列比对，同时根据比对结
果构建了系统进化树，结果显示 ZmSNAC1 基因与
OsNAC044、OsSNAC1 基因和的相似度较高，经查阅
文献，OsNAC044、OsSNAC1 基因具有抵抗干旱、高盐、
低温等非生物胁迫的作用，进而推测 ZmSNAC1 基因
也可能具有抵抗非生物胁迫的功能，为后续实验奠
定了基础。Sun 等［28］利用 ClustalW 软件将 ENAC1
与大豆、水稻等多个 NAC 转录因子序列进行比对并
构建了系统进化树，结果显示 ENAC1 转录因子与
OsDREB1A 同源性最高。Liu 等［29］利用系统进化树
将苎麻（Boehmeria nivea L.）中 32 个全长的 NAC 转
录因子与其他物种中的 47 个功能性的 NAC 蛋白同
源关系进行了分析，结果显示这 79 个 NAC 蛋白质
可 分 为 8 组。Cenci 等［30］ 对 香 蕉（Musa acuminata
L.）中的 NAC 转录因子家族进行了全基因组分析，
并构建系统进化树对其亲缘关系进行分析。本实
验室 Li 等［6］构建进化树表明 SlNAC1 与拟南芥中
AtNAC014 亲缘关系最近，通过阅读 AtNAC014 相关
文献，预测 SlNAC1 响应非生物胁迫。Yang 等［7］的
进化树结果显示 SlNAC2 与 PaNAC1 亲缘关系最大，
通过阅读 PaNAC1 相关文献，预测 SlNAC2 响应非生
物胁迫。目前，通过构建系统进化树预测转录因子
功能，这一方法已经十分成熟，操作简单且预测结
果可信度高，但该方法要求转录因子序列中要含有
保守的结构域，否则预测结果将不准确。
5.2 表达特性分析推测转录因子功能
转录因子是否与植物抗逆相关，需要对逆境条
件下转录因子基因的表达特性进行分析。利用半定
量 PCR（RT-PCR）和实时定量 PCR（qRT-PCR）技
术可以检测胁迫条件下转录因子基因在不同组织、
器官中随胁迫时间变化的相对表达量，进而确定转
录因子是否与胁迫相关以及与哪种胁迫相关。Peng
等［31］提取不同时间、不同条件胁迫处理下鹰嘴豆
中 CarNAC3 基 因 的 RNA， 反 转 录 获 得 cDNA， 以
cDNA 为模板利用半定量 PCR 和实时定量 PCR 技术
进行检测，结果表明 CarNAC3 基因在盛开的花朵中
相对表达量高，而在开花后 15 d 的植株的根、茎、
叶中的相对表达量较低。在胁迫条件下，CarNAC3
基因表达量有明显的升高，且在高温 1 h、干旱 12
h、创伤 1 h、水杨酸 12 h、生长素 1 h 等胁迫处理
下的相对表达量最大，因此 CarNAC3 基因与高温、
干旱等非生物胁迫相关。Tian 等［32］分别在低温胁
迫下对红掌中的 AaDREB1、AaWRKY1 和 AaNAC1 等
基因进行半定量 PCR 和实时定量 PCR 分析其表达
量的变化，结果表明随低温处理时间加长，以上基
因的相对表达量上升，有的在 24 h 表达量最高。Hu
等［33］ 利 用 qRT-PCR 技 术 分 别 检 测 杨 树（Populus
trichocarpa）中 25 个 NAC 转录因子在芽尖、叶、韧
皮部、微分化木质部以及根的成熟区和根尖的相对
表达量，表明 NAC 转录因子在不同组织器官中表达
量有明显差异。本实验室 Li［6］利用 qRT-PCR 技术
分析辽宁碱蓬 SlNAC1 基因在非生物胁迫下的表达，
2015,31(1) 57宿明星等：植物非生物胁迫相关转录因子研究方法
SlNAC1 基因受盐、干旱、低温及 ABA 诱导表达，
推测 SlNAC1 基因与响应非生物胁迫有关。Yang 等［7］
利用 qRT-PCR 技术分析辽宁碱蓬 SlNAC2 基因在非
生物胁迫下的表达，SlNAC2 基因受盐、干旱、低温
及 ABA 诱导表达，推测 SlNAC2 基因与响应非生物
胁迫有关。半定量 PCR 和实时定量 PCR 在检测基
因表达特性中应用比较广泛，为研究提供可靠的数
据。该方法中材料 RNA 的提取十分关键，且相对于
RT-PCR，qRT-PCR 检测结果更为准确，对分析鉴定
转录因子抵抗生物及非生物胁迫响应提供重要证据。
5.3 基因缺失表型分析鉴定转录因子功能
