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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2012-02-23
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30873082), 国家科技支撑计划项目（2008BAI63B05）, 教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-07-0376）,
暨南大学 211 计划
作者简介 : 张志红 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 二磷酸核苷激酶 A 抑癌蛋白 ; E-mail: doublered0526@163.com
通讯作者 : 熊盛 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 生物技术药物蛋白质结构与功能 ; E-mail: xiongsheng@jnu.edu.cn
氧化还原对 NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响
张志红 吕芬 高雪 杨依丽 罗勇 熊盛
（暨南大学生命科学技术学院生物医药研究开发基地，广州 510632）
摘 要： 对核苷二磷酸激酶 A（NDPK-A）及其 4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化，测定它们在氧化还原条件及
正常条件下的磷酸转移酶活性，研究氧化还原及二硫键异构对 NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生
型 NDPK-A（PBV-NDPK-A）及 4种突变型 NDPK-A基因（PBV-NDPK-A C4S，PBV-NDPK-A C109S，PBV-NDPK-A C145S，PBV-
NDPK-A C4/109/145S）在大肠杆菌中高效表达；以 DEAE-sepharose Fast Flow 离子交换层析与 Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B
亲和层析技术纯化目的蛋白；HPLC法测定比较野生型 NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示，
NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达；经纯化分别获得了均一的 NDPK-A蛋白及突变体蛋白，纯度均达到 98%；在还原环境
下 NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性，但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧
化还原环境对 NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响，提示氧化还原环境可能调控 NDPK-A二硫键的形成，影响蛋白
的聚集状态，从而影响蛋白的磷酸转移酶活性，并且 NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。
关键词： 核苷二磷酸激酶 A 氧化还原 磷酸转移酶活性
Effect of the Redox on Phosphotransferase Actixity of
NDPK-A and Its Mutants
Zhang Zhihong Lü Fen Gao Xue Yang YiLi Luo Yong Xiong Sheng
（Biomedical Research and Development Center, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632）
Abstract: It was to express and purify nucleoside diphosphate kinase A（NDPK-A） and its cysteine mutants, measure their
phosphotransferase activity under the redox and normal conditions, and study the influence of redox and disulfide bond on phosphotransferase
activity of NDPK-A and its mutants. Wide type NDPK-A and its mutants proteins were expressed in E.coli and purified by DEAE-sepharose Fast
Flow and Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B, and their phosphotransferase activity under the redox and normal conditions were detected by
reverse high performance liquid chromatography （HPLC）. Results showed that NDPK-A and its mutants were expressed in E.coli efficiently,
the homogeneous recombination proteins were obtained with the purity of 98%. The phosphotransferase activity of NDPK-A and its mutants
under reducing conditions was higher than that under normal conditions, but lower than that under oxidizing conditions, obviously. To a certain
extent, redox affected the structure and phosphotransferase activity of NDPK-A and its mutants. NDPK-A contains complex mechanism of redox
regulation activity by the analysis of enzyme activities between mutants and wild type NDPK-A.
