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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
收稿日期 ： 2014-01-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81101220），天津市应用基础与前沿研究计划项目（12JCQNJC08100），“十二五”天津市中青年骨干创
新人才支持计划，天津市教委高等学校科技发展基金计划项目（20130624）
作者简介 ：张西轩，男，硕士研究生，研究方向 ：病原微生物与基因工程 ；E-mail ：xixuanzhang@163.com
通讯作者 ：阮海华，博士，副教授，研究方向 ：病原微生物与基因工程 ；E-mail ：ruanhaihua@tjcu.edu.cn
一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化 GST-TRAF6
融合蛋白的方法
张西轩  李晔  张振奇  董世瑞  赵培  阮海华
（天津商业大学 天津市食品生物技术重点实验室 生物技术与食品科学学院，天津 300134）
摘 要 ： 利用 8 mol/L 尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的 GST-TRAF6 融合蛋白进行变性，通过逐级稀释复性的方法对
尿素溶解后的 GST-TRAF6 融合蛋白进行复性，将复性后的 GST-TRAF6 融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法
进行分离纯化，将分离纯化后的蛋白通过 Western blot 方法进行验证，最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化
后的 GST-TRAF6 融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析 3 个步骤后纯化得到纯
度达 90% 以上、浓度为 396 ng/μL 的蛋白质溶液。利用 GST 蛋白作为对照，经 Western blot 验证表明，纯化得到的蛋白确为 GST-
TRAF6 融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现，17 ng/μL 浓度的 GST-TRAF6 融合蛋白能够以泛素分子
作为底物在 5 min 内快速催化自由泛素链的生成。结果表明，表达在大肠杆菌包涵体中的 GST-TRAF6 融合蛋白经尿素变性溶解后
能够成功复性并分离纯化，在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了
一种新的复性方法。
关键词 ： TRAF6 蛋白纯化 包涵体复性 重组蛋白
Purification of GST-TRAF6 Fusion Proteins from
Inculsion Body Expressed in E. coli
Zhang Xixuan Li Ye Zhang Zhenqi Dong Shirui Zhao Pei Ruan Haihua
（Tianjin Key Laboratory of Food Science ＆ Biotechnology，College of Biotechnology ＆ Food Science，
Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134）
Abstract:  There was only a minor fraction of GST-TRAF6 fusion proteins were observed soluble when expressed in E.coli. Most of
the GST-TRAF6 fusion proteins were present in the inclusion body, in which the expressed proteins aggregate and exist in inactive. To obtain
GST-TRAF6 fusion protein in a high yield and high purity, a method to purify the GST-TRAF6 fusion proteins from inclusion body without
any loss of its bioactivity was constructed. Firstly, the inclusion body was denatured with 8 mol/L urea. Secondly, the GST-TRAF6 fusion
protein in inclusion body were gradually solubilized by gradient dilution renaturation. Once the GST-TRAF6 fusion protein was fully dissolved
in renaturation solution, it was conventional to purify the GST-TRAF6 fusion protein with glutathione sepharose 4B. The specificity and the
bioactivity of the purified GST-TRAF6 fusion protein were testified by western blot and in vitro ubiquitination assay, respectively. The results
indicated that GST-TRAF6 fusion protein were successfully solubilized by gradient dilution renaturation following the denaturation of 8 mol/L
urea, the concentration of the purified GST-TRAF6 fusion protein was achieved a concentration of 396 ng/μL with a purity over 90%. The
specificity of this GST-TRAF6 fusion proteins were identified with anti-GST western blot. In vitro ubiquitination assay indicated that the GST-
TRAF6 fusion protein in a concentration of 17 ng/μL could rapidly catalyze the formation of free ubiquitin chains within 5 minutes. In conclusion,
it was found that the GST-TRAF6 fusion protein could be successfully renatured with the method of gradient dilution renaturation with the
recovery of its capability of ubiquitin ligase. This results would supply a useful method for the large-scale purification of proteins from inclusion
body when expressed in E. coli.
