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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
四种黄单胞菌的基因芯片检测方法的建立
龙海 1, 2
李一农 1
李芳荣1
( 1深圳出入境检验检疫局,深圳 518001; 2 深圳市检验检疫科学研究院,深圳 518045)


摘
要 :
结合双重 PCR和基因芯片技术同时检测和鉴定我国检疫性细菌,包括水稻白叶枯病菌 (X anthomonas oryzae pv.
oryzae, X oo)、水稻细菌性条斑病菌 (X. oryzae pv. oryzicola, Xooc)、柑桔溃疡病菌 (X. axonopod is pv. citr i, X ac)以及严重危害十字
花科作物的甘蓝黑腐病菌 (X anthomonas campestris pv. campestr is, X cc)。以铁载体受体 ( Putative siderophore receptor)基因序列
和 RNA多聚酶西格玛因子 ( RNA po lym erase sigm a facto r, rpoD )基因序列为靶标, 设计引物和特异性探针能够同时检测这 4种
重要的病原菌。对 17个细菌菌株进行芯片检测,仅 4种靶标菌得到阳性结果, 证明此方法具有很高的特异性。4种致病菌基
因组 DNA的检测灵敏度约为 3 pg。检测结果表明,建立的基因芯片检测方法特异性强 ,能实现上述 4种黄单胞菌的准确检测
和鉴定, 具有良好的应用前景。
关键词:
黄单胞菌
双重 PCR
基因芯片
检测
Detection of FourXanthomonas by Gene Chip
LongH a i
1, 2
L iY inong1
L iF angrong1
(
1
Shenzhen Entry
Ex it Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518001;
2
Shenzhen A cademy of Insp ection and Quarantine, Shenzhen 518045)


Abstrac:t
A spec ific, rapid and sensitive m ethod o f g ene ch ip comb ined w ith doub le PCR a llow the simu ltaneous detec tion of
X anthom onas oryzae pv. Oryzae, X. oryzae pv. Oryz icola, X. axonopodis pv. citr i andX. campestris pv. campes tr is. The Putative side rophore
receptor gene and RNA po lym erase sigm a factor( rpoD ) was selected to design pr im ers and species
spec ific probes w hich can simu ltane

ously detec t these four k inds o f bacter ia. Genom icDNA s from 17 bacteria l strains w ere detected and only 4 index bacteriaw ere po sitive.
The detec tion lim it of th is assay w as around 3 pg genom icDNA. The resu lts suggested tha t detec tion o f phytopathogenicm icroorg an ism s
by gene chip is an effective pro cedurew ith h igh spec ificity and sensitiv ity. The gene chipm e thod deve loped could prov ide an inform ativ e
supp lem ent to conventiona lm icrob io log ica lm e thods for routinem on itor ing of plant.
Key words:
X anthom onas
Double PCR
Gene ch ip
Detection
收稿日期: 2010
06
30
基金项目:深圳出入境检验检疫局博士基金项目 ( SZ2007101 )
作者简介:龙海,男,博士,研究方向:植物病理学; E
ma i:l longs i19790931@ sina. com. cn
通讯作者:李一农,男,研究员, E
m ai:l l i_yinong@ 126. com
黄单胞菌属 (Xanthomonas )种类繁多, 致病性
多样,
伯杰氏系统细菌学手册
(第 2版 )收录了 20
个种, 70个分类地位已经确定的致病变种和 70个
分类地位尚不确定的致病变种 [ 1]。现行的
中华人
民共和国进境植物检疫性有害生物名录
中收录了
14个检疫性黄单胞菌。水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas
oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻细菌性条斑病菌 (Xan

thomonas oryzae pv. oryzicola, Xooc)是水稻上重要的
细菌性病害。水稻白叶枯病菌可造成水稻减产
10% - 30%, 严重时可达 50%以上 [ 2] ;水稻细菌性
条斑病菌可造成水稻减产 5% - 10% , 严重时可达
20%
[ 2]
;柑桔溃疡病菌 (Xanthomonas axonopodis pv.
citri, Xac)能够侵染为害绝大多数柑桔栽培品种, 是
影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病菌 [ 3] , 以
上三者都是我国重要的检疫性细菌。甘蓝黑腐病菌
(Xanthomonas campestris pv. campestris, X cc)是十字
花科植物重要的病原菌, 在世界范围内,尤其是热带
和亚热带地区引起十字花科作物如甘蓝、花椰菜和大
2011年第 1期



