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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-10
基金项目 : 贵州省科学技术基金［黔科合 J 字（2011）2332 号］, 贵州大学引进人才科研项目［贵大人基合字（2010）35 号］, 贵州省科学
技术基金项目［黔科合 J 字（2010）2108 号］, 贵州省农业厅兽医科技计划项目（201006）
作者简介 : 张双翔 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物疫病病原学 ; E-mail: spiritzs7@yahoo.com.cn
通讯作者 : 周碧君 , 女 , 硕士生导师 , 教授 , 研究方向 : 传染病与预防兽医学 ; E-mail: as.bjzhou@gzu.edu.cn
山羊传染性胸膜肺炎病原快速诊断方法的建立
张双翔1 周碧君1，2 程振涛1，2 文明1，2 王开功1，2
崔亚兰1 李泽民1 覃岚1 钟文彬1
（1 贵州大学动物科学学院，贵阳 550025 ；2 贵州省动物疫病研究室，贵阳 550025）
摘 要： 为准确快速鉴定临床疑似山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）病原，针对丝状支原体山羊亚种（Mmc）与绵羊肺炎支原体（Mo）
16S rRNA基因设计两对特异性引物 Ps/Pa、Ms/Ma，通过优化反应条件及体系，建立检测 CCPP两种主要致病支原体的双重 PCR方法，
并检测了所建方法特异性、敏感性及临床应用。当引物、Mg2+及 dNTP浓度分别为 0.8 pmol/μL、1.5 nmol/μL、0.2 nmol/μL，Ps/Pa
与 Ms/Mo比例为 1 1时，于 54℃退火 40 s，可最小检出 Mmc与 Mo核酸量分别为 0.1 ng、0.01 ng，敏感性良好。通过特异性与临
床疑似病例检测，证明所建方法具较好特异性，可初步应用于临床诊断。
关键词： 山羊传染性胸膜肺炎 病原 双重 PCR 建立
Establishment of Rapid Diagnosis on Pathogens of CCPP
Zhang Shuangxiang1 Zhou Bijun1，2 Cheng Zhentao1，2 Wen Ming1，2 Wang Kaigong1，2
Cui Yalan1 Li Zemin1 Qin Lan1 Zhong Wenbin1
（1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025；2 Laboratory for Animal Disease of Guizhou，Guiyang 550025）
Abstract: To identify the pathogens of suspect CCPP rapidly and accurately, two special primers Ps/Pa and Ms/Ma which aimed 16S
rRNA gene of Mmc and Mo were designed. The duplex-PCR method to detect two pathogens of CCPP was established by optimizing annealing
temperature, amplification system and primer proportion. The results showed that effect of method was improved when the concentration of
primer, Mg2+ and dNTP reached 0.8 pmol/μL, 1.5 nmol/μL, 0.2 nmol/μL, equal mixed primers and annealed 40 s at 54℃ . It could detect the
minimum nuclear weight of Mmc and Mo was 0.1 ng, 0.01 ng, which showed proper sensitivity. It was also proved satisfactory specificity and
could be used in clinical diagnosis preliminarily.
Key words: CCPP Pathogens Duplex-PCR Establishment
山羊传染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuro-
pneumonia，CCPP），又称烂肺病，是山羊一种高度接
触性传染病，我国农业部将其列为二类传染病，临
床呈现纤维性肺炎及胸膜炎，发病后死亡率较高［1-3］。
山 羊 支 原 体 山 羊 肺 炎 亚 种（Mycolasa capricolum
