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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
RNA 干 扰（RNA interference，RNAi） 是 指 内
源或外源双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）
诱导的靶基因转录后沉默的现象，在 1998 年由 Fire
等人首次证实［1］。随后 RNAi 被广泛用于基因功能、
基因治疗研究等多个领域。在昆虫中，RNAi 首先
被用于研究模式昆虫果蝇［2］，随后在鳞翅目、鞘翅
目、直翅目、膜翅目等多种昆虫中得到广泛应用［3］。
收稿日期 ：2014-01-18
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31360527），新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题（XJDX0201-2014-03）
作者简介 ：石萌，女，硕士研究生，研究方向 ：昆虫分子生物学 ；E-mail ：12721464@qq.com
通讯作者 ：马纪，博士，教授，研究方向 ：昆虫低温分子生物学 ；E-mail ：majiuci@xju.edu.cn
利用细菌表达 dsRNA 介导黄粉虫抗冻蛋白基因的
RNA 干扰
石萌  刘小宁  马纪
（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要 ： RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是研究基因功能的一种重要工具。为了利用 RNAi 技术对黄粉虫抗冻蛋白
（Antifreeze protein，AFP）基因的非抗冻功能进行验证，将黄粉虫抗冻蛋白基因 Tmafp433 的相应干扰片段构建至 L4440 干扰载体
并转化大肠杆菌 HT115（DE3）菌株，利用 IPTG 诱导表达特异的 afp 基因相应 dsRNA，纯化后注射黄粉虫幼虫，通过实时荧光定
量 PCR 检测 afp 基因在 mRNA 水平的变化。结果显示含有 L4440-Tmafp 重组质粒的 HT115 菌株可以表达干扰 afp 基因的 dsRNA，
命名为 Tmafp-dsRNA。用 Tmafp-dsRNA 注射黄粉虫 24 h 后，Tmafps 的表达受到显著抑制，相比对照下降了 60.8%。本研究表明通
过注射 dsRNA 可有效抑制黄粉虫 afp 基因的表达。
关键词 ： 黄粉虫 抗冻蛋白基因 RNA 干扰 双链 RNA L4440 载体
RNA Interference of Antifreeze Protein Gene in Tenebrio molitor
Mediated by Bacterially Expressed dsRNA
Shi Meng Liu Xiaoning Ma Ji
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，
Xinjiang University，Urumqi 830046）
Abstract:  In order to further study the non-freezing function of antifreeze protein（AFP）genes in Tenebrio molitor using RNAi
technology, the RNAi fragment of Tmafp433 from T. molitor was inserted into L4440 dsRNA expression vector, and transformed into E. coli
HT115（DE3）. The dsRNA corresponding to Tmafps, designated as Tmafp-dsRNA, was expressed by IPTG induction, and injected into the
larvae after purification. The mRNA level of Tmafps was detected using real-time quantitative PCR. The results showed that the E. coli HT115
（DE3）containing L4440-Tmafp recombinant plasmid can express Tmafp-dsRNA. After 24 h of injection, the expression of Tmafps in T. molitor
was significantly decreased to 60.8% of the control, suggesting that the expression of Tmafps was inhibited by injecting the bacterially expressed
Tmafp-dsRNA. The present results laid foundation for further research in afp gene function.