Key words:  TRAF6 Protein purification Inclusion body renaturation Recombinant protein
2014年第8期 183张西轩等 ：一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法
肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumornecrosis fac-
tor receptor-associated factors，TRAFs）是肿瘤坏死因
子（Tumornecrosis factor，TNF）超家族和 Toll 样 / 白
细胞介素 -1 受体（toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重
要的接头分子，在天然免疫和获得性免疫中发挥
重要作用［1，2］。TRAFs 包括 7 个密切相关的蛋白
（TRAF1-7），其中 TRAF6 是脂多糖（Lipopolysacch-
aride，LPS）、TIR 和 TNF（Tumor necrosis factor）等
刺激信号的下游分子［3-5］。TRAF6 含有 C 端 TRAF
结构域和 N 端激活结构域，可以和多种激酶结合［6］。
其中，其 N 端激活结构域包括一个 RING 型泛素连
接酶（ubiquitin ligase enzyme，E3）结构域，该结构
域具有泛素连接酶活性，可在泛素结合酶（ubiquitin-
conjugating enzyme，E2）UbcH5c 的介导下催化自由
泛素分子形成多聚泛素链［7，8］。研究表明，TRAF6
与炎症、骨代谢、乳腺发育、淋巴结的形成密切相关，
参与免疫性疾病、骨髓瘤、急性胰腺炎、前列腺癌
等疾病的病理机制，在细胞的生长、发育以及疾病
过程中发挥重要的作用［9］。孙利等［10］在大肠杆菌
中诱导了 GST-TRAF6 融合蛋白的表达，并利用谷胱
甘肽琼脂糖树脂纯化到了该融合蛋白。但是，大肠
杆菌中表达的 GST-TRAF6 融合蛋白只有少部分重组
蛋白是可溶的，大部分的重组蛋白在大肠杆菌表达
过程中主要以包涵体的形式存在。较低的蛋白可溶
性降低了 GST-TRAF6 融合蛋白的纯化效率以及重组
蛋白的纯化总量，因此，在孙利等［10］的研究成果
基础上，本研究运用了一种从包涵体中复性并分离
纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法，以期获得更高产
量更高纯度的 GST-TRAF6 融合蛋白，降低纯化成本，
并为今后进一步研究 TRAF6 蛋白的结构与功能打下
坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）
感受态细胞购自美国 Promega 公司 ；pGEX-6P-2 原
核表达载体购自 GE Healthcare 公司。
1.1.2 酶 与 试 剂 辣 根 过 氧 化 物 酶（HRP） 偶 联
羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶（HRP）偶联羊
抗 兔 二 抗、γ-ATP 购 自 美 国 Promega 公 司 ；兔 源
TRAF6 抗体（α-TRAF6 Cat ：sc-7221）、鼠源泛素抗
体（α-Ub，Cat ：sc-8017） 购 自 美 国 Santa Cruz 公
司 ；HeLa 细 胞 cDNA 文 库（Cat ：YJ0001） 购 自 上
海英基生物科技有限公司 ；琼脂糖、尿素、DTT、
Triton X-100、IPTG、PMSF 购自美国 Amresco 公司 ；
Bgl Ⅱ、BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ限制性内切酶、T4 DNA
连 接 酶、Pfu DNA 聚 合 酶、dNTP、DNA Marker 购
自日本 TaKaRa 公司 ；PCR 及酶切产物纯化试剂盒、
质粒 DNA 提取试剂盒购自中国北京天根公司 ；预