subspecies capripneumoniae，Mccp）、丝状支原体丝
状亚种 LC 型（Mycolasa mycoides subspecies mycoides
LC，Mmm LC）、丝状支原体山羊亚种（Mycolasa
capricolum subspecies capri，Mmc）与绵羊肺炎支原
体（Mycolasa ovipneumoniae，Mo） 均 可 使 山 羊 患
CCPP［4-6］，资料显示，国内主要流行毒株为 Mmc
与 Mo［7］。
目前，国内外对于 CCPP 的诊断主要依靠病原
分离鉴定、血清学试验以及分子生物学技术。对比
3 种诊断方法，传统的分离鉴定由于支原体生长条
件要求较高、生长速度缓慢［8］的特点，因此诊断成
本高且难度大、耗时长，无法立即解决快速诊断问题；
血清学试验主要为间接血凝试验、补体结合试验与
竞争 ELISA，三者敏感性差或特异性差，且不能作
为病原诊断方法 ；分子生物学技术具有快速、准确、
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灵敏、特异等优点，尤其是多重 PCR 方法可对不同
病原同时进行诊断。因此，本试验特设计分别针对
Mmc 与 Mo 16S rRNA 基因的特异性引物，通过优化
反应条件及体系，旨在建立一种快速、灵敏、特异
且能同时检测出 Mmc 与 Mo 的山羊传染性胸膜肺炎
两种病原的诊断方法，为山羊 CCPP 防控提供一定
的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 Mmc 标准株 PG3（CVCC 368）与 Mo
标准株Y98（CVCC 384）购自中国微生物菌种资源库；
支原体肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司；
DNA 提取试剂及 PCR 扩增试剂购自北京天根生化
科技有限公司 ；大肠杆菌、链球菌、产气荚膜梭菌、
沙门氏菌、巴氏杆菌及山羊痘病毒，由本实验室分
离鉴定 ；疑似 CCPP 病死山羊病变肺组织、胸腔积
液及鼻腔分泌物，采自贵州省不同地区（A、B 和 C）。
1.1.2 引 物 参 考 GenBank 所 公 布 Mmc PG3 株
（登录号 ：U26036.1）与 Mo Y98 株（登录号 ：NR_
025989.1）16S rRNA 序列分别设计 Mmc 的特异性引
物与 Mo 的特异性引物 Ps/Pa 与 Ms/Ma（表 1），送上
海捷瑞生物工程有限公司合成。
系，加入 10×buffer 5 μL，Mg2+（25 mmol/ L）3 μL，
dNTP（10 mmol/ L）2 μL，Taq酶（2.5 U/μL）1 μL，
引 物 Ps/Pa（10 μmol/ L） 及 Ms/Ma（10 μmol/ L）
各 1 μL，PG3 与 Y98 的 DNA 等量混合模板 2 μL，
ddH2O 补足。以 94℃预变性 4 min ；94℃变性 40 s，
50-60℃（以 2℃间隔递增）退火 40 s，72℃延伸
1.5 min，共 34 个循环后 72℃延伸 10 min 进行退火
温度的梯度扩增，以确定最佳退火温度。
1.2.2.2 最佳反应体系的确定 在 50 μL 的反应体
系中，设定不同的引物浓度各 0.4、0.6、0.8、1.2 和
1.6 pmol/μL，不同的 Mg2+ 浓度 0.5、0.75、1、1.25
和 1.5 nmol/μL，不同的 dNTP 浓度 0.2、0.3、0.4、0.5
和 0.6 nmol/μL，以最适退火温度对 PG3 与 Y98 菌株
的 DNA 混合模板进行扩增，以确定最佳的反应体系。
1.2.2.3 最佳引物比例的确定 按最佳的扩增体系
及反应条件，将 Mmc 与 Mo 特异性引物 Ps/Pa 与
Ms/Ma 以比例 2 1，1 1，1 2 设定梯度，进行 PCR
扩增，以确定最佳引物比例。
1.2.3 特异性检测 按 1.2.2 所确定最佳优化条件分
别对 Mmc 标准株 PG3 株、Mo 标准株 Y98 株与常见
易引起山羊临床表现高热、呼吸障碍的大肠杆菌、
链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及山
羊痘病毒进行 PCR 扩增，凝胶电泳检测结果。
1.2.4 敏感性检测 紫外分光光度法测定 PG3 与
Y98 菌株的 DNA 浓度，分别调整浓度至 1 μg/μL 后
按 10 倍比例递减稀释成 100-0.001 ng/μL 不同浓度，
以此系列不同浓度 DNA 各 1 μL 混合为模板，按 1.2.2
所确定最佳条件分别扩增并电泳检测结果。
1.2.5 临床应用 以所建双重 PCR 方法分别对贵州
省不同地区（A、B 和 C）所送疑似 CCPP 病死山羊
病变肺组织、胸腔积液及鼻腔分泌物进行检测。并
与传统支原体分离及生化鉴定结果进行比较。
2 结果
2.1 最佳退火温度的确定
以 50℃开始以 2℃间隔递增至 60℃退火 40 s，
PCR 扩增确定最佳退火温度，结果见图 1。由图 1
可知，当退火温度低于 54℃时出现非特异性条带，
