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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于人类疱
疹病毒 γ 亚科，具有较强传染性和潜伏感染的特点。
该病毒在裂解期主要表达立早蛋白、早期蛋白和晚
期蛋白 3 种蛋白［1］。有研究报道［2］，鼻咽癌的发生
发展和 EB 病毒感染密切相关，在鼻咽癌病人血清
中可以检测到 EB 病毒相关抗体。由于不同感染状
态下 EBV 表达的抗原各不相同，因此研究者常通过
收稿日期 ：2013-12-24
基金项目 ：河南科技攻关资助项目（132201310001）
作者简介 ：王云龙，男，教授，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：biowyl@126.com
EB 病毒融合蛋白 Zta-P54 在大肠杆菌中的表达、
纯化及鉴定
王云龙1，3  张春艳1  李玉林3  程蕾3  王继创3  邓黎黎2  米海3  白晓静2
（1. 郑州大学生物工程系，郑州 450001 ；2. 郑州职业技术学院，郑州 450046 ；3. 河南省生物工程技术研究中心，郑州 450001）
摘 要 ： 为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的 EB 病毒融合蛋白，以 pGEX5T-BZLF1-BMRF1 质粒为模板进行 PCR
扩增得到 BZLF1-BMRF1 融合基因，将其插入 pET32a 中，构建表达质粒 pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养，经
IPTG 诱导获得 Zta-P54 融合蛋白。用 DEAE-Sepharose CL-6B 和 Ni-NTA 亲和层析纯化，并通过 SDS-PAGE 和 Western blot 对 Zta-P54
融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建 pET32a/BZLF1-BMRF1 质粒，SDS-PAGE 显示该蛋白相对分子量约为 60
kD，与预期结果一致。纯化后获得纯度为 96.5 % 的 Zta-P54 融合蛋白。Western blot 检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此，
成功构建 pET32a/BZLF1-BMRF1 质粒，在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。
关键词 ： EB 病毒 Zta-P54 融合蛋白 原核表达 蛋白纯化
Expression，Purification and Identification of Zta-P54 Fusion Protein in
Escherichia coli of Epstein-Barr Virus
Wang Yunlong1，3 Zhang Chunyan1 Li Yulin3 Cheng Lei3 Wang Jichuang3 Deng Lili2 Mi Hai3 Bai Xiaojing2
（1. Bioengineering Department，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 ；2. Zhengzhou Technical College，Zhengzhou 450046 ；
3. Henan Biotechnology Research Center，Zhengzhou 450001）
Abstract:  It was to obtain high purity and active epstein-barr virus fusion protein and use for detection kit. The fragments of BZLF1-
BMRF1 amplified by PCR from pGEX5T-BZLF1-BMRF1 was inserted into expression vector pET32a, and the recombinant plasmid pET32a-
BZLF1-BMRF1 was transformed into E. coli, which was induced to express by IPTG. The expression protein Zta-P54 was purificated by DEAE
Sepharose CL-6 B and Ni -NTA affinity chromatography then analysed by SDS-PAGE and immunoreactivity was proved by western blotting.
Double endonuclease digestion and DNA sequencing results showed that sequencing results constructed successfully. SDS-PAGE showed that
the protein was soluble expressing. The expression product Zta-P54 with the moleculor weight 60 kD was located in the cytoplasm and soluble.
Expression Protein, s purity was 96.5%. Western blotting showed that frusion protein Zta-P54 possessed a well bioactivity and specificity.
Therefore, It proved that the pET32a/BZLF1-BMRF1 plasmid can effectively express in E. coli.