龙海等:四种黄单胞菌的基因芯片检测方法的建立
白菜等发生黑腐病, 对蔬菜生产造成严重的经济
损失 [ 4]。
目前对黄单胞菌的分子生物学检测大多基于
PCR技术 [ 2, 3, 5, 6]。这些方法存在易污染、灵敏度低,
而且每次只能检测一种致病菌等不足。基因芯片技
术是近年发展起来的高新生物技术, 可以对多种靶
基因同时检测和鉴定, 以其高通量、快速、多靶标等
优势得到广泛的应用 [ 7 ]。本研究结合双重 PCR和
基因芯片技术,同时对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性
条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌进行检测
和鉴定,旨在满足实际检验工作中快速、高通量、自
动化的检测要求。
1
材料与方法
1
1
材料
所用菌种见表 1。
表 1
本研究中所用的细菌菌种
菌株 编号 来源
X an thom ona s oryzae pv. oryzae Xoo1 南京农业大学
X. oryzae pv. oryzae Xoo2 南京农业大学
X. oryzae pv. oryzae Xoo3 中国检验检疫科学研究院
X. oryzae pv. oryzicola Xooc1 南京农业大学
X. oryzae pv. oryzicola Xooc2 南京农业大学
X. oryzae pv. oryzicola Xooc3 中国检验检疫科学研究院
X. axonopod is pv. citri Xac1 南京农业大学
X. axonopod is pv. citri Xac2 中国检验检疫科学研究院
X. campestris pv. campestri s Xcc1 南京农业大学
X. campestris pv. campestri s Xcc2 中国检验检疫科学研究院
Pan toea stewart ii sub sp. stew artii Pnss1 深圳出入境检验检疫局动植中心
A cid ovorax avena e pv. avenae 470101 中国农业大学种子健康检测中心
Burkhold eria g lad iol i pv. al liicola 470201 中国农业大学种子健康检测中心
C lav ibacter m ich iganensis pv. m ich iganensis 470301 中国农业大学种子健康检测中心
C. m ich iganensis pv. nebrasken si s 470321 中国农业大学种子健康检测中心
C. m ich iganensis pv. seped on icum 470331 中国农业大学种子健康检测中心
P seud omona s syringae pv. phaseol icola 470501 中国农业大学种子健康检测中心
1
2
基因组 DNA的提取
根据文献 [ 7]进行细菌基因组 DNA的提取。
1
3
引物和探针的设计与合成
从 NCB I ( http: / /www
ncbi
n lm
nih
gov ) Gen

Bank数据库中获取黄单胞菌铁载体受体 ( Putative
sideropho re receptor)基因序列和 RNA多聚酶西格
玛因子 ( RNA po lymerase sigma factor, rpoD )基因序
列。用 C lustalW软件对检索得到的序列进行比对,
找出出恒定区和可变区, P rimer Prim er 5软件在恒
定区设计引物。用 C lustalW 软件找出 PCR扩增区
域内差异较大的寡核苷酸探针序列,在 GenBank中
对候选序列进行 B last比对分析, 选择理论上特异性
好的探针。质控探针包括阳性定位点探针和阴性对
照探针,均与黄单胞菌 rpoD基因和含铁细胞接受子
基因序列无同源性的寡核苷酸片段。检测阳性定位
点探针的是 Cy5标记的互补链。引物和探针 (表 2)
的合成、修饰及标记由上海超世生物技术有限公司
完成。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
表 2
基因的引物和探针序列
名称 靶位点 序列 ( 5
- 3
) 长度 ( n t) 备注
引物
XrpoD
F rpoD
CGGCTTCAACGACCTGATY 19 正向引物
XrpoD
R rpoD
GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT 22 反向引物
PSRGF a 铁载体受体
GAATATCAGCATCGGCAACAG 21 正向引物
PSRGR b 铁载体受体
TACCGGAGCTGCGCGTT 17 反向引物
探针
Xo
S1 rpoD
NH 2
TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG 29 Xoo特异性探针
Xoo
S1 rpoD
NH 2
TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG 29 Xooc特异性探针
Xac
A1 rpoD
NH 2
TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC 26 Xac特异性探针
Xcc
S2 铁载体受体
NH 2
TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC 32 Xcc特异性探针
Pos
ckc
NH 2
TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG 27 阳性定位点探针
An tiPos
ckd
Cy5
CCAAATTGATCCCACCC 17 检测阳性定位点探针的互补链
N eg
CK e
NH 2
TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC 29 阴性质控探针

a, b的序列来自文献 [ 2] , c, d, e的序列来自文献 [ 8]
1
4
靶基因片段荧光标记双重 PCR扩增
基因芯片检测荧光标记 PCR反应体系: 0
25
mmo l /L 10
Buffer( M g2 + free) (大连宝生物 )、2
0
mmo l /L M gC l2 (大连宝生物 )、0
2 mmol /L Cy5