但高于 54℃时 PG3 与 Y98 扩增效率不同程度降低，
因此，最佳退火温度确定为 54℃。
表 1 引物序列
引物 5-3 预计扩增大小（bp）
Ps GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT
412
Pa CAGCGTCAATAACAAGCCAGTAAG
Ms AAACTATGTGCCAGCAGCGTAAG
534
Ma CACCATCTGTCATCTCGTTAGCC
1.2 方法
1.2.1 标准菌株 DNA 制备 以支原体肉汤培养基复
苏 Mmc 标准株 PG3 与 Mo 标准株 Y98，于 5%CO2 环
境中培养 3-14 d 后，取菌液 10 mL 以 1 2000 r/m 离
心 30 min，弃上清，以灭菌 PBS 洗涤，再以 12 000 r/m
离心 15 min，重复洗涤 2 次。最后以适量 TE buffer
悬浮沉淀。按 SDS-Protein K 法提取 PG3 及 Y98 菌株
的 DNA，-20℃保存备用。
1.2.2 双重 PCR 的条件优化
1.2.2.1 最佳退火温度的确定 以 50 μL 为反应总体
2012年第3期 97张双翔等 ：山羊传染性胸膜肺炎病原快速诊断方法的建立
2.2 最佳反应体系的确定
以最适退火温度对 PG3 与 Y98 菌株的 DNA 混
合模板进行不同浓度引物、Mg2+ 及 dNTP PCR 扩增，
以确定最佳反应体系。结果（图 2）显示，在 50 μL
体系中引物、Mg2+ 及 dNTP 浓度分别为 0.8 pmol/μL、
1.5 nmol/μL、0.2 nmol/μL 时，扩增效果最佳。
2.3 最佳引物比例的确定
按最佳的反应体系及反应条件，进行 Mmc 与
Mo特异性引物Ps/Pa与Ms/Ma不同比例PCR扩增（图
3）。由图 3 可知，当 Ps/Pa 与 Ms/Ma 比例为 1 1 时
扩增效果最佳。
2.4 特异性检测结果
以所建双重 PCR 方法分别对 Mmc 标准株 PG3、
Mo 标准株 Y98 与易引起山羊高热、呼吸障碍的常见
细菌及病毒进行 PCR 扩增检测，结果见图 4。由图
4 可知，Mmc 标准株 PG3、Mo 标准株 Y98 混合模板
及单一模板均可扩增得到预计大小片段，大肠杆菌、
链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及山
羊痘病毒均未扩增出任何条带，说明所建双重 PCR
方法具有良好的特异性。
2.5 敏感性检测结果
以所建双重 PCR 方法分别检测不同浓度 Mmc
标准株 PG3 与 Mo 标准株 Y98 DNA 模板（图 5）。由
图 5 可知，PG3 最小检出量为 0.1 ng，Y98 最小检出
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量为 0.01 ng，表明，所建双重 PCR 方法具有较好的
敏感性。
2.6 临床病例检查结果
以所建双重 PCR 方法分别检测不同地区所送
疑似 CCPP 病死山羊病变肺组织、胸腔积液及鼻腔
分泌物（图 6）。由图 6 可知，从贵州省 B 地疑似
CCPP 病死山羊病变肺组织、胸腔积液及鼻腔分泌
物均扩增出 Mo 核酸的 534 bp 特异性条带，未扩增
到 Mmc 核酸的 412 bp 特异性条带，A 与 C 地中未
扩增到任何条带。以传统生化鉴定方法对 A、B、C
地山羊病料进行支原体分离鉴定表明，只从 B 地分
离得到 Mo，表明所建方法检测结果与传统分离鉴
定相符。
3 讨论
Mmc 与 Mo 均能于无生命培养基上自行增殖，
可采取传统细菌学方法对其进行分离、鉴定。然而，
因其营养需要高、生长缓慢的特点［9, 10］，临床上对
于这两种病原体的分离鉴定成本高、耗时长，无法
迅速对疑似 CCPP 山羊进行确定性诊断。本试验选
择GenBank所登录Mmc与Mo的16S rRNA基因序列，
设计了两对分别针对 Mmc 与 Mo 的特异性引物，通
过优化反应退火温度、引物浓度、Mg2+ 浓度、dNTP
浓度及引物比例，建立了一种能同时检测 Mmc 与
Mo 核酸的双重 PCR 方法。且通过特异性、敏感性
及临床疑似病例检测，表明了所建方法具有较好的
特异性与敏感性，可初步应用于山羊CCPP病原诊断。
自 1988 年杜氏肌营养不良症首次以多重 PCR
方法诊断以来［11］，多重 PCR 在病原检测方面突显
了其快速、便捷、经济等多方面优点。一个多重
PCR 方法建立能否成功取决于各对引物之间的特异
情况及解链温度［12, 13］，每对引物应与各自扩增基因
高度特异，且引物间无连续互补序列，引物间解链
温度相差过大也无法保证同一退火温度下所有引物
与模板有效复性。本试验所设计的两对引物 Ps/Pa
与 Ms/Ma 分别针对 Mmc 与 Mo 16S rRNA 基因，经过
与 GenBank 登录序列比对分析，两对引物之间彼此
特异，无引物二聚体存在。且两对引物解链温度在
56.9-57.4℃之间，保证了两对引物于同一温度下可
同时结合于 DNA 单链分子上。通过对退火温度进行
梯度优化，两对引物于 54℃能高效、特异地与模板