基因缺失引起的表型变化最能体现基因的生理
功能。基因功能缺失突变体的获得通常采用插入法
和反义 RNA 抑制法等。插入法将一段 DNA 插入到
目的基因中，使目的基因不表达，包括转座子插入法、
T-DNA 插入法和同源重组插入法。最常使用的是
T-DNA 插入法，T-DNA 是质粒上一段容易转移到其
他基因上的 DNA，插入到基因中使目的基因无法表
达，在拟南芥中应用十分广泛。Lacroix 等［34］利用
T-DNA 插入法破坏 WRKY17 基因，发现 WRKY17 突
变体植株农杆菌更敏感，表明 WRKY17 基因在农杆
菌侵染中发挥积极的作用。Lu 等［35］将 T-DNA 插入
到 ATAF1 基因，破坏其结构，以标签基因 COR47、
ERD10、KIN1、RD22 和 RD29A 的表达量变化检测
ATAF1 的功能，结果显示在干旱胁迫下 ataf1-1 突变
体植株标签基因在 2 h、3 h 和 5 h 相对表达量更高，
证明 ATAF1 转录因子在干旱胁迫中发挥重要的作用。
Paul 等［36］ 检 测 到 插 入 了 T-DNA 的 OsTEF1 水 稻，
降低了 60%-80% 的分蘖，而且出现根部生长阻滞、
对高盐更为敏感。T-DNA 插入法存在其局限性，若
目的基因编码区序列过短，T-DNA 插入的概率较小，
插入到非编码区或内含子中不一定会引起基因表达
的完全缺失，只是使基因表达水平下降。T-DNA 插
入法主要局限性在于植物中有一定数量的基因是多
拷贝的，有的甚至紧密地串联在一起，通常不易获
得纯合突变体。
反义 RNA 抑制技术又称为 RNA 干扰（RNAi）
技术，是将目的基因全部或部分的反向序列转入植
物中，转录时就会与目的基因转录产物按照碱基互
补配对原则形成杂交双链，阻止目的基因的表达，
从而获得功能缺失突变体植株。与 RNAi 相比，人
工 miRNA（Artificial microRNA，amiRNA） 来 源 于
RNA 一个短的茎环，只产生一个单一的小的 RNA，
能更精准的抑制相关靶基因的表达。目前已有 Web
MicroRNA designer（http ：//wmd3.weigelworld.org）和
THE RNAi WEB（http ：//www.rnaiweb.com） 工 具 用
于 amiRNA 的 设 计。Song 等［37］ 为 检 测 OsNAC5 转
录因子对非生物胁迫的响应，利用 RNAi 技术将水
稻中 OsNAC5 基因敲除，与野生型水稻相对照，在
干旱、高盐、冷等胁迫条件下，敲除 OsNAC5 的水
稻植株对胁迫具有更强的抵抗能力。基因缺失表型
分析只适用于模式植物，对于一些非模式植物操作
有困难。
5.4 基因过表达表型分析鉴定转录因子功能
基因功能增加通常采用过表达法，又称超表达
法，是指在目的基因前加一个组成型的强启动子，
如 CaMV 35S 启动子，转化植物，使转录因子在转
基因植物中大量表达，从而促进下游基因的大量表
达，从而改变转基因植物的性状，分析该转录因子
的抗逆功能。Bouaziz 等［38］利用基因过表达的方法
证明，StDREB1 基因的过量表达能提高转基因马铃
薯对盐胁迫的抵抗力，在盐胁迫下植株能健康生长。
Takaskki 等［39］以 CaMV35S 启动子驱动 OsNAC5 转
录因子基因，转化至野生型拟南芥中过量表达，过
表达的拟南芥植株在 250 mmol/L NaCl 溶液胁迫处理
下，比较野生型抵抗力更强，证明 OsNAC5 具有抵
抗高盐胁迫的作用。Xiong 等［40］研究在 OsMYB48-1
基因过表达情况下，水稻增强了对干旱和高盐胁迫
的响应。Yu 等［41］将鹰嘴豆中 CarNAC2 基因过表达，
结果显示过表达转基因拟南芥抗旱能力更强，但对
种子的发芽具有延缓作用。本实验室获得的过表达
SlNAC1 基因拟南芥的盐、干旱、低温耐受性增强［6］、
过表达 SlNAC2 基因拟南芥［7］的抗盐性增强，表明
SlNAC1、SlNAC2 能提高植物抗非生物胁迫的能力。
基因过表达鉴定植物的表型已经得到了广泛的
应用，但也存在着一定的局限性。由于许多转录因
子都是以蛋白复合体的形式行使功能，只过量表达
其中的一个蛋白质，植物一般不会发生明显的表型