Key words:  Tenebrio molitor afp gene RNA interference Double-stranded RNA L4440 vector
RNAi 可作为一种有力的工具来研究昆虫基因功能或
进行害虫控制。
进行 RNAi 的方式可分为细胞内 RNAi 和细胞
外 RNAi［4］。细胞内 RNAi 多通过浸染、电穿孔或
显微注射的方式将 dsRNA 直接导入细胞 ；而细胞外
RNAi 则通过浸泡、饲喂或注射进行 dsRNA 的递送，
需要依靠细胞摄取 dsRNA。利用 RNAi 技术研究昆
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期114
虫基因功能多以饲喂混有 dsRNA 的人工饲料［5］或
注射 dsRNA［6］的方式进行。饲喂方法简便，成本低，
但由于多数昆虫对饲喂的 dsRNA 不敏感，不能诱发
RNAi 效应，如东亚飞蝗（Locusta migratoria）［7］等。
注射法直接将 dsRNA 注入昆虫的血腔中，进而诱发
RNAi，因此普遍用于昆虫基因功能的研究［3，8］。对
鞘翅目昆虫多采用幼虫注射法导入体外转录合成的
dsRNA。通过将目的基因的干扰片段构建至 L4440
dsRNA 表达载体后转化 RNase-III 缺陷型的大肠杆
菌 HT115（DE3）菌株，可诱导表达相应的 dsRNA。
王根洪等［9］通过提取细菌表达的 dsRNA 注射家蚕
（Bombyx mori），成功实现了对 FTZ-F1 基因的 RNA
干扰。
抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）是一类能
抑制冰晶生长的特殊蛋白质。它可降低溶液的冰点，
而不改变熔点，导致熔点和冰点之间出现差值，即
热滞活性［10］，从而增强昆虫的耐寒性。抗冻蛋白
具有抑制重结晶、维持体液过冷却等多种功能。然
而，我们的前期研究发现，鞘翅目拟步甲科的小胸
鳖甲抗冻蛋白具有热保护作用［11］，高温和干旱都能
诱导该基因的表达。因此，抗冻蛋白除了具有抑制
冰晶生长的功能外，可能还具有其他非抗冻的保护
功能，为了全面研究抗冻蛋白的功能，本研究以同
为拟步甲科的黄粉虫（Tenebrio molitor）为研究对象，
利用其饲养成熟、来源丰富、抗冻蛋白热滞活性高
的特点，构建基因干扰载体，转化大肠杆菌，诱导
表达 dsRNA，然后注射黄粉虫，结果显示所设计的
dsRNA 能够干扰黄粉虫 afp 基因的表达，为进一步
验证 afp 基因的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试虫来源 黄粉虫购自乌鲁木齐市南园花卉
市场，饲养于恒温光照培养箱内。饲养温度（25±
0.5）℃， 相 对 湿 度（30±6）%， 光 周 期 16L∶8D。
以麦麸为主要饲料，2 d 喂食一次卷心菜叶补充水分。
1.1.2 主要试剂 SYBR Green Supermix kit、TRizol
试 剂 购 自 Invitrogen 公 司，Taq 酶、DNase I、dNTP
Mixture、RNase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse
Transcriptase M-MLV（RNase H-）、DNA Marker、
pMD18-T、T4 连接酶、限制性内切酶等均购自宝生
物工程（大连）有限公司（TaKaRa），SanPrep 柱式
质粒 DNA 小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒及 DEPC
购自上海生工生物工程股份有限公司，感受态细
胞菌种 DH5α 购自北京全式金生物技术有限公司，
L4440 载体和大肠杆菌 HT115 菌株为本实验室保藏，
其余试剂为国产分析纯。引 物 合 成 和 测 序 由上
海生工生物工程股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 黄粉虫抗冻蛋白基因干扰载体的构建 根
据 黄 粉 虫 抗 冻 蛋 白 基 因 Tmafp433（GenBank 号
AF160497）序列，利用 Primer5.0 软件设计扩增 afp
基因的 RNA 干扰片段（408 bp）的引物，上下游引
物分别带有 Bgl II 和 Pst I 酶切位点。序列分别为 afp
F1 ：AGATCTTGGTTAATTATAGCAGTTATCGTTATG
