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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):58-63
西瓜枯萎病俗称蔓割病或萎蔫病，是由尖孢镰
刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）
引起的一种世界性瓜类土传病害［1-3］。它的发生极
为普遍，对西瓜产量和品质构成了严重的威胁，是
西瓜生产上的重要病害。目前，对这类维管束病害
的有效防治方法主要是依靠抗病品种选育，但可供
选育的抗病品种抗源单一，效率不高。赵丽明等［4］
从西瓜根际土壤中筛选出对西瓜枯萎病菌防治效
果好、无污染土壤中生存良好的放线菌菌株 XF9、
XF18 和 XF22，能较好的防治西瓜枯萎病。3 种有
益微生物为生物农药的研发奠定了基础，也为西瓜
枯萎病上拮抗菌的拮抗机制奠定了理论基础。国际
上公认的西瓜枯萎病菌有 3 个生理小种，即生理小
种 0 号、1 号和 2 号，其中 2 号生理小种的侵染性
最强［5-7］。除以上 3 个生理小种外，还有其他的小
种分化，生理小种 3 于 2010 年鉴定分离［8］，但在
中国尚未见报道，需进一步证实。传统上对西瓜枯
萎病菌的鉴定主要是采用形态特征的比较法，即对
不同地区的西瓜枯萎病菌分离物进行形态特征（如
菌落颜色、菌落密度、大小孢子的大小与形状及菌
落直径等）的比较。但利用传统的鉴定方法来鉴别
病原菌准确性不高，已不能满足生产的要求。近年来，
随着分子生物学技术的发展，包括 AFLP、RFLP、
RAPD 及 SCAR 在 内 的 分 子 检 测 技 术 在 病 原 菌 鉴
收稿日期 ： 2014-11-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272003），国家科技支撑计划“果蔬重大病虫害防控技术研究与集成示范（2012BAD19B06），公益性
行业（农业）科研专项（200903049），中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）
作者简介 ：曹月霞，女，硕士研究生，研究方向 ：分子植物病理学 ；E-mail ：caoyuexia815@163.com
通讯作者 ：凌键，男，副研究员，研究方向 ：植物病理学 ；E-mail ：lingjian2005@126.com
西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定
曹月霞  凌键  谢丙炎  杨宇红
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要 ： 通过西瓜枯萎病菌与其他专化型枯萎病菌及瓜类几种重要病原菌的比较基因组分析，获得了西瓜枯萎病菌的基因
组特异序列。在此基础上，设计出特异引物，筛选可扩增出西瓜枯萎病菌特异性 DNA 条带的引物。将特异性引物和尖孢镰刀菌专
化型的通用引物 W106R/W106S 结合，建立双重 PCR 检测体系。该双重 PCR 检测体系可以在一次 PCR 反应中快速、准确的检测出
西瓜枯萎病菌，为通过分子方法快速鉴定西瓜枯萎病菌提供技术支持。
关键词 ： 西瓜枯萎病菌 ；双重 PCR ；尖孢镰刀菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.009
Rapid Detection and Identification of Fusarium oxysporum f. sp. niveum
Cao Yuexia Ling Jian Xie Bingyan Yang Yuhong
（Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: Based on the genome comparison analysis between Fusarium oxysporum f. sp. niveum（Fon）and other closely-related
pathogens, the specific sequences of Fon were obtained. Then we developed specific primers that could amplify Fon-specific DNA bands.
Combined the Fon-specific primers with the universal primer of Fusarium oxysporum （W106R/W106S）, we established a duplex PCR method
that might rapidly and accurately detect Fon by 1 PCR reaction, which is beneficial to technically support the rapid identification of Fon by
method of molecular detection..