dNTPs( Amersham B iosc iences公司 )、正向引物和反
向引物各 0
2
mo l/L、1U Taq酶 (大连宝生物 )、模
板 DNA 10- 20 ng, 总体积 25
L。标记 PCR扩增
在 T3 PCR仪 (德国 B iometra公司 )上进行, 扩增条
件: 94
5m in; 94
30 s, 60
30 s, 72
30 s, 共 30
个循环; 72
10 m in。
1
5
基因芯片的制备及杂交
基片选择晶芯光学级醛基基片 (北京博奥生
物有限公司 )。探针用 TE缓冲液 ( pH 8
0 )稀释
至终浓度 40
mo l/L, 将 50% DM SO加入 384孔
板中, 再加入等量的探针溶液, 轻轻混匀, 按预先
排列的探针顺序 (图 1) , 用基因芯片点样仪 (德
国 GeS im公司 )将探针点至基片上。点样后基片
经 37
水合 12 h, 用 0
2% SDS溶液洗 5 m in; 去
离子水分别洗 3次,每次 2m in;再用 0
2% NaBH4封
闭液洗 15 m in, 先搅拌 5m in, 然后静置 5 m in,最后
再搅拌 5 m in; 用去离子水洗 3次, 每次 2 m in;
2 000 r /m in室温离心 2 m in, 制备好的基因芯片于
4
避光保存。
Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck Pos
ck
Pos
ck Xo
S1 Xo
S1 Xo
S1 Xo
S1 Xo
S1 Xoo
S1 Xoo
S1 Xoo
S1 Xoo
S1 Xoo
S1
Pos
ck X ac
A1 Xac
A1 Xac
A1 Xac
A1 Xac
A1 X cc
S2 Xcc
S2 Xcc
S2 X cc
S2 Xcc
S2
Pos
ck Neg
CK Neg
CK N eg
CK Neg
CK N eg
CK 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照 空白对照
图 1
黄单胞菌基因芯片检测探针排布图
取芯片杂交液 7
L( 2% SDS和 5% SSPE等
体积混合 ) ,双重 PCR标记产物 6
L 和 Cy5标记
的阳性定位点探针的互补链 1
L, 混匀后 95
变
性 5 m in,冰水中静置 5 m in。将处理后的混合物加
入芯片点样区, 盖上盖玻片置于湿盒中 50
避光
杂交 3 h。杂交后的芯片依次在洗液
( 0
3
SSC,
012% SDS)和洗液
( 0
06
SSC )中清洗 5 m in,
2 000 r /m in离心 1 m in。用激光共聚焦扫描仪扫描
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龙海等:四种黄单胞菌的基因芯片检测方法的建立
芯片。
1
6
芯片特异性试验
用建立的基因芯片方法分别对供试的菌株进行
检测, 经双重 PCR扩增和基因芯片检测, 验证该方
法的特异性。
1
7
芯片灵敏度试验
将 Xoo、Xooc、Xac和 Xcc的 DNA 稀释得到
300 pg /
L、30 pg /
L、3 pg /
L和 0
3 pg /
L 4个
浓度梯度,判断该方法对 4种靶标菌的检测灵敏度。
2
结果与分析
2
1
荧光标记双重 PCR扩增
以供试菌种 DNA为模板,用 XrpoD
F /XrpoD
R
和 PSRGF /PSRGR进行荧光标记双重 PCR扩增,电
泳结果 (图 2)显示, 只有黄单胞菌出现目标片段,其
中 XrpoD
F /X rpoD
R可以扩增所有供试的黄单胞
菌,扩增产物大小为 220 bp, PSRGF /PSRGR除了不
能扩增 Xac,对其他的黄单胞菌都能扩增,扩增产物
大小为 152 bp。两对引物对其他对照菌株和阴性对
照都没有扩增。
1. Xoo1; 2. Xoo2; 3. Xooc1; 4. Xooc2; 5. Xac1; 6: Xac2; 7. Xcc1;
8. Xcc2; 9. Xoo3; 10. Xooc3; 11. P. stew artii subsp. stew arti i; 12. A.
avena e pv. avenae; 13. B. g lad ioli pv. all iicola; 14. C. m ich iganensis
pv. m ichiganen sis; 15. C. m ich iganensis pv. nebraskensis; 16. C. m ichi