TG ；afp R1 ：CTGCAGTCCGGGACATCCTGTT（下划
线表示添加的酶切位点）。以前期构建的 pMD18-T-
Tmafp433 质粒为模板，进行 PCR 扩增，反应条件为：
94℃ 5 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35 个
循环 ；72℃ 10 min ；产物在 4℃保存。1% 琼脂糖凝
胶电泳检测并回收 PCR 扩增产物（记为 Tmafp 片段），
连接 pMD18-T 载体，连接产物转化 DH5α 感受态细
胞后，涂布含有氨苄青霉素的 LB 固体培养基平板，
37℃培养 12 h 后，挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素
的 LB 液体培养基中培养，然后进行菌液 PCR 鉴定；
并提取重组质粒用 Bgl II 和 Pst I 进行酶切鉴定，将
鉴定正确的 pMD18T-Tmafp 重组子送至上海生工生
物工程股份有限公司进行测序验证。将鉴定正确的
pMD18T-Tmafp 重组质粒与 L4440 干扰载体分别同时
用 Bgl II 和 Pst I 进行双酶切，回收目的片段，用 T4
连接酶于 16℃连接，获得 L4440-Tmafp 重组质粒，
然后转化 DH5α 感受态细胞。挑取阳性单克隆于 LB
含有氨苄青霉素的液体培养基中培养，并进行菌液
PCR 及质粒双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒进
一步测序验证。将 L4440-Tmafp 重组质粒转至采用
CaCl2 法制备的 HT115 感受态细胞中，在氨苄青霉
素和四环素抗性的 LB 固体培养基上筛选阳性克隆，
并通过 PCR 及双酶切进行鉴定。构建过程如图 1
所示。
2014年第8期 115石萌等 ：利用细菌表达 dsRNA 介导黄粉虫抗冻蛋白基因的 RNA 干扰
组，每头幼虫注射 5 μL PBS 缓冲液 ；第 4 组不作
任何处理。RNAi 后于正常条件下继续饲养，统计
各组黄粉虫幼虫的死亡率。注射 24 h 后 TRIzol 法
提 取 各 组 黄 粉 虫 的 总 RNA， 并 反 转 为 cDNA， 通
过 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 黄 粉 虫 afp 基 因 的 表
达。每组设置 3 个平行，每个平行取 2 只幼虫提取
RNA。黄粉虫 afp 基因实时荧光定量 PCR 引物为 ：
afpF2 ：AGCAGTTATCGTTATGTGTTTGTGT ；afpR2 ：
GGTACACGTTATTGCATTTGGAC ；以黄粉虫 18S 基
因作为内参基因，实时荧光定量 PCR 引物为 ：18S
F ：TCAGATACCGCCCTAGTTCTAACCA ；18S R ：
TCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGC。 实 时 荧 光 定
量 PCR 反 应 按 带 有 ROX 的 Platinum SYBR Green
qPCR SuperMix-UDG 的使用说明进行。取等量 cDNA
进行 PCR 反应，每个样品重复 3 次。于 GeneAmp
Thermal Cycler 7500 中进行实时荧光定量 PCR 反应，
程 序 为 ：50℃ 2 min ；95℃ 3 min ；95℃ 10 s，58℃
30 s，72℃ 30 s，40 个循环。
1.2.4 数 据 分 析 基 因 相 对 表 达 量 的 计 算 采 用
2-ΔΔCT 法。afp 基因表达量是与内参基因相比的相对
表达量，并以未处理的对照组进行归一化处理。采
用医学生物统计学软件 GraphPad Prism 4.0 中的单因
素方差分析和 Turkey 多重比较分析数据。
2 结果
2.1 黄粉虫抗冻蛋白基因干扰载体的构建
2.1.1 含有 Bgl II 和 Pst I 酶切位点的 Tmafp433 基因
干扰片段的克隆 黄粉虫抗冻蛋白基因存在众多亚
型，编码小分子蛋白质，基因序列较短。考虑到长片
段 dsRNA 比短片段 dsRNA 更容易诱发 RNAi［14，15］，
因此选择序列相对较长的 Tmafp433 基因。Tmafp433
基因的 ORF 序列长度为 447 bp，编码 148 个氨基酸，
含有 7 个拟步甲科昆虫抗冻蛋白特有的“TCTXSXX-
CXXAX”重复序列。通过在线预测（http ：//bioinfo.
clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesign.do） 潜
在的 RNAi 靶序列发现在其 33-423 bp 的位置存在
22 个可能的干扰靶位点，所以选择了包含这些潜在
靶位点的 408 bp 序列作为干扰片段。
以前期构建的 pMD18T-Tmafp433 质粒为模板，
用 afp F1/F2 引物 PCR 扩增预期大小为 420 bp 的片段。
lacZ a
T7 promoter
T7 promoter
L4440
2790 bp
L4440-Tmafp
Bgl II/Pst Iৼ䞦࠷ˈ䘎᧕
Pst I
Pst I
Tmafp
Bgl II
Bgl II
lacZ a
T7 promoter
T7 promoter
Pst I159
Tmafp408 bppMD18-T-Tmafp Bgl II47
图 1 Tmafp433 基因干扰载体的构建
1.2.2 黄粉虫抗冻蛋白基因 dsRNA 的诱导表达及
纯化 试验以果蝇白眼基因的 dsRNA（片段大小为
421 bp） 作 为 无 关 dsRNA 对 照（ 记 为 W-dsRNA），
其干扰载体为实验室前期构建，经 PCR 及酶切鉴定
后，活化菌种直接诱导表达。参照胡有燕［12］、王根
洪等［9］的方法原核表达 W-dsRNA 和 Tmafp-dsRNA，
并 对 表 达 条 件 进 行 优 化。 将 携 带 L4440-Tmafp 及
L4440-W 质粒的 HT115 菌液接种于氨苄青霉素和四
环素抗性的 LB 液体培养基中，37℃过夜培养 12 h 后，
按 1% 接种于液体培养基中，37℃振荡培养菌液至
OD600=0.4 左右，加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG 诱
导表达。37℃振荡培养 4 h 后，于 4℃，4 000 r/min
离心 3 min，收集菌体，采用 TRIzol 法提取细菌总
RNA。1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 细 菌 总 RNA。 然
后分别利用 DNaseI 和 RNaseA 消化细菌总 RNA 各
30 min［13］，再用三氯甲烷抽提，异丙醇沉淀，75%
乙醇洗涤后晾干，溶于 DEPC 处理水中，并利用
NanoDrop ND-1000 分光光度计（NanoDrop Technolo-
gies，Wilmington，USA）检测 dsRNA 浓度。-80℃保
存备用。
1.2.3 黄粉虫抗冻蛋白基因的 RNA 干扰 选取生
长一致的末龄黄粉虫随机分为 4 组，用 10 μL 微
量 进 样 器 注 射 dsRNA， 每 组 60 头 幼 虫。 第 1 组
为 试 验 组， 每 头 幼 虫 注 射 5 μg（1 μg/μL）Tmafp-
dsRNA ；第 2 组为无关 dsRNA 对照组，每头幼虫注
射 5 μg（1 μg/μL）W-dsRNA ；第 3 组 为 空 白 对 照
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期116
dsRNA 及 W-dsRNA， 表 明 可 通 过 细 菌 诱 导 表 达
Tmafp-dsRNA 及 W-dsRNA。
2.3 抗冻蛋白基因干扰后黄粉虫幼虫的死亡率统计
对 黄 粉 虫 幼 虫 注 射 PBS、W-dsRNA 和 Tmafp-
dsRNA 后均出现不同程度的死亡（图 5）。其中注
射 PBS 和 W-dsRNA 后黄粉虫在 24 h 时即出现少量
死亡，之后死亡率不再增加，与未注射对照组没有
显著差异，推测黄粉虫的死亡是由注射造成。而注
射 Tmafp-dsRNA 后黄粉虫的死亡率呈上升趋势，在