染蛋白 Marker 购自美国 Thermo 公司 ；超滤浓缩管、
泛 素 激 活 酶 E1（Cat ：14-857）、UbcH5c（Cat ：23-
035）、ECL 化学发光试剂盒购自美国 Millipore 公司；
X 光片购自美国 Kodak 公司 ；Ubiquitin 蛋白由西南
大学李洪涛教授提供 ；引物合成以及测序由上海英
骏生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 TRAF6 基因的克隆与原核表达载体的构建
以 HeLa 细胞 cDNA 文库为模板，上游引物序列为
5-CGAGATCTATGAGTCTGCTAAACTGTGAAAAC-3
（下划线为 Bgl Ⅱ酶切位点），下游引物序列为 5-G-
CCTCGAGCTATACCCCTGCATCAGTAC-3（下划线为
Xho Ⅰ酶切位点），以 58℃作为退火温度进行 PCR
扩增，将 PCR 产物回收后分别用 Bgl Ⅱ和 Xho Ⅰ
双酶切并回收产物。同时利用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ
双酶切 pGEX-6p-2 空载体，回收并将其与酶切后
的 TRAF6 片段进行连接。将连接产物转入 DH5α 大
肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上挑取
单克隆并抽提质粒。其中，由于 TRAF6 基因片段
上第 31-36 位碱基间为 BamH Ⅰ位点，因此在设计
TRAF6 上游引物时选择了 BamH Ⅰ的同尾酶 Bgl Ⅱ
作为酶切位点，而对候选阳性重组质粒的酶切鉴
定采用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ两个酶切位点，将阳性
pGEX-6P-2-TRAF6 重组质粒送上海英骏生物技术有
限公司进行 DNA 测序。测序正确的阳性克隆用于之
后的质粒转化和蛋白的诱导表达。
1.2.2 TRAF6 在大肠杆菌中的诱导表达 将 pGEX-
6P-2-TRAF6 重组质粒转化至大肠杆菌 BL21（DE3），
挑取单克隆至 5 mL LB（含 100 μg/mL 氨苄青霉素）
液体培养基中，并于 37℃、220 r/min 振荡培养过夜。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期184
将过夜培养物接入 1 L LB（含 100 μg/mL 氨苄青霉
素）液体培养基中，并于 37℃、220 r/min 振荡培养
至 OD600=0.6-0.8 之间。将培养物降温至 20℃左右后
加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，20℃、220 r/min
振荡培养过夜 ；收集菌液，室温下 8 000 r/min 离心
30 min ；弃上清，保留沉淀 ；取 10 μL 离心后菌体用
90 μL 无菌水重悬，加入 100 μL 2×SDS 上样缓冲液
混匀，煮沸 5-10 min 后离心，进行 SDS-PAGE，观
察全菌蛋白的表达情况 ；以未经 IPTG 诱导的菌为阴
性对照。
1.2.3 包涵体蛋白的变性、复性与纯化 将上述
收集的菌体利用 50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 内含 150
mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF 的缓冲溶液于冰上进
行超声破碎，超声 3 s、间隔 7 s，超声约 100 次至
悬 液 半 透 明 ；于 14 000 r/min 转 速 下 低 温 离 心 30
min，将离心后的上清弃掉，用破碎缓冲重悬沉淀并
将悬液再次于 14 000 r/min 转速下低温离心 30 min，
沉淀即为包涵体部分。为了去除包涵体中的部分杂
蛋白，首先对包涵体进行洗涤，洗涤液的组成为 50
mmol/L Tris-HCl pH8.0，内含 2 mol/L 尿素、1 mmol/L