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.158
变化，另外，由于有些基因的表达是转录因子和其
他因素共同作用的结果，因此转录因子的过量表达
也并不一定总是引起下游基因的变化。
5.5 下游相关基因分析鉴定转录因子功能
转录因子行使生理功能的过程十分复杂，涉及
转录因子所调控的下游基因和与其相互作用的其他
转录因子，对转录因子下游基因的研究可以进一步
明确转录因子的功能。
5.5.1 染色质免疫沉淀 -DNA 基因芯片分析 染色
质免疫沉淀 -DNA 基因芯片（Chromatin immunopreci-
pitation-gene chip）是研究蛋白质与 DNA 相互作用
的有效方法，可用于转录因子相关靶基因的筛选。
染色质免疫沉淀是在活细胞状态下用甲醇固定蛋白
质 -DNA 复合物，用酶切或超声波将复合物随机切
断并分为一定大小的片段，利用特异性的抗体结合
此复合体上的转录因子使其沉淀，通过水解释放复
合体中的 DNA，即可得到目的 DNA 片段。利用基
因芯片与目的 DNA 进行杂交，可以获得 DNA 序列
信息。Zhu 等［42］利用染色质免疫沉淀 -DNA 基因芯
片相结合的技术成功鉴定拟南芥和水稻中与 BZR1
转录因子直接作用的靶基因。
5.5.2 酵母单杂交分析 酵母单杂交也可以鉴定转
录因子调控的下游相关基因。其原理是将编码待测
转录因子的 cDNA 与 AD 形成融合表达载体并导入
酵母菌细胞中，该基因产物若能与顺式作用原件（cis）
结合，就能激活 Pmin 启动子，使报告基因得以表达，
从而筛选出与已知转录因子相结合的顺式作用元件
（图 4）。酵母单杂交方法是在细胞内分析鉴定转录
因子与 DNA 结合的有效方法，在基因表达调控机制
的研究中是一个很有价值的工具，通过酵母单杂交
可以在大范围内确定蛋白质与 DNA 的相互作用，实
现高通量筛选。该方法虽然能快速分析转录因子的
DNA 结合特性和转录调控特性，但在综合分析其功
能具有一定局限性，因此需要与植株体内功能分析
相配合。
5.5.3 过表达植株基因表达变化分析 利用实时定
量 PCR 分析转录因子基因过表达植株中已知胁迫
相关基因的表达变化，可以分析该转录因子调控的
下 游 基 因。Xiao 等［43］ 利 用 实 时 定 量 PCR 技 术 检
测 PeMYB2 基因过表达拟南芥中与干旱胁迫相关的
NXH1、SOS1、RD29A 和 COR15A 基因表达量有明显
上升，可推测 PeMYB2 基因与 NXH1、SOS1、RD29A
和 COR15A 表达相关。Yu 等［41］研究 CarNAC2 基因
过 表 达 时，RD22、RD29A、COR15A、KIN1 在 干 旱
情况下表达量也明显上升，表明这 4 个基因可能是
CarNAC2 转录因子作用的下游基因。转录因子的超
表达可能使转录因子与不相关启动子中亲和力较低
的结合位点结合，从而激活一些不相关基因的表达，
因此很难估计哪些基因是受目的转录因子的直接调
控，哪些基因受其间接调控。
基因芯片（Gene chip）可以分析转录因子基因
过表达植株中基因表达的变化。构建野生型植株、
转录因子基因过表达植株的基因芯片，通过筛选分
析转录因子基因过表达植株中上调或下调表达的基
因，经 qRT-PCR 验证后，确认转录因子调控的下游
基因。
6 展望
转录因子在植物生长发育以及抵抗非生物胁迫
方面发挥着重要作用。对转录因子进行深入、细致
的研究，更好地理解转录因子的结构和功能显得尤
为重要。随着生物技术的不断发展，转录因子的研
究方法将不断丰富，将极大推动植物非生物胁迫相
关转录因子的研究。
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X
TF
AD
Pmin ᣕ੺สഐ◰⍫䖜ᖅX X
AD ：转录激活域 ；TF ：已知转录因子 ；X ：待测顺式作用元件 ；
Pmin ：最小启动子
图 4 酵母单杂交分析原理示意图
2015,31(1) 59宿明星等：植物非生物胁迫相关转录因子研究方法
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（责任编辑 狄艳红）