Key words: Fusarium oxysporum f. sp. niveum ；duplex PCR ；Fusarium oxysporum
2015,31(7) 59曹月霞等 ：西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定
定［9］、分类［10］及群体遗传多样性［11］研究中得到植
物病理学家的高度重视。基于特异基因组设计的特
异性引物已经广泛应用于病原菌的分子检测，前人
基于特异性引物成功建立了快速检测双重 PCR 技术
已用于检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌［12］、
小麦条纹花叶病毒和小麦花叶病毒［13］等植物病原
菌的分子鉴定体系。目前在尖孢镰刀菌的分子检测
方面，Zhang 等［14］利用甘蓝枯萎病菌特异性引物
Focs-1/Focs-2 和尖孢镰刀菌通用引物 W106R/W106F
建立了检测甘蓝枯萎病菌的多重 PCR 检测体系。该
技术既可应用于甘蓝枯萎病发病区病情的检测，也
可从发病植株中检测出甘蓝枯萎病菌。而对于西瓜
枯萎病菌的分子检测，Zhang 等［15］把西瓜枯萎病菌
和西瓜蔓枯病菌的 2 对特异性引物 Fn-1/Fn-2 和 Mn-
1/Mn-2 置于同一反应中，建立了检测西瓜枯萎病菌
和蔓枯病菌的双重 PCR 体系。但双重 PCR 检测西瓜
枯萎病菌和其他病原菌的方法在国内外都未见报道。
本研究拟通过设计西瓜枯萎病菌的特异引物，
与尖孢镰刀菌的通用引物 W106R/W106S 结合，建
立双重 PCR 检测体系，对西瓜枯萎病菌、尖孢镰刀
菌其他专化型菌株和其他外围菌株进行专化性检测，
以期为该病的预测预报并及时采取有效的防控措施
提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究供试菌株包括西瓜枯萎病菌的 3 个小种
共 7 个菌株、尖孢镰刀菌其他专化型的 10 个菌株和
其他 5 个外围菌株。其种名、来源及数量，见表 1。
表 1 供试西瓜枯萎病菌菌株的来源
菌株 学名 小种 寄主 来源
FUW-BN3 F. oxysporum f. sp. niveum 0 西瓜 美国
FUC-BN-8 F. oxysporum f. sp. cucumerinum 黄瓜 美国
1-1 F. oxysporum f. sp. niveum 1 西瓜 河北农科院植保所
1-5 F. oxysporum f. sp. niveum 1 西瓜 河北农科院植保所
1-9 F. oxysporum f. sp. niveum 1 西瓜 河北农科院植保所
2-1 F. oxysporum f. sp. niveum 2 西瓜 河北农科院植保所
2-2 F. oxysporum f. sp. niveum 2 西瓜 河北农科院植保所
2-3 F. oxysporum f. sp. niveum 2 西瓜 河北农科院植保所
FJAT-865 F. oxysporum f. sp. capsicum 辣椒 福建农科院
FJAT-9725 F. oxysporum f. sp. melongenae 茄子 福建农科院
Foc-XJ-4 F. oxysporum f. sp. cubense 香蕉 广东农科院
F-FQ-DB1 F. oxysporum f. sp. lycopersici 番茄 东北农业大学园艺系
A5 F. oxysporum f. sp. cucumerinum 豆类 ATCC
MYA-3040 F. oxysporum f. sp. lactucae 莴苣 ATCC
52557 F. oxysporum f. sp. conglutinans 1 甘蓝 ATCC
58385 F. oxysporum f. sp. conglutinans 2 甘蓝 ATCC
Foc-mh-1 F. oxysporum f. sp. vasinfectum 棉花 中国农业大学
BC-1 Botrytis cinerea 黄瓜 本所分离
T30-4 Phytophthora infestans 马铃薯 本所分离
RS-1 Rhizoctonia solani 冬瓜 本所分离
PA-1 Pythium aphanidermatum 黄瓜 本所分离
CO-1 Colletotrichum orbiculare 本所分离
1.2 方法
1.2.1 供试菌株培养 西瓜枯萎病菌在 PDA 培养基
上（28℃）培养 72 h 后，从菌落的边缘挑取菌丝转
至 PDB 液体培养基中（150 r/min，28℃）振荡培养
3 d 过滤收集菌丝，-80℃保存备用。
1.2.2 DNA 的提取 用改良的 CTAB 法［16］提取病
原菌的 DNA。
1.2.3 引物的设计 根据西瓜枯萎病菌的基因组序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.760
列，比对近缘种以及其他不同致病菌的序列同源性，
通过基因组 BLAST 的方法找到西瓜枯萎病菌的特异
片段。用引物设计软件 Primer 5.0 设计出 10 对引物，
详况，见表 2。
表 2 待筛选的生物序列
编号 序列名称 序列（5- 3） 序列长度 /bp
1
Fon-1 F TCAGTCCTGGATAGTTTGGTGT
753
Fon-1 R GCGTTGTTCATAGATGCGTTAGT
2
Fon-2 F CAGTCCTGGATAGTTTGGTGTT
