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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):200-205
深部真菌感染日益成为导致肿瘤放化疗、器官
移植及艾滋病等免疫力低下病人死亡的主要原因［1］，
严重威胁着人类的健康［2，3］。抗真菌药物较为有限，
其本身具有毒副作用并且耐药现象日益增加。寻求
和研发安全有效的抗真菌药至关重要。本课题组前
期研究中，家蝇抗真菌肽 MAF-1（Musca domestica
antifungalpeptide-1）在体外被验证具有抗真菌活性，
可能是一种全新的以 α 螺旋为主的线性昆虫抗真菌
肽［4］。家蝇溶菌酶（lysozyme，LZM）是一类非特
异性免疫因子，在机体的先天免疫中发挥重要作用，
可破坏菌体胞壁、导致细菌死亡，而对人体无毒副
作用［5］。为了寻求新型的抗菌蛋白质或抗真菌－
收稿日期 ：2014-09-01
基金项目 ：国家科技支撑计划（2011BAC06B12），国家自然科学基金项目（81360254），贵州省科学技术基金项目（黔科合 J 字［2012］
2038 号）
作者简介 ：彭传林，男，硕士研究生，主治医师，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：2463749164@qq.com
通讯作者 ：吴建伟，男，博士，教授，研究方向 ：昆虫免疫及应用 ；E-mail ：wjw@gmc.edu.cn
家蝇抗真菌肽 - 溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析
彭传林1，2  魏川川1  吴建伟1  王宇1，3  修江帆1  尚小丽1  赵学军1
（1. 贵阳医学院寄生虫学教研室，贵阳 550004 ；2. 皖北煤电集团总医院，宿州 234000 ；3. 贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004）
摘 要 ： 旨在对家蝇抗真菌肽 MAF-1-溶菌酶（LZM）基因进行生物信息学分析，并进行融合基因 MAF-1-LMZ 的克隆和表
达分析。从 GenBank 获得家蝇抗真菌肽 MAF-1 和溶菌酶 LZM 的编码序列，分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR 扩增融
合蛋白质抗真菌肽 - 溶菌酶的基因 MAF-1-LMZ，将其克隆到原核表达载体 pET-28a 中，重组质粒 pET-28a-MAF-1-LMZ 在大肠杆菌
OrigmiB/DE3 中经用 IPTG 诱导表达，表达产物 MAF-1-LMZ 通过 SDS-PAGE 电泳进行鉴定，采用小试管法倍比稀释法进行活性验
证。结果显示，融合蛋白质 MAF-1-LMZ 序列的 ORF 为 969 bp，编码 322 个氨基酸残基，理论分子量为 35 468.6 Da，等电点为 8.31，
在大肠杆菌 OrigmiB/DE3 中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。
关键词 ： 家蝇 ；抗真菌肽 - 溶菌酶 ；重组表达 ；序列分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.031
Cloning，Expression and Sequence Analysis of Musca domestica
Antifungal Peptide-1 and Musca domestica Lysozyme
Peng Chuanlin 1，2 Wei Chuanchuan1 Wu Jianwei1 Wang Yu1，3 Xiu Jiangfan1 Shang Xiaoli 1 Zhao Xuejun1
（1. Department of Parasitology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004 ；2. General Surgery of Wanbei Coal-electricity Group General
Hospital，Suzhou 234000 ；3. Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004）
Abstract: The aim of this study is to have bioinformatics analysis of Musca domesitca antifungal peptide-1（MAF-1）and lysozymeb
（LMZ）, also clone fused MAF-1-LMZ gene and have expression analysis of it. The encoding sequences of MAF-1 and LMZ were fetched from
GenBank, and the structures and functions of 2 proteins were analyzed and predicted. The gene MAF-1-LMZ was amplified by polymerase chain
reaction（PCR）, then was ligated into pET 28a and transformed into E. coli Origmi（DE3）competent cell, and induced with IPTG. The fusion
protein MAF-1-LMZ in the expression vector was analyzed by SDS-PAGE. The activity of the protein was validated by methods of small test tube
and doubling dilution. The open reading frame of the MAF-1-LMZ was 969 bp, encoding a putative protein consisting of 322 amino acids with
a predicted molecular weight of 35 468.6 Da and pI of 8.31, indicating the gene expressed in E. coli Origmi（DE3）successfully. The purified
target protein had the antifungal activity.