结合。
目前，国内 CCPP 主要病原为 Mmc 与 Mo，二
者单独或共同感染山羊时，症状表现与剖检大体病
理变化几无差别［14, 15］，临床上无法据此判定何种病
原所导致。且资料显示［16］，Mmc 与 Mo 免疫原性存
在差异，疫苗免疫方式上亦不相同，因此，对疑似
CCPP 病例确诊病原将对防控该病具重要意义。本研
究所建 CCPP 病原快速诊断方法不仅可简单快速地
确诊病因，而且能准确判定病原是单独感染还是共
2012年第3期 99张双翔等 ：山羊传染性胸膜肺炎病原快速诊断方法的建立
同感染，对如何进一步根据病原流行情况科学合理
地制定预防控制及治疗措施提供了理论依据与技术
支持，也将为 CCPP 病原学研究奠定了基础。
4 结论
本研究分别设计 Mmc 与 Mo 16S rRNA 基因特异
性引物，通过优化反应条件及体系，建立了特异性强、
敏感度高的 CCPP 病原诊断双重 PCR 方法，并根据
病原传统分离鉴定，证明所建方法可初步应用于临
床病例诊断。
参 考 文 献
［1］ 蔡宝祥 . 家畜传染病学［M］. 北京 : 中国农业出版社 , 2001:233-
261．
［2］ Balikci E, Kizil O, Karapinar T, et al. Efficacy of marbofloxacin
for naturally occurring contagious caprine pleuropneumonia. Small
Ruminant Research, 2008, 77:75-79.
［3］ 卫广森 . 兽医全攻略 - 羊病［M］. 北京 : 中国农业出版社 , 2009:
137-140.
［4］ Longley EO. A study of the disease in Nigeria.Veterinary Science
and Animal Husbandry, 1951（7）:4-27.
［5］ Mackay JMK, Nisbet DI, Foggie A. Isolation of pleuropneumonia-
like organisms（Genus Mycoplasma）from case of sheep pulmonary
adenomatosis（S.P.A）.Vet Rec, 1963, 75（21）:550-551.
［6］ MacOwan KJ. A mycoplasma from chronic caprine pleuropneumonia
in Kenya. Trop Anim Hlth Prod, 1976（8）:28-36.
［7］ 辛九庆 , 李媛 , 张建华 , 等 . 一株山羊支原体山羊肺炎亚种的分
离鉴定与分子特征 . 中国预防兽医学报 , 2007, 4（4）:243-248.
［8］ Hadush B, Eshetu L, Mengistu W, et al. Seroprevalence of contagious
caprine pleuropneumonia in Kefta Humera, Alamata（Tigray）and
Aba-ala（Afar）, Northern Ethiopia. Trop Anim Health Prod, 2009,
41:803-806.
［9］ 毕丁仁 , 王桂枝 . 动物霉形体及研究方法［M］. 北京 ：中国农
业出版社 , 1999.
［10］ Patel H, Mackintosh D, Ayling, RD et al. A novel medium
devoid of ruminant peptone for high yield growth of Mycoplasma
ovipneumoniae. Veterinary Microbiology, 2008, 127:309-314.
［11］ Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, et al. Detection screening
of the Duchenne muscular dystrophy locus viam ultiplex DNA
amplification. Nucleic Acids Res, 1988, 16（23）:41-56.
［12］ 刘森 .PCR 聚合酶链式反应［M］. 北京 : 化学工业出版社 ,
2009:217-222.
［13］ 丁亮 , 魏建忠 , 李郁 . 鸡毒支原体强毒株与 F 疫苗株双重 PCR
检测方法的建立 . 中国微生态学杂志 , 2011, 5（23）:467-469.
［14］ 万一元 , 龙鳌 , 万晴姣 , 等 . 贵州山羊传染性胸膜肺炎病原的
分离鉴定 . 中国草食动物 , 2001, 3（4）:44-46.
［15］ 李媛 , 陶岳 , 阿依吐拉·肉孜 , 等 . 从湖羊肺脏中分离绵羊肺
炎支原体的鉴定 . 中国预防兽医学报 , 2006, 7（4）:375-379.
［16］ 覃志初 . 丝状支原体山羊亚种膜蛋白的组成与免疫原性研
究［D］ . 重庆 ：西南大学 , 2008:35-44.
（责任编辑 李楠）