Key words: NDPK-A Redox Phosphotransferase activity
核苷二磷酸激酶 A（NDPK-A）是一种多功能蛋
白，其首要功能是通过催化 NDP 和 NTP 之间的磷
酸基转移反应来维持 NTP 浓度，另外调节细胞增殖、
分化、发育和凋亡，与多种肿瘤的转移负相关［1， 2］。
研究其多种功能及调控机制对于揭示细胞增殖等多
种生命现象具有重要意义。但是，NDPK-A 的多功
能调控机制却仍未被透彻地揭示，特别是它的氧化
还原结构调控其功能的机制。NDPK-A 肽链中有 3
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期130
个半胱氨酸位点，它们分别是 4 位（C4）、109 位
（C109）和 145 位（C145），这 3 个半胱氨酸在不
同氧化还原条件下可以形成链内二硫键和链间二硫
键，从而使 NDPK-A 可以随着氧化还原电势的变化
而发生结构异构。2000 年，Song 等［3］根据体外试
验结果提出，NDPK 活性在体内可能受氧化还原信
号系统调节。2002 年，Kim［4］发现，老年性痴呆和
唐氏综合症患者大脑中 NDPK-A 表达量和活性均明
显下降。近年来也有文献报道，NDPK-A 的功能是
由 Cys109 的氧化还原而非活性中心调节的，因活性
氧（reactive oxygen species，ROS）导致的谷胱甘肽
化和二硫键的形成抑制了 NDPK-A 酶活性和肿瘤抑
制作用［5］。另外，本实验室在前期的试验中发现，
NDPK-A 经 NAC 等还原剂处理后，酶活性升高，而
足够浓度的 H2O2 等强氧化剂可使酶活性消失，因此
推测 NDPK-A 氧化还原异构可能是其多能性的调控
基础。前期研究结果显示，在弱氧化剂的作用下形
成链内二硫键后，酶活性下降 ; 若继续氧化形成链
间二硫键，则导致六聚体降解为二聚体，酶活性消失。
这说明 NDPK-A 多肽链中的 Cys 残基形成的二硫键
有可能是该酶活性的一种负调控机制［6］。是否 Cys
所导致的二硫键异构不利于磷酸转移酶活性的发挥，
是否 NDPK-A 的磷酸转移酶活性受氧化还原调控的
影响，为了进一步对此假说研究，对纯化获得的均
一 NDPK-A 及突变体蛋白，在氧化还原及自然环境
下进行磷酸转移酶活性的测定，从而研讨氧化还原
对其磷酸转移酶活性的影响，进一步为氧化还原结
构调控其功能的机制和 NDPK-A 磷酸转移酶活性在
抑制肿瘤转移方面发挥作用提供物质基础。
1 材料与方法
1.1 材料
表 达 质 粒 PBV220-NDPK-A，PBV220-NDPK-A
C4S，PBV220-NDPK-A C109S，PBV220-NDPK-A
C145S，PBV220-NDPK-A C4/C109/C145S 由本实验室
构建并保存；E.coli DH5α 工程菌购自 Promega 公司；
层析基质 DEAE-sepharose Fast Flow 购自 Pharmacia
Biotech 公司，Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B 购
自 Millipore 公司 ；ATP 和 UDP 购自 Sigma 公司 ；高
效液相色谱仪为 HP1100 型和 Waters 600 型。
1.2 方法
1.2.1 表达质粒 PBV220-NDPK-A C4S，PBV220-ND-
PK-A C109S，PBV220-NDPK-A C145S，PBV220-ND-
PK-A C4/C109/C145S 的鉴定 利用限制性内切酶
EcoR I、BamH I 对本实验室已经构建并保存的几种
表达质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的质
粒送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.2 NDPK-A 及突变体 NDPK-A C4S，NDPK-A C-
109S，NDPK-A C145S，NDPK-A C4/C109/C145S 的诱
导表达 NDPK-A 及 4 种突变基因转化的工程菌 DH