Key words: Musca domestica ；antifungal peptide-1 with Lysozyme ；recombinant expression ；sequence analysis
2015,31(5) 201彭传林等：家蝇抗真菌肽 -溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析
抗细菌融合蛋白质，近年来国内外先后报道了有关
抗菌肽类基因以及与其它相关基因融合的克隆和表
达［6-10］，Lu 等［11］报道了家蝇天蚕素与人溶菌酶融
合表达。但目前将家蝇的抗真菌肽 MAF-1 与抗细菌
的溶菌酶 LZM 进行融合表达未见报道。将二者构建
成融合蛋白质，使其具有真菌肽和溶菌酶的活性，
降低细菌的耐受性，对家蝇抗真菌肽和家蝇溶菌酶
作为新药研发具有重要意义。本研究利用酶切、连
接重组家蝇抗真菌肽 MAF-1 与家蝇溶菌酶 LZM 的
基因，对其编码的重组蛋白质 MAF-1-LMZ 结构特征
进行预测分析和克隆表达，旨在为进一步研究该重
组融合基因的功能奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 家蝇，由贵阳医学院寄生虫教研
室常规饲养 ；载体 pET-28a、大肠杆菌菌株 DH5α、
OrigmiB/DE3 由贵阳医学院寄生虫教研室常规保存。
1.1.2 主要试剂及设备 限制性内切酶 EcoR I、Hi-
nd III 及 Xho I、T4 连 接 酶、rTaq 酶、DNA Marker、
Protein Marker、PCR 产 物 胶 回 收 试 剂 盒、DNA 产
物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购于大连宝
生物科技公司 ；其他试剂均为国产分析纯。PCR 扩
增仪（德国 Eppendorf 公司）；稳压稳流电泳仪（美
国 GE 公司）；紫外分光光度计（美国 GE 公司）；
Millipore 0.22 μm/0.45 μm 滤器（美国 Merck Millipore
公司）；Milli-Q 超纯水仪（法国 Mill-ipore Pharmacia
公司）。
1.1.3 引物合成和 DNA 测序 基因扩增引物和重组
质粒 DNA 测序由上海生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 MAF-1、LMZ 基因的识别 利用美国国家生
物 技 术 信 息 中 心（National Center for Biotechnology
Information，NCBI，http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）
网站的 ORF Finder（开放阅读框探寻器）确定其完
整编码序列和编码的氨基酸序列。利用瑞士生物
信息学研究所的蛋白分析专家系统（Expert Protein
Analysis Systerm，ExPASy，http ：//ca.expasy.org/）
Proteomics Server（http ：//ca.expasy.org/）所提供的蛋
白质在线分析工具，如 protparam（http ：//au.expasy.
org/tools/protparam.html） 预 测 氨 基 酸 序 列 的 分 子
量、等电点、稳定性指数等理化性质 ；InterPro Scan
（http ：//www.ebi.ac.uk/InterProScan/） 预 测 氨 基 酸
序 列 中 的 功 能 域 ；Sec（https ：//www.predictprotein.