564
Fon-2 R GAAGGTCATACGCTCCTGTTGC
3
Fon-3 F GGACTGGGCGGTATCGGTAAGA
385
Fon-3 R GAAGTCGTGATAAGCGGGTCGT
4
Fon-4 F CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA
491
Fon-4 R ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG
5
Fon-5 F CGCCTAATGCTCGTAAGTCAG
531
Fon-5 R GTCATCTTTGCTGCAGAGTCC
6
Fon-6 F CGGAAGGTGTGCATTCTGTAT
547
Fon-6 R AGCGATAAGGGGTACGTTGTT
7
Fon-7 F TCCATCATTCCATCGGTGTC
410
Fon-7 R TAGTTGGAGGAGCGGCAGTA
8
Fon-8 F CTGCTGCTGTTTCAGCTATCC
540
Fon-8 R ATGTGTCCCAGTTGCAGAGTC
9
Fon-9 F TCCGAAGAGAGCTTCAGGAG
517
Fon-9 R CCAGGCCTTCTATTGCTGAG
10
Fon-10 F AGCCTCAGCTGTCATCACCT
479
Fon-10 R CCAGGCCTTCTATTGCTGAG
1.2.4 引物的 PCR 扩增 引物检测西瓜枯萎病菌的
PCR 反应总体系是 25 μL ：2×Taq Master Mix（Dye
Plus）12.5 μL，10 μmol/L 的引物各 1 μL，DNA 模板
2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 的反应程序是 ：94℃预变
性 4 min ；94℃变性 40 s ；60℃退火 30 s ；72℃延伸
100 s，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。扩增
结束后，取 6 μL PCR 产物经 1%（50×TAE）琼脂
糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观察并拍照。
1.2.5 引物的特异性检测 用合成的引物对供试菌
株的基因组 DNA 进行扩增，检测其特异性，PCR 反
应体系、反应程序同上。
1.2.6 双重 PCR 体系的建立 利用设计的检测西
瓜枯萎病菌的特异性引物与尖孢镰刀菌其他专化
型 菌 株 的 通 用 引 物 W106R/W106S［17］ 结 合， 建 立
双 重 PCR 体 系。 通 用 引 物 W106R/W106S 的 序 列
为 W106R（5-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3） 和
W106S（5-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3）， 该 引
物使尖孢镰刀菌其他专化型菌株扩增出一条 729 bp
的特异性条带［17］。
双重 PCR 反应总体系为 25 μL ：2×Taq Master
Mix（Dye Plus）12.5 μL， 西 瓜 枯 萎 病 菌 的 特 异 引
物（10 μmol/L）各 1 μL，通用引物（10 μmol/L）各
1 μL，DNA 模 板 2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR 反 应 程
序 ：94℃ 预 变 性 4 min ；94℃ 变 性 40 s ；60℃ 退 火
30 s ；72℃延伸 100 s，共 30 个循环 ；最后 72℃延
伸 10 min。 扩 增 结 束 后， 取 6 μL PCR 产 物 经 1%
（50×TAE）琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观
察并拍照。
2 结果
2.1 引物的特异性筛选
利用设计的 10 对西瓜枯萎病菌特异性引物对供
试的 7 个西瓜枯萎病菌菌株的 DNA 进行 PCR 扩增。
结 果（ 图 1） 显 示， 只 有 1、2、3、4 和 6 号 引 物
均可以产生比较单一的条带，而其他的引物则不能
产生单一的条带，说明上述 5 对引物均具有较强特
异性。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Fon-1 Fon-2
M
664
bpbp
753
M M
491
bpbp
385
Fon-3 Fon-4
M M
729
bpbp
547
Fon-6 W106
1-7，9-15 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8，16 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标
记
图 1 利用编号为 1 至 10 的引物和通用引物 W106R/
W106S 扩增的特异性条带
2.2 特异性引物的检测
对筛选出的 5 对引物和供试的 7 个西瓜枯萎病
菌菌株、10 个尖孢镰刀菌其他专化型菌株和 5 个外
2015,31(7) 61曹月霞等 ：西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定