［pBV-NDPK-A］ 、DH［pBV-NDPK-A C4S］、DH
［pBV-NDPK-A C109S］、DH［pBV-NDPK-A 145S］、
DH［pBV-NDPK-A C4/C109/C145S］、菌种分别涂布
到含氨苄 LB 平板上，挑单克隆接种于 50 mL 的 LB
培养基中（含氨苄青霉素 100 μg/mL） ，于 37℃培养
过夜，按 1％的比例接种到 300 mL 的 LB 培养基中，
37℃摇床中培养，当培养液 OD600 值达到 0.6-0.8 时，
42℃诱导 6 h，收集菌体，进行 SDS-PAGE 电泳，观
察表达情况。
1.2.3 NDPK-A 及突变体 NDPK-A C4S，NDPK-A C-
109S，NDPK-A C145S，NDPK-A C4/C109/C145S 蛋
白的纯化 以 DEAE-sepharose Fast Flow 离子交换层
析与 Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B 亲和层析技
术纯化目的蛋白。其中野生型 NDPK-A，NDPK-A
C4S，NDPK-A C109S 蛋白的纯化条件一致。步骤为：
经超声破碎后的菌液上清上样于 DEAE-sepharose
Fast Flow，缓冲液 B（ 20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L
EDTA、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT，0.05 mol/L
NaCl，pH7.5 ）洗脱杂蛋白，缓冲液 C（ 20 mmol/L
Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、2 mmol/L MgCl2、1
mmol/L DTT，0.1 mol/L NaCl，pH7.5 ） 洗脱目的蛋白，
收集目的蛋白峰上样于 Cibacron Blue 3GA Sepharose
CL-4B， 缓 冲 液 E（ 20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L
EDTA、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT、0.1mol/L
NaCl、1.5 mmol/L ATP，pH7.5） 洗脱并收集目的蛋白。
NDPK-A C145S，NDPK-A C4/C109/C145S 蛋白在上
样 Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B 后，由缓冲液
F（20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、2 mmol/L
MgCl2、1 mmol/L DTT、0.15 mol/L NaCl、1.5 mmol/L
2012年第6期 131张志红等 ：氧化还原对 NDPK-A 及突变体磷酸转移酶活性的影响
ATP，pH7.5） 洗脱目的蛋白，其他同前。
1.2.4 野生型NDPK-A及4种突变体的磷酸转移酶活
性研究 HPLC 色谱条件：Phenomenex Cl8 柱，250×
4.6 mm，5 μm（USA）；柱温 ：25℃ ；检测波长 ：
254 nm ；流速 ：1 mL/min，柱压 ：1 948 PSI。标准曲
线 ：将 ATP（5 mmol/L）标准溶液依次稀释成 0.1、
0.2、0.3、0.4 和 0.5 mmol/L 标准应用液，分别进样
10 μL，以保留时间定性，峰面积定量，制作标准曲
线。在 NDPK-A 及突变体蛋白中分别加入一定体积
的还原剂 DTT（终浓度 2.5 mmol/L）和氧化剂 H2O2
（终浓度 0.25 mmol/L），使蛋白终浓度 0.001 mg/mL，
37℃，反应 1 h。HPLC 法测定其磷酸转移酶活性 ：
加入 UDP、ATP、缓冲液后，恒温至 37℃，再分别
加入 NDPK-A 野生型及突变体（还原剂 DTT，氧化
剂 H2O2 处理过和未经任何处理的蛋白质），37℃恒
温反应 10 min，加入甲酸终止反应，混匀取样进行
HPLC 检测。
2 结果
2.1 突变体基因的鉴定