48 h 达到最高，为 9.12%，和其他处理组均有显著
2000
bp bp
MA 1 2
1000
750
500
250
100
2000
1500
3000
5000
MB 3 4
1000
750
500
250
100
A ：Tmafp433 基因干扰片段 PCR ；B ：pMD18T-Tmafp 质粒双酶切（Bgl II/
Pst I）；M ：DNA 分子量标准 ；1 ：PCR 阴性对照 ；2 ：Tmafp433 基因干扰片
段的 PCR 产物 ；3 ：pMD18T-Tmafp 重组质粒 ；4 ：pMD18T-Tmafp 质粒双酶
切产物
图 2 Tmafp433 基因干扰片段的克隆
电泳结果（图 2-A）显示，扩增片段位于接近 500
bp 的位置，与预期大小一致。将目的片段回收连接
至 pMD18-T 载体上，对重组子进行酶切鉴定（图 2-B）
并测序，证实序列正确。
2.1.2 Tmafp433 基因干扰载体的构建及鉴定 将
pMD18T-Tmafp 重组质粒与 L4440 载体质粒双酶切
（Bgl II/Pst I），回收后连接（图 3-A）。重组子经菌液
PCR 检测，得到一条大小接近 500 bp 的条带（图 3-B），
与预期相符。重组质粒经双酶切后得到一条约 2 700
bp 和一条约 500 bp 的条带（图 3-C），与目的片段
及线性 L4440 质粒片段大小一致，表明 Tmafp433 基
因干扰片段已构建至 L4440 载体上。对重组质粒进
行测序验证，证实构建正确。
2.2 Tmafp-dsRNA 和W-dsRNA的诱导表达
分 别 对 含 有 L4440-Tmafp 和 L4440-W 重 组 质
粒的 HT115 菌株进行诱导表达，在 OD600 为 0.4 时
加入 IPTG（终浓度为 0.5 mmol/L）诱导，37℃培养
4 h。提取诱导前及诱导后的菌体总 RNA，结果显
示， 携 带 L4440-Tmafp（ 图 4-A） 和 L4440-W（ 图
4-B）质粒的 HT115 在诱导后均在分子量接近 500
bp 的位置多出现一个与预期 dsRNA 片段大小一致的
条带，如箭头所示。用 DNase I 和 RNase A 对诱导
后的总 RNA 进行消化，电泳检测显示菌体 DNA 及
RNA 被降解，仅在诱导后出现多余条带的位置残余
一个条带，据此判定携带 L4440-Tmafp 和 L4440-W
的 HT115 菌液诱导后出现的特异条带分别为 Tmafp-
2000
3000
5000
bp
bp
bp
MA 1 2
1000
1500
750
500
250
100
2000
3000
5000
MC 10 11
1000
1500
750
500
250
100
2000
MB 3 4 5 6 7 8 9
1000
750
500
250
100
A ：L4440 载体质粒及 pMD18T-Tmafp 重组质粒双酶切（Bgl II/ Pst I）产物回
收 ；B ：L4440-Tmafp 阳性克隆的 PCR 扩增 ；C ：L4440-Tmafp 重组质粒的双
酶切（Bgl II/ Pst I）；M：DNA 分子量标准物；1：L4440 质粒双酶切回收产物；
2 ：pMD18T-Tmafp 质粒双酶切后干扰片段回收产物 ；3-8 ：L4440-Tmafp 阳
性克隆的 PCR 产物 ；9 ：PCR 阴性对照 ；10 ：L4440-Tmafp 重组质粒 ；11 ：
L4440-Tmafp 质粒双酶切产物
图 3 Tmafp433 基因干扰载体的构建
2014年第8期 117石萌等 ：利用细菌表达 dsRNA 介导黄粉虫抗冻蛋白基因的 RNA 干扰
afp 相对表达量相比未注射组下降了 60.8%，表明细