EDTA、0.5% Triton X-100、0.1 mol/L NaCl 以 及 10
mmol/L DTT，14 000 r/min 转速下低温离心 10 min，
离心后收集沉淀。将洗涤后的包涵体利用变性液（50
mmol/L Tris-HCl pH8.0，含 8 mol/L 尿素、20 mmol/L
DTT）进行变性溶解 ；将溶解后的包涵体溶液利用
复 性 液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0， 含 0.5 mmol/L
EDTA、50 mmol/L NaCl、5% glycerol、1 mmol/L
DTT）按照 2 倍的梯度进行稀释复性，直至稀释到
尿素终浓度达到 0.5 mol/L ；最后利用截留分子量为
3 kD 的超滤浓缩管浓缩复性后的溶液。浓缩后的复
性溶液与适量的谷胱甘肽琼脂糖树脂匀浆混合，4℃
轻摇 30 min ；于 500 r/min 离心 5 min 后弃上清 ；沉
淀加入 10 倍柱床体积的漂洗液，即 50 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）溶液反复颠倒混匀以洗去未与谷胱甘
肽琼脂糖树脂结合的杂蛋白，4℃、500 r/min 离心 5
min 后弃上清，继续用漂洗液重复洗涤谷胱甘肽琼
脂糖树脂 3 次 ；加入等柱床体积的洗脱缓冲液（50
mmol/L Tris-HCl pH8.0，内含 10 mmol/L GSH）重悬
树脂，室温孵育 10 min 后于 500 r/min 离心 5 min，
保留上清 ；再用等体积的洗脱缓冲液洗脱并离心后
合并 2 次所得上清，即为纯化得到的 GST-TRAF6 融
合蛋白 ；取 100 μL 该蛋白溶液与等体积 2×SDS 上
样缓冲液混匀，煮沸 5-10 min 后离心，进行 SDS-
PAGE，观察蛋白纯化情况。
1.2.4 GST-TRAF6 融合蛋白的 Western blot 检测 将
纯化得到的 GST-TRAF6 融合蛋白样品稀释至终浓度
为 10 ng/μL，取 20 μL 稀释后的蛋白与等体积 2×SDS
上样缓冲液混匀，煮沸 5-10 min 后离心，进行 SDS-
PAGE 电泳后利用半干法转印至 PVDF 膜，转印条件
为 23 V 1 h ；将转印后的 PVDF 膜于 5% 的脱脂奶粉
中封闭 1 h，将兔源 TRAF6 抗体按照 1∶1 000 的比
例稀释后于 4℃下孵育 PVDF 膜过夜 ；次日，TBST
溶液润洗 PVDF 膜 3 次，每次 15 min ；将润洗干净
的 PVDF 膜于室温下用辣根过氧化物酶标记的羊抗
兔 IgG 二抗（稀释比例 1∶5 000）孵育 1 h，TBST
溶液分别润洗 3 次后进行 ECL 化学发光检测，并用
X 光片压片。
1.2.5 GST-TRAF6 融 合 蛋 白 泛 素 连 接 酶 活 性 检
测 泛素连接酶活性测定采用 Yang 等［7］的方法，
30 μL 反应体系包含 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4），2.5
mmol/L MgCl2，50 ng 泛素激活酶 E1，300 ng 泛素结
合酶 UbcH5c，500 ng GST-TRAF6，1 μg 泛素，最后
加入终浓度为 2 mmol/L 的 γ-ATP 启动泛素化反应。
反应温度是 37℃，至 5、10 和 20 min 时分别从反应
体系中吸取 10 μL 反应液并迅速加入 10 μL 2×SDS
载样缓冲终止反应，煮沸 5-10 min 后离心，利用
12.5% SDS-PAGE 进行电泳分离，Western blot 方法
同 1.2.4，一抗为鼠源泛素抗体（稀释倍数 1∶1 000），
二抗为辣根过氧化物酶偶联羊抗小鼠 IgG（稀释倍
数 1∶5 000）。
2 结果
2.1 TRAF6 基因的扩增
TRAF6 是一个包括 522 个氨基酸的具有泛素连
接酶活性的蛋白质。利用 TRAF6 基因特异性引物从
HeLa 细胞 cDNA 文库中以 58℃作为退火温度扩增