ganen sis pv. seped onicum; 17. P. syringae pv. phaseolicola; 18.阴性对
照; M. DL 2000M arker
图 2
荧光标记双重 PCR扩增结果电泳图
2
2
基因芯片检测特异性
将荧光标记 PCR扩增产物与基因芯片上的探
针进行杂交,结果 (图 3)显示,除了目的探针有较强
的杂交信号以外,在其他非目的探针的位置基本没
有信号,说明该基因芯片检测方法能够特异性地检
测 4种致病菌。
A. X. oryzae pv. oryzae; B. X. oryza e pv. oryzicola; C. X.
axonopod is pv. c itri; D. X. camp estris pv. campestris
图 3
基因芯片特异性试验结果
2
3
基因芯片检测灵敏度
将 Xoo、Xooc、X ac和 X cc的 DNA 稀释得到
300、30、3和 0
3 pg /
L 4个浓度梯度,进行荧光标
记双重 PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳结果见图 4。双
重 PCR电泳检测, X rpoD
F /XrpoD
R对 Xoo和 Xooc
基因组 DNA的检测限约为 30 pg /
L, 对 Xac和 Xcc
基因组 DNA的检测限约为 3 pg /
L。PSRGF /PSRGR
对 4种黄单胞菌基因组 DNA的检测限约为3 pg /
L。
A. X. oryzae pv. oryza e; B. X. oryzae pv. oryzicola; C. X.
axonopod is pv. citri; D. X. camp estris pv. campestris ; M. DL
2000M arker; 1. DNA浓度 300 pg /
L; 2. DNA 浓度 30
pg /
L; 3. DNA浓度 3 pg /
L; 4. DNA浓度 0
3 pg /
L
图 4
荧光标记双重 PCR扩增结果电泳图
PSRGF /PSRGR扩增的灵敏度要优于 X rpoD
F /
X rpoD
R的灵敏度。之后芯片检测, 结果 (图 5 )显
示 4种菌的基因组 DNA 的检测极限约为 3 pg左
右。因此,对于 Xoo和 Xooc, 基因芯片检测灵敏度
比电泳检测的灵敏度高 10倍, 而对于 Xac和 X cc,
由于相同 DNA模板浓度的情况下, 基因芯片杂交信
号要比电泳的信号强,因此基因芯片检测灵敏度也
高于电泳检测的灵敏度。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
A
C. X. oryza e pv. oryzae双重 PCR扩增产物杂交结果,
DNA浓度依次为 300、30和 3 pg /
L; D
F. X. oryza e pv.
oryzicola双重 PCR扩增产物杂交结果, DNA浓度依次为
300、30和 3 pg/
L; G
I. X. axonopodis pv. ci tri双重 PCR
扩增产物杂交结果, DNA浓度依次为 300、30和 3 pg /

L; J
L. X. campestris pv. cam pestris双重 PCR扩增产物杂
交结果, DNA浓度依次为 300、30和 3 pg /
L
图 5
四种黄单胞菌的基因芯片灵敏度试验结果
3
讨论
目前对黄单胞菌的检测方法主要有普通 PCR、
实时荧光 PCR和滚环扩增等, 这些方法的检测通量
低,每次只能检测 1种菌。基因芯片技术以其准确、
快速、高通量、自动化等特点被广泛应用于生物学的
各个领域。在病原微生物的检测方面已经被大量使
用,本研究选取了 Xoo、Xooc、Xac和 X cc作为研究
对象, 建立的基于双重 PCR的芯片检测方法,可以
在一个反应体系中同时检测上述 4种致病菌, 经证
明是一种有效的方法, 为黄单胞病菌的检测提供了
较好的手段。
特异性是所有检测方法的关键, 基因芯片的特
异性与所选取的靶基因和筛选的引物、探针密切相
关。本试验的 4种研究对象相互之间的遗传关系较
近,因此靶基因的选择尤为重要,探针的特异性越高
越好。通过查阅文献和预试验选择了铁载体受体和
RNA多聚酶西格玛因子作为靶基因。经过对大量
寡核苷酸探针进行筛选, RNA多聚酶西格玛因子基
因筛选出了 3条特异性探针, 分别用于检测 Xoo、
Xooc和 X ac, 铁载体受体筛选出了 1条特异性探针,
用于检测 Xcc。将试验中的探针和引物在 GenBank
进行 BLAST比对,每条引物和探针序列均具有很高
的特异性;同时选取大量阴性和阳性标准菌株对其
特异性进一步进行评价,结果显示,阳性定位点探针
位置每次试验均出现阳性信号, 说明整个试验的操
作是正确的;而对于 4条特异性探针,除了对应的目
标菌株外,其他非目标菌均无阳性结果出现,说明本
试验建立的检测方法是可靠的。灵敏度是评价一种
检测方法的重要指标。本试验建立的双重 PCR结
合基因芯片检测方法对 4种目标菌基因组 DNA检
测极限约为 3 pg /
L, 比普通 PCR的检测极限高 10
倍左右。
本研究建立的检测和鉴定 4种黄单胞菌基因芯
片方法,是其在植物致病微生物检测中的初步应用,
并未真正发挥基因芯片高通量的优势,旨在为基因
芯片技术在检测和鉴定植物致病微生物方面的广泛
应用提供一些参考,希望将来能在不增加引物只增
加特异性探针的基础上检测更多的黄单胞菌。
参 考 文 献
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(责任编辑
李楠 )
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