Key words:  EB virus Zta-P54 fusion protein Prokaryotic expression Protein purification
基因工程或人工合成多肽等方法获得 EB 病毒抗原，
作为临床辅助诊断的依据［3］。
BZLF1 编码的 Zta 立早蛋白可促使 EB 病毒从
潜伏状态进入增殖状态，且 Zta 有较好的抗原性［4］，
可用于鼻咽癌的诊断及预测。另外，有研究报道［5］，
BMRF1 编码的 P54 蛋白是 EB 病毒的早期蛋白，以
EB 病毒早期抗原（包括 P54 蛋白）作为抗原基质建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期174
立 ELISA 法，检测血清中相应抗体，对鼻咽癌诊断
有好的特异性和敏感性。Dardari 等［6］和 Chan 等［7］
的报道及 Chan 等［8］在世界卫生组织肿瘤组织学分
类一书中的观点，均认为血清学方法诊断鼻咽癌，
采用几种抗原联合检测能显著提高特异性和敏感度。
为探讨可溶性多抗原联合检测在血清学诊断鼻
咽癌中的价值，本研究尝试用 pET32a 作为表达载体，
纯化 Zta-P54 融合蛋白作为诊断抗原，以期为后期
该蛋白的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质 粒 和 宿 主 菌 pGEX5T-BZLF1-BMRF1 质
粒、表达菌 BL21（DE3）由河南省生物工程技术研
究中心提供，表达载体 pET32a 购自 Novagen 公司。
1.1.2 引物设计 根据 pGEX5T-BZLF1-BMRF1 测序
结果，应用 Primer 5.0 软件设计引物，引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
上 游 ：5-GGAATTCCATATGGATCCGAACTCTA
CTTCTG-3（下划线为 Nde Ⅰ酶切位点）；
下游 ：5-CCGCTCGAGGATCAGTGGATTAAATG
CCTGC-3（下划线为 Xho Ⅰ酶切位点）。
1.1.3 主要试剂 异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷（IPTG）
购 自 Sigma 公 司 ；蛋 白 Marker、Taq 酶、dNTPs、
DNA Marker、T4 DNA 连接酶购自天根生化科技（北
京）有限公司 ；鼻咽癌患者的血清取自郑州大学
第一附属医院 ；限制性内切酶 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ购自
New England Biolabs 公司 ；DNA 胶回收试剂盒购自
宝生物公司，Ecl 化学发光试剂盒购自 PIERCE 公司，
PVDF 转印膜购自 PALL 公司，其他试剂均为国产分
析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 目的基因扩增及原核表达载体的构建 根
据所设计引物，建立 30 μL PCR 反应体系 ：（5 ×
buffer，6 μL ；MgCl2，1 μL ；dNTP，0.3 μL ；上游引
物，0.2 μL ；下 游 引 物，0.2 μL ；Taq 酶，0.5 μL ；
模 板，0.5 μL ；ddH2O，21.3 μL）， 反 应 条 件 ：95℃
5 min ；95℃ 1 min ；60℃ 35 s ；72℃ 1.5 min ；40 个
循环，72℃ 5 min。将扩增产物与 pET32a 载体分别
经 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，1.0 % 琼脂糖凝胶电
泳，切取目的基因条带，用 DNA 胶回收试剂盒分别
回收目的片段和载体片段。由 T4 DNA 连接酶 16℃
过夜连接双酶切产物，构建重组质粒 ；将重组质粒
转入宿主细胞 BL21（DE3）中，涂布于固体 LB 培
养基中（含 Amp），37℃过夜培养。挑取阳性克隆
菌落培养至 OD 值 0.6 左右，提取质粒，将提取质粒
经 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，酶切正确的产物送
至上海生工测序，将测序正确地质粒命名为 pET32a/
BZLF1-BMRF1。
1.2.2 重组蛋白诱导表达条件优化 挑取阳性菌落，
接种于 3.5 mL LB 液体培养基（含 Amp）中，37℃
条件下过夜培养，次日取菌液 100 μL 转接到含有氨
苄抗生素的 3.5 mL LB 培养基中。当培养至 OD600 约