菌表达的 Tmafp-dsRNA 可显著抑制黄粉虫 afp 基因2000
MA 1 2 3
1000
750
500
250
100
2000
bp
bp
MB 1 2 3
1000
750
500
250
100
A ：Tmafp-dsRNA 在携带 L4440-Tmafp 的 HT115 中的诱导表达 ；B ：W-dsRNA
在携带 L4440-W 的 HT115 中的诱导表达 ；1 ：诱导前的总 RNA ；2 ：IPTG
诱导后的总 RNA ；3 ；DNase I 和 RNase A 消化的诱导后总 RNA，箭头表示
诱导后出现的特异条带
图 4 Tmafp-dsRNA 和 W-dsRNA 的诱导表达
20
10
5
0
0 24 48 72
control
PBS
W-dsRNA
Tmafp-dsRNA
96ᰦ䰤h哴㊹㲛↫ӑ⦷% 15
图 5 注射 dsRNA 后黄粉虫的死亡率
差异（P<0.05）。
2.4 实时荧光定量PCR检测黄粉虫抗冻蛋白基因
干扰后的表达
为了检测注射 Tmafp-dsRNA 是否会抑制黄粉虫
抗冻蛋白基因的表达，对注射 24 h 后的 dsRNA 处理
组和对照组的黄粉虫 cDNA 样品进行实时荧光定量
PCR 检测。结果（图 6）显示，注射 Tmafp-dsRNA
组的 Tmafp mRNA 水平的相对表达量显著低于 3 个
对照组，即未注射组（control）、注射 PBS 组和注射
W-dsRNA 组。其中注射 Tmafp-dsRNA 后黄粉虫的
control 哴㊹㲛༴⨶㓴PBS W-dsRNA Tmafp-dsRNAcaab1.81.51.20.90.60.30.0Tmafp൘mRNA≤ᒣ⴨ሩ㺘䗮䟿
不同字母表示差异显著（P<0.05）
图 6 注射 dsRNA 后黄粉虫 afp 基因的 mRNA 相对水平
的表达。而注射 PBS 和 W-dsRNA 试验组的 afp 表达
量显著高于未注射组，分别上升了 43.7% 和 39.1%，
推测可能是注射对黄粉虫产生了刺激，从而引起 afp
基因的上调表达。
3 讨论
本研究构建了干扰黄粉虫抗冻蛋白基因 afp 的
dsRNA，在大肠杆菌中诱导表达 dsRNA 并进行纯
化，通过对黄粉虫幼虫注射 dsRNA，抑制了黄粉虫
抗冻蛋白基因 Tmafp 的表达。抗冻蛋白基因编码的
小分子蛋白质对提高昆虫耐寒性具有重要作用，被
认为是许多昆虫重要的越冬策略［16］。由于新近发现
抗冻蛋白具有抗冻之外的其他功能［11］，因此抗冻
蛋白 RNA 干扰质粒的成功构建表达，有助于进一
步研究其功能。抗冻蛋白基因是一个超基因家族，
存在众多亚型。拟步甲科昆虫抗冻蛋白具有特殊的
“TCTXSXXCXXAX”（其中 X 为任意氨基酸）重复
序列，其数目不同构成不同的异构体（isoform），故
保守性较高［17］。对黄粉虫抗冻蛋白基因 Tmafp433
（AF160497）序列分析发现，其与黄粉虫其他 afp
基 因 具 有 81%-99% 的 一 致 性（identity）， 所 以
Tmafp433 基因相应的 dsRNA 有可能沉默所有 Tmafp
基因的表达。这对于通过 RNAi 研究抗冻蛋白的功
能非常有利。根据 Tmafp433 的 ORF 序列在线预测
了可能存在的 siRNA 位点，选择其中 408 bp 序列作
为 RNA 干扰片段，并加入 Bgl II 和 Pst I 两个酶切位
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期118
点，以便构建至 L4440 干扰载体。此外，我们在黄
粉虫 afp 基因 5 端高度保守的信号肽编码区域设计
了实时荧光定量 PCR 引物，可以检测 RNA 干扰后
黄粉虫体内 afp 基因家族的表达水平。
L4440 干扰载体含有两个相反方向的 T7 聚合