org/upgrade/Sec/）预测氨基酸序列中的拓扑结构。
1.2.2 MAF-1-LMZ 融合基因的扩增 利用 prmer5.0
软件，根据 GenBank 获得家蝇抗真菌肽（登录号 ：
HM178948）和家蝇溶菌酶（登录号 ：XP_0051784-
89.1）基因序列和 pET-28a 多克隆位点设计特异性引
物。 引 物 为 ：MAF-1 F ：5-GGAATTCGAATCTGCC-
CCCGCCCCTGAGGT-3，MAF-1 R ：5-CCCAAGCTT-
GGCATGGGGCTTCATTTCCTTGGC-3，下划线为 EcoR
I 和 Hind III 限制性酶切位点 ；LMZ F ：5-GCCAAG
CTTATGTACAACATTTCTGGTT-3，LMZ R：5-CGGC
TCGAGTCAAAAACAATCATCAACACT-3，下划线为
Hind III 和 Xho I 限制性酶切位点。
从家蝇 3 龄幼虫提取 RNA，逆转录 cDNA 为模
板分别进行 PCR 扩增。MAF-1 PCR 条件 ：94℃预变
性 5 min ；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 个
循环 ；72℃延伸 10 min。LMZ PCR 条件 ：94℃预变
性 5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30 个
循环 ；72℃延伸 10 min。扩增产物用 2% 琼脂糖凝
胶电泳回收。
1.2.3 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将回收的
目的基因 MAF-1、LMZ 及表达载体 pET-28a 分别用
限制性内切酶 EcoR I 和 Hind III ；Hind III 和 Xho I ；
EcoR I 和 Xho I 进行双酶切。并将目的基因酶切产物
按一定比例与表达载体 pET-28a 酶切产物连接过夜，
转化大肠杆菌 OrigmiB/DE3 感受态细胞，卡那霉素
筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行 PCR、双
酶切和测序鉴定。
1.2.4 MAF-1-LMZ 在 大 肠 杆 菌 Origmi/DE3 中 的 诱
导表达 取 50 μL 培养过夜的阳性克隆菌液，加入
含卡那霉素的 5 mL LB 培养基中（菌液 / 培养基为
1/100），37℃，250 r/min 振摇至 OD600 为 0.6 时，加
入 IPTG 至终浓度 0.25 mmol/L 诱导表达 16 h。离心
收集菌体，在沉淀中加入 80 mL 1×SDS-PAGE 上样
缓冲液，煮沸 8-10 min，12 000 r/min 离心取上清 10
μL 进行 15% SDS-PAGE 分析。
1.2.5 重组蛋白的大量诱导、纯化 按照上述方法
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5202
对阳性克隆进行大量诱导表达，离心收集菌体，按
每克菌体加入 3 mL 细菌细胞壁裂解液重悬菌体，反
复冻融后冰上超声裂解（功率 150 W，持续 1 s，停
3 s，共 180 s），4℃，12 000 r/min，离心 20 min 后
收集上清，分别取上清和沉淀样品处理后进行 SDS-
PAGE 判断该重组蛋白的可溶性。收集上清，用 0.45
μL 滤膜过滤，参照镍离子金属螯合剂亲和层析柱说
明书进行蛋白纯化，收集蛋白洗脱液，再将洗脱的
目的蛋白在 PBS 透析液（pH7.4）中 4℃透析 24 h。
并根据说明书，用 Bradford 法对经过以上步骤获得
的重组蛋白进行蛋白定量，于 -80℃保存备用。
1.2.6 重组蛋白质 MAF-1-LMZ 抗真菌活性检测 将
白色念珠菌 Candida albicans ATCC10231 制备成新
鲜的菌悬液每毫升含 1×107 个菌细胞。在无菌的 96
孔细胞培养板中进行，分别于每孔中加入 50 μL 灭
菌双蒸水后，向第一孔加入 50 μL 纯化后的重组蛋
白质，混匀后从第一孔中吸取上述混合液 50 μL 加
入到第二孔，以此类推做倍比稀释，再向每孔中加
入菌悬液 50 μL，设置无菌蒸馏水为阴性对照，氟康
唑为阳性对照，充分混匀后于 30℃培养 24 h，取培
养物接种至培养基中 30℃培养 24 h 后，观察有无菌
落生长并对菌落计数。
2 结果
2.1 MAF-1-LMZ基因序列及蛋白质理化性质预测
MAF-1 基因编码序列包含一个完整的开放阅
读框（ORF）为 537 bp，编码 178 个氨基酸 ；LMZ