分别对重组质粒进行 EcoR Ⅰ /BamH Ⅰ双酶切，
1% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，酶切后获得目的
片段大小在 500 bp，与理论值一致，而且测序鉴定，
说明本实验室已经构建并保存的这几种表达质粒可
用于下步试验，重组质粒 PBV220-NDPK-A 的示意
图如图 1 所示，其他几种重组质粒同此。
2.2 野生型NDPK-A及突变体的诱导表达
当培养液 OD600 值达到 0.6-0.8 时，42℃诱导 6
h，收集菌体，进行 SDS-PAGE 电泳，观察表达情
况，结果如图 2 所示。与未诱导的菌株相比，野生
型 NDPK-A 及各突变体在此条件下均高效表达，继
而可开展后续试验研究。
图 1 重组质粒 PBV220-NDPK-A的构建示意图
图 2 诱导表达 NDPK-A及突变体的 SDS-PAGE电泳图
1. 蛋白质分子量标准 ；2. 未诱导菌株 ；3. NDPK-A C4S ；4. NDPK-A C109S ；
5. NDPK-A C145S ；6. NDPK-A C4/109/145S ；7. 野生型 NDPK-A
2.3 野生型NDPK-A及突变体的纯化
在离子交换层析过程中，均由缓冲液 C 进行目
标蛋白的洗脱，但是在亲和层析过程中，由于它们
与 ATP 的亲和能力不同，所以洗脱条件也有所不同。
图 3 所示为 NDPK-A C109S 蛋白纯化曲线示意图，
其他蛋白谱图类似。其中 NDPK-A C4S 和 NDPK-A
C109S 两种突变体蛋白与野生型 NDPK-A 的纯化条
件相同，目标蛋白由缓冲液 E（含 0.1 mol/L NaCl）
洗脱，而 NDPK-A C145S 和 NDPK-A C4/C109/C145S
两种突变体蛋白纯化的目标蛋白由缓冲液 F（含
0.15 mol/L NaCl）洗脱。经 SDS-PAGE 电泳分析（图
4）可知，NDPK-A C109S 蛋白在离子交换层析过程
中，缓冲液 C 能够有效地洗脱出目标蛋白，但是蛋
白纯度不高，再次经过 Cibaeron Blue 3GA 染料亲和
层析之后，可获得均一目标蛋白，NDPK-A C4S 蛋
白的纯化同此。如图 5 所示，NDPK-A C145S 蛋白在
离子交换层析中也是由缓冲液 C 洗脱目标蛋白，同
样需要经过 Cibaeron Blue 3GA 染料亲和层析，但是
NDPK-A C145S 蛋白则需由缓冲液 F 洗脱，NDPK-A
C4/C109/C145S 蛋白的纯化同此。对纯化得到的野生
型 NDPK-A 蛋白及突变体蛋白 SDS-PAGE 电泳分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期132
纯度，如图 6 所示，Genetool 软件分析目的蛋白相 对含量，纯度高达 98％。
A.NDPK-A C109S 蛋白通过 DEAE 纯化曲线图 ; B.NDPK-A C109S 蛋白通过亲和层析纯化曲线图
图 6 SDA-PAGE分析 NDPK-A及突变体纯化产物
图 5 SDS-PAGE分析重组蛋白 NDPK-A C145S，
NDPK-A C4/C109/145S的纯化
图 4 SDS-PAGE分析重组蛋白 NDPK-A
C4S，NDPK-A C109S的纯化
图 3 NDPK-A C109S蛋白纯化曲线示意图
1. 蛋白质分子量标准 ；2. 重组蛋白 NDPK-A C109S 层析上清 ；
3. 重组蛋白 NDPK-A C109S 经离子层析缓冲液 C 洗脱组分 ；4. 重组
蛋白 NDPK-A C109S 经离子层析缓冲液 B 洗脱组分 ；5. 重组蛋白
NDPK-A C109S 亲和穿透样品 ；6. NDPK-A C109S 经亲和层析缓冲液
E 洗脱组分 ；7. NDPK-A C4S 经亲和层析缓冲 E 洗脱组分
1. 蛋白质分子量标准 ；2. 重组蛋白 NDPK-A C145S 层析上清 ；3. 重组蛋白
NDPK-A C145S 经离子层析缓冲液 C 洗脱组分；4. 重组蛋白 NDPK-A C145S
经离子层析缓冲液 B 洗脱组分；5. 重组蛋白 NDPK-A C145S 亲和穿透样品；