TRAF6 基因片段，PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶
电泳检测，在预期的位置（1 569 bp）上出现一条特
异带（图 1）。
2014年第8期 185张西轩等 ：一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法
2.2 pGEX-6P-2-TRAF6 重组克隆质粒的构建
以限制性核酸内切酶 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ对重组
质粒进行双酶切后得到一条与预期条带大小一致的
DNA 片 段（1 533 bp）（ 图 2）， 表 明 pGEX-6P-2 载
体上成功插入了 TRAF6 目标基因片段，初步推断质
粒构建成功。经 DNA 测序鉴定后挑取测序正确的阳
性 pGEX-6P-2-TRAF6 质粒转化至大肠杆菌表达菌株
BL21（DE3）中。
在上清和沉淀中均含有表达的 GST-TRAF6 融合蛋
白（图 3 泳道 3 和泳道 4），但是通过比较上清和沉
淀样品中 GST-TRAF6 融合蛋白的条带粗细情况可以
看出，上清液中 GST-TRAF6 融合蛋白的含量远远低
于包涵体中 GST-TRAF6 融合蛋白的含量，大部分的
GST-TRAF6 融合蛋白在沉淀中以包涵体的形式存在
（图 3 泳道 4），仅有少量的蛋白可溶性地存在于离
心后的上清溶液中（图 3 泳道 3）。
bp
M 1
bp
2000
1569
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：TRAF6 扩增片段
图 1 TRAF6 基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
2.3 GST-TRAF6融合蛋白的诱导表达以及可溶性
检测
在 20℃温度条件下利用 IPTG 诱导重组菌表达
后发现与未诱导的大肠杆菌相比，0.5 mmol/L IPTG
处理诱导了一条分子量介于 72-96 kD 间的蛋白质的
表达，该诱导蛋白的分子量与预期的 GST-TRAF6 融
合蛋白的分子量（26 kD+62 kD）相近（图 3 泳道 1
和泳道 2）。据此推测，利用 0.5 mmol/L IPTG 成功
诱导了 GST-TRAF6 融合蛋白在大肠杆菌中的表达。
将大肠杆菌进行超声破碎后，分别取上清和沉淀进
行 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后发现
bp
M 1
bp
2000 1533
1000
750
M ：DNA Marker ；1 ：pGEX-6P-2-TRAF6
图 2 双酶切鉴定重组质粒 pGEX-6P-2-TRAF6
kD
M 1 2 3 4
170
GST-TRAF6
130
96
72
55
43
34
26
17
M ：Protein Marker ；1 ：诱导前 ；2 ：0.5 mmol/L IPTG 诱导后 ；3 ：破菌后上清 ；
4 ：破菌后沉淀
图 3 GST-TRAF6 融合蛋白的诱导表达以及可溶性检测的
SDS-PAGE 电泳
2.4 包涵体中GST-TRAF6融合蛋白的变性、复性
与纯化
通过对大肠杆菌包涵体利用洗涤液洗涤后进
行 SDS-PAGE 电泳（图 4 泳道 1）检测发现，GST-
TRAF6 融合蛋白含量约占包涵体中总蛋白含量的
75% 以上。将溶解后的包涵体溶液利用复性液以 2
倍的梯度进行缓慢稀释复性，稀释的过程中肉眼可
以观察到没有蛋白质沉淀析出，当该蛋白溶液被复
性液稀释至尿素终浓度为 0.5 mol/L（相当于稀释 16
倍）的浓度时，GST-TRAF6 融合蛋白仍然保持可溶。
将复性后的溶液进一步利用截留分子量为 3 kD 的超
滤浓缩管浓缩 10 倍后进行 SDS-PAGE 电泳检测，结
果（图 4 泳道 2）显示，虽然有部分 GST-TRAF6 融
合蛋白发生降解，但是仍有大量结构完整的 GST-
TRAF6 融合蛋白。
将浓缩后的 GST-TRAF6 融合蛋白利用谷胱甘肽
琼脂糖树脂进行亲和层析纯化，润洗去除杂蛋白后