为 0.5-0.6 时， 加 入 IPTG 诱 导， 以 空 载 体 pET32a
作为对照。根据实验室的经验，同时对菌体进行温度、
诱导剂浓度、诱导时间等条件的优化，对不同表
达条件的菌体进行 SDS-PAGE 鉴定，选取最优表达
条件。
1.2.3 表达菌体的纯化前期处理 取稳定表达的菌
种 1 mL 接种到 1 L 的 LB 液体培养基（含 Amp）中，
在最佳条件下诱导表达，离心收集菌体。用 pH7.8
6 mol/L 尿素重悬菌体，冰浴条件下超声破碎。离心，
取上清进行饱和硫酸铵沉淀，离心，取沉淀透析出
去硫酸铵，用 pH 7.8 6 mol/L 尿素溶解沉淀。将处理
过的菌液进行 DEAE-Sepharose CL-6B 和 Ni-NTA 亲
和层析纯化。采用紫外分光光度计测定纯化蛋白的
含量，按以下公式计算蛋白浓度 ：
蛋白浓度（mg/mL）= A 280×1. 45-2 A260×0. 74。
1.2.4 融合蛋白 Zta-P54 的 DEAE-Sepharose CL-6B 纯
化 柱床体积 40 mL（3.5 × 4 cm）pH8.8 50 mmol/L
的 Tris-HCl，4 mol/L 的尿素平衡柱子，用 5 倍柱体积
的 0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L NaCl，pH8.8 50 mmol/L
的 Tris-HCl，4 mol/L 的尿素进行线性梯度洗脱，流
速 1.5 mL/min，收集样品进行 SDS-PAGE 检测。并
通过 Photoshop 分析蛋白灰度并计算蛋白纯度。
1.2.5 融合蛋白 Zta-P54 的 Ni-NTA 亲和柱纯化 将
DEAE-Sepharose CL-6B 柱 纯 化 的 最 佳 洗 脱 蛋 白 经
AKTAPrime plus 纯 化 仪 泵 入 Ni-NTA 亲 和 柱 纯 化，
柱 床 体 积 25 mL（2.5×5 cm）pH8.8 50 mmol/L 的
Tris-HCl，4 mol/L 的尿素平衡柱子，用 5 倍柱体积
2014年第7期 175王云龙等 ：EB 病毒融合蛋白 Zta-P54 在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
的 20、50、100、200 mmol/L 咪唑，pH8.8 50 mmol/L
的 Tris-HCl，4 mol/L 的尿素进行线性梯度洗脱，流
速 1.5 mL/min，收集样品进行 SDS-PAGE 检测。分
析蛋白灰度并计算蛋白纯度。
1.2.6 Western blot 检测蛋白特性 相同上样量的前
期试验纯化的包涵体融合蛋白 Zta-P54 和本试验纯
化后融合蛋白 Zta-P54，经 SDS-PAGE，切胶转膜处
理， 用 10 mg/L 的 BSA 封 闭 2 h。PBST 洗 涤 4 次。
加入鼻咽癌患者阳性血清为一抗阳性对照，空质粒
为阴性对照，37℃温浴 1.5 h，PBST 洗膜 4 次。加
入 HRP 标记的鼠抗人 -IgG 作为二抗，37℃温浴 2 h，
PBST 清洗后，再用蒸馏水清洗，然后加入 Ecl 化学
发光显色液显色 5 min，暗室曝光 1 min，显影 1 min
定影 6 min，最后结果分析并拍照记录。
2 结果
2.1 重组基因的核酸电泳鉴定
将扩增产物 BZLF1-BMRF1 和重组质粒 pET32a/
BZLF1-BMRF1 酶切产物进行 1 % 琼脂糖电泳分析，
结果见图 1，图2。
由图 1 可以发现约在 1 600 bp 处的目的条带，
其大小与预期结果相符合 ；图 2 显示 NdeⅠ、XhoⅠ
双酶切前有一较亮的质粒条带，质粒双酶切后可以
看出约 1 600 bp 处目的条带，与预期结果相符。
2.2 融合蛋白Zta-P54诱导表达条件优化
对菌体进行温度、诱导剂浓度、诱导时间等表
达条件的优化，并进行 SDS-PAGE 鉴定。
重组的质粒经不同 IPTG 浓度诱导，电泳检测
诱导表达结果，通过灰度分析，显示在 IPTG 浓度为
0.2 mmol/L 时蛋白表达量最高，见图 3，图 4。
M21
bp
2000
1000
750
500
250
100
1，2 ：PCR 产物 BZLF1-BMRF1 扩增 ；M ：DNA Marker DL2000
图 1 BZLF1-BMRF1 PCR 扩增
M 21
bp
2000
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 质粒 ；