酶启动子及 lac 乳糖操纵子，可通过 IPTG 诱导表达
dsRNA。大肠杆菌 HT115（DE3）菌株为 dsRNA 特
异的核酸内切酶（RNase III）缺陷型菌株［18］，利
用 L4440 载 体 构 建 的 L4440-Tmafp 重 组 质 粒 转 化
HT115（DE3） 菌 株， 通 过 IPTG 诱 导 实 现 了 特 异
dsRNA 的表达。为获得纯度较高的 dsRNA，对提取
的诱导后细菌总 RNA 进行消化。其中利用 DNase I
消化总 RNA 中的单链或双链 DNA 而不影响单链或
双链 RNA，利用 RNase A 可特异性攻击 RNA 上嘧
啶残基的 3 端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯
键［19］，而对双链的 DNA 和 RNA 不起作用的特性来
消化 RNA，从而达到纯化 dsRNA 的目的。
黄粉虫经 PBS、W-dsRNA 和 Tmafp-dsRNA 注射
后均出现死亡，其中 PBS 和 W-dsRNA 注射组的死
亡率显著低于 Tmafp-dsRNA 注射组，而与未注射组
无差异，这可能是由于注射对黄粉虫造成伤害，从
而导致死亡。注射 Tmafp-dsRNA 后黄粉虫的死亡率
较高，可能一方面是由于注射导致，另一方面则是
因为 Tmafp-dsRNA 诱发 RNAi，抑制了黄粉虫 afp 基
因的表达，影响了其正常的生理代谢。RNAi 的效
果因物种不同、靶基因不同或 dsRNA 的递送方式
不同而不同。如对长红猎蝽（Rhodnius prolixus）注
射 15 μg dsRNA 可降低（75±14）% 的唾液腺携带
亚铁红素蛋白 2 基因表达，而饲喂 13 μg dsRNA 则
仅降低基因（42±10）% 的表达［20］。在鞘翅目昆
虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）［21］、玉米根萤叶
甲（Diabrotica virgifera virgifera）［22］ 等 昆 虫 中 均 通
过注射 dsRNA 的方式取得很好的 RNAi 效果。而通
过对黄粉虫幼虫注射纯化后的 Tmafp-dsRNA，检测
Tmafp 基因 mRNA 水平的变化时发现其表达受到显
著抑制，比为注射组下降了 60.8%，表明所合成的
Tmafp-dsRNA 可有效地发挥干扰作用。对拟步甲科
的赤翅甲（Dendroides canadensis）afp 基因沉默后，
其热滞活性显著降低［23］，而昆虫热滞活性的高低
与其耐寒性密切相关。同时也发现，对黄粉虫注射
PBS 和 W-dsRNA 后，其 afp 表达量显著高于未注射
组，类似的情况在赤翅甲中也有发现［23］，这可能是
由于注射对黄粉虫造成伤害，引起了黄粉虫的应激
反应，从而导致 afp 基因的上调表达，这与我们发
现荒漠甲虫抗冻蛋白基因表达受环境因素胁迫诱导
具有一致性［11，24，25］。这也许提示抗冻蛋白在体内
具有应急响应功能，因此我们对抗冻蛋白功能的认
识还十分有限。抗冻蛋白基因在昆虫受到干旱、热
激等非生物胁迫时表现的上调表达［11，26］，提示抗冻
蛋白可能与昆虫抵抗环境胁迫有密切关系。
4 结论
利用大肠杆菌 HT115 特异表达了黄粉虫抗冻蛋
白基因 Tmafp433 相应的 dsRNA，经提取纯化后注射
黄粉虫，对其 afp 基因进行 RNA 干扰。结果表明细
菌表达的 Tmafp-dsRNA 对黄粉虫抗冻蛋白基因的表
达具有明显的抑制作用，这为大规模干扰黄粉虫 afp
基因，详细研究其功能奠定了基础，同时有利于进
一步开展 afp 基因与昆虫非生物胁迫的关系研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）