最终用 10 mmol/L 还原型谷胱甘肽溶液进行目标蛋
白的洗脱，将洗脱后的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳检
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期186
测，结果（图 4 泳道 3）显示，成功纯化到了预期
的目标蛋白，仅有一条微弱的杂带存在，纯化蛋白
纯度达到 90% 以上。表明利用亲和层析法成功纯化
得到目标蛋白，通过对纯化蛋白的浓度进行测定后
发现，纯化得到的目标蛋白的浓度达到 396 ng/μL。
TRAF6 融合蛋白的泛素连接酶活性。泛素化反应结
果（图 6）显示，与 0 min 未发生反应的泛素底物（Ub1）
相比，体外泛素化反应进行 5、10 及 20 min 时均催
化了自由泛素链的生成，包括泛素二聚体（Ub2）、
泛素三聚体（Ub3）、泛素四聚体（Ub4）以及泛素多
聚体（Ubn）。而且从图 6 中可以看出，泛素化反应
进行 5、10 及 20 min 时自由泛素链的生成情况基本
一致，表明 17 ng/μL 浓度的 GST-TRAF6 融合蛋白在
5 min 内即迅速完成了自由泛素链的生成。
kD
M 1 2 3
170
GST-TRAF6
130
96
72
55
M ：Protein Marker ；1 ：8 mol/L 尿素溶解后包涵体全蛋白 ；2 ：梯度稀释复性
后经 3 kD 浓缩管浓缩后的全蛋白 ；3 ：谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化后的 GST-
TRAF6 融合蛋白
图 4 纯化后的 GST-TRAF6 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳结果
2.5 GST-TRAF6融合蛋白的Western blot检测
为了进一步验证纯化的蛋白确为 GST-TRAF6 融
合蛋白，将纯化得到的蛋白稀释至 10 ng/μL 后，取
5 μL 进行 Western blot 分析，同时利用等量的 GST
蛋白作为对照。结果（图 5）显示，利用 GST 抗体
作为一抗成功地将作为对照的 GST 蛋白以及纯化的
目标蛋白检测出来，表明本研究中纯化的蛋白确为
目标 GST-TRAF6 融合蛋白。
kD 1 2
GST-TRAF6
GST
α-GST
130
96
72
55
43
34
26
1 ：GST ；2 ：GST-TRAF6
图 5 GST-TRAF6 融合蛋白 Western blot 检测
kD 1 2 3 4
170
Ubn1309672
55
43
34
26
17
10
α-Ub
Ub4
Ub3
Ub2
Ub1
1-4 ：泛素化时间分别为 0、5、10 和 20 min
图 6 GST-TRAF6 融合蛋白催化自由泛素链生成的
Western blot 检测
2.6 GST-TRAF6融合蛋白泛素连接酶活性检测
为了验证包涵体中的 GST-TRAF6 融合蛋白经
过变性、复性步骤后是否具有与天然蛋白一致的酶
催化活性，本研究通过体外泛素化反应检测 GST-
3 讨论
孙利等［10］曾利用 pGEX-4T-2 质粒作为表达载
体在大肠杆菌中表达 GST-TRAF6 融合蛋白，将大肠
杆菌超声破碎后在可溶性上清中纯化该融合蛋白。
与本研究的结果相类似，孙利等［10］的研究结果表
明在大肠杆菌中表达的 GST-TRAF6 融合蛋白只有少
部分以可溶的形式存在，大部分的融合蛋白以不溶
的形式存在于破菌后的沉淀即包涵体中。基于此，
本试验在该研究的基础上，利用 pGEX-6P-2 作为表
达载体在大肠杆菌中表达，并在大肠杆菌包涵体中
分离纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法。
众所周知，在大肠杆菌中表达重组蛋白的过程
中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，
无法形成正确的次级键等原因容易导致包涵体的形
成［11］。虽然凝集在包涵体中的蛋白没有活性，但是