6. NDPK-A C145S 经亲和层析缓冲液 E 洗脱组分 ；7. NDPK-A C145S 经亲
和层析缓冲 E 洗脱组分
1. 蛋白质分子量标准 ；2. NDPK-A C4S ；3. NDPK-A C109S ；4. NDPK-A
C145S ；5. NDPK-A C4/C109/C145S ；6. 野生型 NDPK-A
2.4 野生型NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性测定
结果
NDPK-A 能催化核苷三磷酸的 γ- 磷酸基团转
移到二磷酸核苷酸上，利用嘌呤 / 嘧啶、核糖 / 脱
氧核糖二磷酸核苷酸作为底物，催化形成相应的
三磷酸核苷酸。选用 ATP，UDP 作为反应底物，
以 NDPK-A 催化 UTP 的生成能力来衡量其磷酸转
移酶活性。首先将 ATP（5 mmol/L）标准溶液依
次稀释成 0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mmol/L 标准应
用液，以不同浓度对 ATP 峰面积绘制标准曲线，
2012年第6期 133张志红等 ：氧化还原对 NDPK-A 及突变体磷酸转移酶活性的影响
y=62.118x+0.5892，R2=0.9998，线性关系良好，相
关性系数较高，此试验条件及方法可行。在还原
剂 DTT，氧化剂 H2O2 和自然条件下，分别测定
NDPK-A 及突变体的磷酸转移酶活性，以 NDPK-A
C4S 蛋白的 HPLC 活性测定谱图（图 7）为例，其他
蛋白 HPLC 活性测定谱图如同。酶比活定义为 ：1mg
酶所具有相对的催化能力，即 1 mg 酶所具有的酶活
性单位。计算公式如下 ：
酶比活 =［反应体系总量 ×（ΔUTP/（UTP+
UDP）］/（酶蛋白含量 × 进样量 × 反应时间）。
对 NDPK-A 及突变体进行 3 次独立试验测定它
们的磷酸转移酶活性，通过计算后，它们的酶活性
结果如下表 1 所示。3 次试验结果分析如图 8 所示，
同一蛋白 3 次试验都表明，与自然条件相比，还原
剂 DTT（终浓度 2.5 mmol/L）条件下酶活性有所升
高，但是在氧化剂 H2O2（终浓度 0.25 mmol/L）条
件下酶活性显著下降，甚至没有活性。这一结论与
前期酶活性研究，在弱氧化剂的作用下形成链内
二硫键后，酶活性下降 ; 若继续氧化形成链间二硫
键，则导致六聚体降解为二聚体，酶活性消失相符
合。然而在还原剂 DTT 条件下的酶活性，可能与
二硫键的形成受阻有关，从而影响其活性，但是氧
化还原结构调控其酶活性的机制仍然需要进一步
研究。
A. ATP-UDP 的 HPLC 谱图 ; B. NDPK-A C4S 蛋白在自然条件下酶活性测定的 HPLC 谱图 ; C.NDPK-A C4S 蛋白
在还原条件下酶活性测定的 HPLC 谱图 ; D. NDPK-A C4S 蛋白在氧化条件下酶活性测定的 HPLC 谱图
图 7 NDPK-A C4S酶活性测定时底物和产物的 HPLC谱图
表 1 NDPK-A及其突变体的磷酸转移酶活性结果
NDPK-A 及其突变体 酶活性（U/mg）自然条件下酶活性 还原剂 (DTT) 条件下酶活性 氧化剂 (H2O2) 条件下酶活性
NDPK-A C4S 2508±40 2767±10.7 101±6.1
NDPK-A C109S 2549±14.7 2693±19.2 332±66.7
NDPK-A C145S 2440±8.04 2610±13.8 147±56.09
NDPK-A C4/109/145S 1270±187.5 2543±15.6 220±5.6
NDPK-A 1267±151 2096±159 106±2.1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期134
3 讨论
近年来的研究发现，NDPK 可以通过减少二磷
酸鸟苷（GDP）生成三磷酸鸟苷（GTP）的量，使
得肿瘤细胞的多种生长因子与细胞膜上的受体结合
后产生的信号因 GTP 的量不足而发生传导障碍，进
而抑制肿瘤细胞的转移［7］。NDPK-A 具有多功能生
物活性，且其活性只存在于六聚体结构形式中［8，9］。
例如，NDPK-A 突变体 NDPKA S120G 导致恶性成