2 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 酶切产物经 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ双酶双酶切
图 2 重组质粒酶切鉴定
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
1 2 3 4 5 6 7 M
1-5：pET32a/BZLF1-BMRF1 IPTG 浓度（0.1，0.2，0.5，1.0，1.5 mmol/L）优化；
6 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 未诱导 ；7 ：pET-32a 未诱导 ；M ：蛋白质 Marker
图 3 IPTG 优化电泳检测
0.1
IPTG⎃ᓖmmol/L050001000015000㳻ⲭᶑᓖ⚠ᓖ٬ 0.2 0.5 1.0 1.5
图 4 IPTG 灰度分析图
重 组 的 质 粒 在 37℃ 条 件 下，IPTG 浓 度 为 0.2
mmol/L 时，改变诱导时间，经电泳检测并对电泳结
果进行灰度分析，结果发现诱导 6 h 时蛋白表达量
最高见，图 5，图 6。
IPTG 浓度为 0.2 mmol/L 时，通过改变诱导温度
发现 37℃条件下诱导 6 h 时蛋白表达量最高见图 7，
图 8。
综上所述，条件优化后，最终得到最佳诱导表
达条件为 37℃，0.2 mmol/L IPTG 诱导 6 h 蛋白表达
量最高，蛋白分子量约为 60 kD，与预期结果一致。
2.3 融合蛋白的可溶性分析及蛋白纯化
将重组质粒在最佳条件下诱导表达、收集菌液、
离心菌体、破菌、分上清和沉淀电泳分析蛋白可溶
性，发现该蛋白在大肠杆菌中可溶性表达（图 9）通
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期176
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
M 1 2 3 4 5
M ：蛋白质 Marker ；1 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 未诱导 ；2-5 ：pET32a/
BZLF1-BMRF1 不同时间诱导（2 h，4 h，6 h，8 h）优化
图 5 诱导时间优化电泳检测
2 ᰦ䰤h0200040006000800010000㳻ⲭᶑᓖ⚠ᓖ٬ 4 6 8
图 6 时间灰度分析
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
M 1 2 3 4 5 6
M ：蛋白质 Marker ；1 ：pET32a 未诱导 ；2 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 未诱导 ；
3-6 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 不同温度诱导（25、30、37、40℃）优化
图 7 诱导温度梯度优化电泳检测
25 ⑙ᓖć02000400060008000㳻ⲭᶑᓖ⚠ᓖ٬ 30 37 40
图 8 温度灰度分析
过 DEAE-Sepharose CL-6B 和 Ni-NTA 亲和层析纯化，
经 SDS-PAGE 和 Photoshop 进行灰度分析（图 10）。
由图 9 显示目的蛋白 Zta-P54 主要以可溶性的
形式存在 ；经 SDS-PAGE 和 Photoshop 软件灰度分
析发现（图 10）通过 DEAE 柱纯化后 Zta-P54 蛋白
的总灰度为 9 730，总条带灰度为 12 139，计算得出
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
M1 2
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
M 1 2 3
1 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 沉淀 ；2 ：pET32a/BZLF1-BMRF1
上清 ；M ：蛋白质 Marker
图 9 重组蛋白 Zta-P54 可溶性表达电泳
M ：蛋白质 Marker ；1 ：pET32a/BZLF1-BMRF1 ；2 ：pET32a/
BZLF1-BMRF1 DEAE 柱纯化 ；3 ：Ni-NTA 亲和柱纯化
图 10 重组蛋白 Zta-P54 的纯化
蛋白纯度 80 % ；经 Ni-NTA 亲和柱纯化后蛋白的总
灰度为 27 435，总条带灰度为 28 441，计算得出蛋
白纯度 96.5 %，采用紫外分光光度计法测定纯化后