在包涵体中表达的蛋白占总蛋白的 50% 以上，如果
能成功对表达的目标蛋白进行溶解和复性将大大提
高纯化蛋白的总量以及纯度，并减少了细菌的蛋白
酶对目标蛋白的降解作用。本研究结果表明，利用
2014年第8期 187张西轩等 ：一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化 GST-TRAF6 融合蛋白的方法
尿素变性、梯度稀释复性结合谷胱甘肽琼脂糖树脂
亲和层析 3 个步骤在大肠杆菌包涵体中成功地纯化
到浓度达到 396 ng/μL、纯度超过 90%、具有高泛素
连接酶活性的 GST-TRAF6 融合蛋白。包涵体表达
的 GST-TRAF6 融合蛋白分离纯化成功的关键是高浓
度尿素溶解后包涵体蛋白的复性。在以往的研究中，
包涵体蛋白复性的手段主要包括 ：（1）氧化-还原转
换系统的加入，例如在复性缓冲液中需加入还原型
及氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等给复性蛋
白质提供一个氧化还原环境，促进二硫键的正确行
成 ；（2）聚乙二醇能够减少一些蛋白质的聚集 ；（3）
分子伴侣和折叠酶等可在体外促进蛋白质的折叠复
性等［12］；（4）柱层析法对包涵体蛋白进行复性［13］。
与以往报道的蛋白质复性技术相比较，本研究报道
的 GST-TRAF6 融合蛋白成功复性的创新之处主要包
括两点 ：其一是复性液的构成。本研究中的复性液
除了最适宜蛋白质复性的 pH8.0 外，还含有 5% 的
甘油，一定浓度甘油的加入在一定程度上改变了溶
液的极性和渗透压有利于 GST-TRAF6 的复性。同时
复性液中含有少量的 DTT，改变溶液的氧化还原系
统进而提高了正确配对的二硫键的产率，利用该复
性液我们曾经成功复性过酿酒酵母 PTC6 蛋白［14］。
其二是复性的过程采用的是梯度逐级稀释的方法，
该稀释方法为蛋白质的复性提供了缓慢变化的蛋白
质溶液外环境以及更充分的复性时间。当我们利用
复性液作为透析液对尿素溶解后的包涵体溶液直接
进行透析复性时发现，可能由于尿素去除的速度太
快导致大量的蛋白从溶液中析出，出现絮状沉淀（结
果未列），表明缓慢稀释复性对于 GST-TRAF6 融合
蛋白的复性是更具可行性的方法。
由于泛素连接酶的酶活性检测均为基于 Western
blot 的方法，无法测定其活力与比活力。为此，分
析了前人在研究中利用 TRAF6 蛋白催化体外泛素化
反应的浓度。Zhang 等［15］发现，在 20 μL 的泛素化
反应体系中加入了 0.3 μg TRAF6 蛋白进行泛素化反
应，该浓度相当于 15 ng/μL，与本研究中的 17 ng/μL
的 TRAF6 蛋白浓度相近。Xia 等［16］进行 TRAF6 催
化的自由泛素链生成的体外反应中，TRAF6 蛋白的
浓度为 0.4 μmol/L，而本研究中 17 ng/μL 的 TRAF6
蛋白的浓度经过换算后摩尔浓度为 0.2 μmol/L，即相
当于 Xia 等［16］的体外泛素化反应体系中 TRAF6 蛋
白浓度的一半。以上结果表明，包涵体表达的 GST-
TRAF6 蛋白经变性、复性恢复了较高的生物学活性。
从包涵体中纯化蛋白是生物制药领域常用的而
且成本较低的纯化手段［17］，本研究在获得成功复性
的 GST-TRAF6 融合蛋白的基础上，同时提供了一种
能够广泛用于包涵体蛋白分离纯化的复性技术和手
段，为大规模低成本纯化蛋白提供了一种新的手段
和方法。
4 结论
本研究利用 8 mol/L 尿素溶液变性、梯度稀释复
性和谷胱甘肽琼脂糖亲和层析 3 个步骤从大肠杆菌
包涵体中成功分离纯化得到纯度达 90% 以上、浓度
为 396 ng/μL 的 GST-TRAF6 蛋白质溶液。进一步利
用体外泛素化反应分析其活性发现，17 ng/μL 浓度
的 GST-TRAF6 蛋白能够以泛素分子为底物在 5 min
内快速催化自由泛素链的生成，达到文献中所报道
的 TRAF6 的酶催化活性水平，为从大肠杆菌包涵体
中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）