神经细胞瘤发生，是因为丝氨酸突变致使 NDPK-A
的六聚体结构减少，二聚体结构增加［10， 11-15］。本
实验室前期工作中发现，NDPK-A 在氧化环境中可
以形成链间二硫键和链内二硫键，进而产生多种氧
化还原异构。同时，本实验室前期对非还原 SDS-
PAGE 电泳中的 4 个条带进行分析，按分子量大小
分别是氧化态（38.3 kD）> 还原态（35.2 kD）> 氧
化态二聚体（21.3 kD）> 还原态二聚体（18.1 kD），
发现 C4 和 C145 在氧化环境中先形成链内二硫键，
进一步氧化后 C109 位与 C109 位形成链间二硫键，
NDPK-A 肽链中的半胱氨酸残基在氧化环境中容易
形成分子内与分子间的二硫键，且据推测在体内
NDPK-A 参与细胞的信号传导是通过 ROS 系统发生
氧化还原异构发挥作用的。为了研究 NDPK-A 氧化
还原异构机制对活性的影响，本试验利用实验室前
期已构建的 C4S，C109S，C145S，C4/C109/C145S 突
A. NDPK-A C109S; B. NDPK-A C4S; C. NDPK-A; D. NDPK-A C4/109/145S; E. NDPK-A C145S; x-±s，n=3，* 与 normal 相比 P<0.05，＃与 normal 相比 P<0.05
图 8 NDPK-A及突变体在各条件下磷酸转移酶活性测定结果
变体，分别进行野生型 NDPK-A 及突变体的表达纯
化，并对其磷酸转移酶活性进行研究。通过温控诱
导，成功表达目标蛋白 ；通过纯化技术得到均一的，
纯度较高的具有活性的蛋白。但是在纯化蛋白的过
程中发现，C4S 和 C109S 突变体的纯化条件与野生
型 NDPK-A 一致，在亲和层析中，以含有 0.1 mol/L
NaCl 的缓冲液洗脱目的蛋白，而 C145S 和 C4/C109/
C145S 突变体则需要提高 NaCl 浓度至 0.15 mol/L，
这提示相比于野生型NDPK-A，C4S和 C109S突变体，
C145S 和 C4/C109/C145S 突变体蛋白与填料底物之
间的结合力更强，这可能与它们的构象有关系。在
之后的磷酸转移酶活性的研究中，试验结果显示在
氧化环境下，NDPK-A 及其突变体的磷酸转移酶活
性明显低于正常环境，但是在还原条件下活性则略
高于正常环境。这说明氧化还原的确对 NDPK-A 及
突变体的活性有影响，NDPK-A 在酶活性方面存在
复杂的结构调控，这些调控与氧化还原有密切联系，
从而影响着它们的活性。这为氧化还原结构调控其
功能的机制和 NDPK-A 磷酸转移酶活性在抑制肿瘤
转移方面的研究提供基础。
4 结论
在本研究中 NDPK-A 及突变体在大肠杆菌中高
效表达，经 DEAE-sepharose Fast Flow 离子交换层析
2012年第6期 135张志红等 ：氧化还原对 NDPK-A 及突变体磷酸转移酶活性的影响
与 Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B 亲和层析纯化
分别获得了均一的 NDPK-A 蛋白及突变体蛋白，纯
度均达到 98%。同一蛋白 3 次试验都表明双氧水环
境下的酶活性很低，几乎没有活性，DTT 环境下酶
活性比自然环境下活性稍高，但是变化并不明显，
分析可能是 DTT 的浓度不足以对 NDPK-A 及突变体
结构和活性改变。在还原环境下 NDPK-A 及突变体
的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性，但是
在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境
下。氧化还原环境对 NDPK-A 结构异构及磷酸转移
酶活性有一定的影响，这提示氧化还原环境可能调
控 NDPK-A 二硫键的形成，影响蛋白的聚集状态，
从而影响蛋白的磷酸转移酶活性，并且 NDPK-A 结
构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。
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（责任编辑 李楠）