蛋白总量为 18 mg，即 1 L 菌液可以纯化得到 18 mg
Zta-P54 融合蛋白。
2.4 Western blot结果分析
通过 Western blot 检测融合蛋白 Zta-P54 免疫原
性及反应特异性，表达产物 Zta-P54 为阳性对照，空质
粒为阴性对照，加入鼻咽癌患者阳性血清反应，结
果见图 11，图 12。由图 11，图 12 可知，融合蛋白
Zta-P54 与鼻咽癌患者阳性血清混合反应后，在 60
kD 出现特异性反应带 ；而空载质粒 pET32a 相应位
置没有条带出现，且可溶性 Zta-P54 融合蛋白较包
涵体 Zta-P54 融合蛋白有更好的反应特异性。
3 讨论
EB 病毒作为一种嗜 B 淋巴细胞的人类疱疹病
毒，它与鼻咽癌、Burkitt 淋巴瘤、单核细胞增多症
等疾病的发生密切相关。目前广东地区鼻咽癌的发
病率较高，且已经成为一种较典型的地方性恶性肿
瘤疾病，所以鼻咽癌的早期诊断尤为必要，其中用
EB 病毒抗原检测病人血清中的抗 EB 病毒的抗体用
2014年第7期 177王云龙等 ：EB 病毒融合蛋白 Zta-P54 在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
0
40000
30000
20000
10000
50000
W
es
te
m
b
lo
tᶑᑖ⚠ᓖ٬ व⏥փZta-P54㳻ⲭ ਟⓦᙗZta-P54㳻ⲭ
来筛查鼻咽癌这一疾病的研究备受关注［9］。目前，
随着分子生物学与免疫学技术的发展，已经有多种
EB 病毒抗原通过基因工程表达和人工合成的方式被
纯化出来，并且用作诊断抗原进行了 ELISA 法、化
学发光免疫分析法等方法的研究［10，11］，这些单个诊
断抗原虽然提高了特异性，但敏感度还不够。因此，
可以应用多种 EB 病毒抗原联合检测，不但可拓宽
了抗体反应谱，还可以提高 ELISA 法的敏感度［12］。
目前，张毅等［13］报道所表达的 EB 病毒融合
抗原多以包涵体形式表达。为提高蛋白活性，本研
究选择抗原性较好的立即早期蛋白 Zta 和早期蛋白
P54 融合表达。由于前期研究发现 pGEX5T-BZLF1-
BMRF1 载体所表达的 Zta-P54 蛋白为包涵体［14］，所
以更换 pET32a 作为表达载体，该载体带有的 Trx 标
签是高度可溶性多肽，增强了目的蛋白的可溶性。
同时，本研究所选序列引入有一段 24 bp 的连接肽，
它编码的氨基酸为 GGGGSGGG，其中甘氨酸没有手
性碳原子，柔性较好，在融合蛋白之间不会影响两
边蛋白各自的构象和功能 ；而丝氨酸是亲水性最强
的氨基酸，可以提高融合蛋白的亲水性。将两种氨
基酸串联起来作为连接肽可以保持两蛋白原有的生
物活性。通过优化诱导温度、时间、诱导剂浓度等
条件，实现了 Zta-P54 的可溶性表达。Western blot
检测发现可溶性蛋白较包涵体蛋白反应特异性性强，
克服了包涵体蛋白活性低的缺点。试验发现在温度
为 37℃、诱导时间 6 h、IPTG 浓度 0.2 mmol/L 的条
件下目的蛋白表达量最高。试验过程发现该蛋白较
易降解，所以纯化前用 6 mol/L 尿素处理菌体及饱和
硫酸铵沉淀目的蛋白。这一过程既除去了部分杂蛋
白又有效的减缓了融合蛋白 Zta-P54 的降解。最后，
通过 DEAE-Sepharose CL-6B 和 Ni-NTA 亲和层析纯
化，得到纯度高达 96.5% 的 Zta-P54 融合蛋白，收
率可达到 18 mg/L。Western blot 检测表明该蛋白可
与鼻咽癌患者血清中相应抗体发生特异性结合，有
良好的免疫原性及反应特异性。Zta-P54 蛋白是我们
表达的一种全新的两抗原融合蛋白，将该蛋白应用
到鼻咽癌早期诊断和筛查中将会有更好的敏感度和
特异性，可降低鼻咽癌的漏诊率，且可利用原核表
达方法快速、大量生产该蛋白。
4 结论
本试验成功纯化得到可溶性、高纯度的融合蛋
白 Zta-P54，且该蛋白有较好的免疫原性，Zta-P54
融合蛋白在 EB 病毒相关疾病的诊断上将具有良好
的临床应用前景。
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图 12 Western blot 灰度分析
1 ：阴性对照（pET32a）；2 ：包涵体 Zta-P54 蛋白 ；3 ：可溶性 Zta-P54 蛋白
图 11 Western blot 检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期178
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（责任编辑 李楠）