围菌株的 DNA 进行 PCR 扩增，以 ddH2O 为对照。
结果显示，1、2、3、4 和 6 号引物可以使西瓜枯萎
病菌产生相应的单一条带（图 2，泳道 1-7），而在
尖孢镰刀菌其他专化型菌株和外围菌株中均不能产
生条带（图 2，泳道 8-22）。通用引物可以使西瓜枯
萎病菌和尖孢镰刀菌其他专化型菌株扩增出 729 bp
的条带（图 2，泳道 1-17），表明上述引物均具有特
异性。
2.3 双重PCR检测
以 5 对特异性引物和通用引物（W106R/W106S）
对 7 个西瓜枯萎病菌菌株以及 15 个对照菌株的基
因组 DNA 进行双重 PCR 扩增，以 ddH2O 为对照。
PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 3 所示，西
瓜枯萎病菌可以产生两条不同的条带（图 3，泳道
1-7，1-17），尖孢镰刀菌其他专化型菌株只产生一
条 729 bp 的条带（图 3，泳道 8-17），而外围菌株和
无菌水不能扩增出条带（图 3，泳道 18-23）。研究
结果显示，双重 PCR 检测结果与常规 PCR 检测结
果一致，也进一步证明双重 PCR 检测技术的可靠性。M M
bp
753
M M
bp
564
M M
bp
385
M M
bp
491
M M
bp
547
M M
bp
729
Fon-1
Fon-2
Fon-3
Fon-4
Fon-6
W106
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1-7 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8-17 ：尖孢镰刀菌其他专化型菌株 ；18-22 ：外
围菌株 ；23 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标记
图 2 利用编号为 1、2、3、4、6 的引物和通用引物
W106R/W106S 扩增的特异性条带
M M
bp
729
561
M M
bp
729
385
M
bp
bp
729
491
729
517
M M
Fon-2
Fon-3
Fon-4
Fon-6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1-7 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8-17 ：尖孢镰刀菌其他专化型菌株 ；18-22 ：外
围菌株 ；23 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标记
图 3 利用编号为 2、3、4、6 的引物和通用引物 W106R/
W106S 扩增的特异性条带
3 讨论
双重 PCR（Duplex PCR）是在一个 PCR 反应体
系中加入两对特异性引物，同时扩增 2 个目的基因，
能够在一个 PCR 反应中检测出两种病原菌，提高效
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.762
率，而且还可以减少因实验操作所带来的假阳性等
问题，能很好地用于植物病原菌间的检测。建立双
重 PCR 体系的关键是引物设计［18］，双重 PCR 反应
中引物之间不可以发生相互作用，形成引物二聚体
和非特异性的扩增。同时，二者扩增的片段长度要
有一定的差距，电泳检测可以产生不同的条带。因
此，双重 PCR 体系的建立很重要［19，20］。
检测不同植物病原菌的双重 PCR 反应在国内外
均有报道，如陈庆河等［21］利用马铃薯晚疫病菌内
转录间隔区序列设计了一对特异性引物 INF1/INF2，
与马铃薯青枯病菌特异性引物 759/760 组合建立双
重 PCR 体系。Diallo 等［22］建立了检测胡萝卜软腐
果胶杆菌马铃薯黑胫病亚种和菊亚种的双重 PCR
体系，能够快速的对两种病原菌进行分子检测。
Majumder 等［23］建立了检测洋葱黄矮病毒和葱潜隐
病毒的双重 PCR 体系，该体系是在 RNA 水平上对
洋葱黄矮病毒和葱潜隐病毒进行检测。
前人应用双重 PCR 方法只能检测出西瓜枯萎病
菌和西瓜蔓枯病菌，而针对西瓜枯萎病菌与尖孢镰
刀菌其他专化型的病原菌和其他病原菌的分子检测
尚未报道。在本研究中，通过对西瓜枯萎病菌的全
基因组测序，比对近缘种以及瓜类上几种重要病原
菌的基因组序列，设计并筛选能扩增出西瓜枯萎病
菌特异性 DNA 条带的引物。本研究设计的特异引物
能够快速而准确的检测西瓜枯萎病菌，在西瓜枯萎
病菌潜伏期和发病初期对其进行诊断、监测和病原
菌鉴定，以便采取有效的防治方法，及时控制病害
的传播和蔓延，减少经济损失，在实际生产上具有
重要的指导作用。双重 PCR 具有效率高、成本低等
优点，具有非常广阔的实际应用价值，同时本研究
也为其他植物病害双重 PCR 检测方法的建立奠定了
理论基础。
4 结论
本研究建立了一种双重 PCR 检测体系，通过
设 计 和 应 用 引 物 Fon-2R/ Fon-2F、Fon-3R/ Fon-3F、
Fon-4R/ Fon-4F 和 Fon-6R/ Fon-6F 能检测出西瓜枯萎
病菌。该检测体系具有高效、准确及经济实惠等优点，
适用于西瓜田间土壤的带菌检测以及西瓜枯萎病菌
的检验检疫和有效防治。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）