基因编码序列包含一个完整的 ORF 为 435 bp，编
码 145 个氨基酸。融合基因 MAF-1-LMZ 编码序列
包含的 ORF 为 969 bp，编码 322 个氨基酸（图 1）。
ExPASy 中 ProtParam 预测 MDLMZ 的理论分子量为
35 468.6 Da，等电点为 8.31。280 nm 处的摩尔消光
系数为 39 460 M-1 cm-1，0.1% 浓度的 ABS 为 1.098。
若其成熟肽 N-末端为蛋氨酸时，预测在哺乳动物
网状细胞体外表达的半衰期为 30 h，在酵母和大肠
976
901
826
751
676
601
526
451
376
301
226
151
76
1
方框内为内切酶序列及增加的氨基酸残疾 ；下画线为 MAF-1 序列 ；虚线为 LMZ 序列
图 1 MAF-1-LMZ 序列及其 ORF 编码的氨基酸序列
2015,31(5) 203彭传林等：家蝇抗真菌肽 -溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析
杆菌中表达的半衰期分别 >20 和 10 h。预测 MAF-
1-LMZ 在溶液中不稳定指数为 32.29，低于阈值 40，
其性质稳定 ；MAF-1-LMZ 的疏水指数为 85.22，疏
水性较高。
2.2 MAF-1-LMZ亚细胞定位分析ExPASy中TargetP
预测
MAF-1-LMZ 有信号序列，在第 18 和 19 个氨基
酸之间有断裂点，提示 MAF-1-LMZ 在细胞外分泌，
未发现线粒体、过氧化酶体、溶酶体和细胞核等亚
细胞定位序列。
2.3 InterPro Scan分析MAF-1-LMZ蛋白质结构域
结果显示，家蝇抗真菌肽 MAF-1-溶菌酶（LZM）
融合蛋白中分别含有抗真菌肽 MAF-1 的结构域（1-
178 aa），功能结构域（128-153 aa），是一全新的昆
虫抗真菌肽 ；溶菌酶（LZM）功能域（182-322 aa），
活性位点位于 232-250 aa，属于溶菌酶超家族。
2.4 蛋白质拓扑结构分析Sec预测
α 螺旋（H）和无规卷曲（L）比例是 37.67∶
53.99，β 折叠（E）和无规卷曲（L）比例是 8.34∶
53.99，二级结构以 α 螺旋（H）为主。预测每个氨
基酸的溶剂可及性（solvent accessibility，Acc），超
过 16% 的表面暴露的定义为暴露氨基酸（e），其余
氨基酸为包埋氨基酸（b）。从分析结果来看，一部
分氨基酸残基（39.63%）包埋在蛋白质内部，一部
分氨基酸残基（44.91%）暴露在溶液界面。
2.5 pET28a-MAF-1-LMZ质粒构建及鉴定
特异性引物分别扩增目的基因 MAF-1、LMZ，2%
琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的基因，获得约 534
bp 的 MAF-1 和 435 bp 的 LMZ 两个片段。将重组质
粒 pET28a-MAF-1-LMZ 进 行 PCR 和 双 酶 切 后 约 在
1 000 bp 有一清晰的条带，与目的基因（969 bp）的
大小基本相符（图 2），测序结果证实重组质粒中插
入序列正确，表明重组质粒构建成功。
2.6 蛋白表达纯化结果
将 构 建 好 的 重 组 质 粒 pET28a-MAF-1-LMZ 转
化到 E.coli OrigmiB/DE3 中经 IPTG 诱导表达，15%
SDS-PAGE 分析结果（图 3 第 5、6 泳道）显示，约
在 35 kD 左右处出现目的表达条带。将蛋白进行纯
化，结果如图 4 第 7 泳道所示，证明目的蛋白纯化
成功。Bradford 法测得该蛋白浓度为 0.37 mg/mL。
2000
bp
M 1 2 3 4 5
1000
750
500
250
M ：2000 bp DNA Marker ；1-3 ：分别为 ：LMZ、MAF-1、MAF-1-LMZ PCR 产
物 ；4 ：双酶切鉴定结果 ；5 ：重组质粒 pET28a-MAF-1-LMZ
图 2 重组质粒 PCR 及双酶切鉴定
97.2
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M ：蛋 白 Marker ；1 ：pET28a 未 加 IPTG 诱 导 ；2 ：pET28a 加 IPTG 诱 导 ；
3 ：pET28a-MAF-1-LMZ 未经 IPTG 诱导的 OrigmiB/DE3 全菌液 ；4 ：pET28a-
MAF-1-LMZ 加 IPTG 诱 导 的 OrigmiB/DE3 全 菌 液 ；5 ：pET28a-MAF-1-LMZ
加 IPTG 诱导后的沉淀 ；6 ：pET28a-MAF-1-LMZ 加 IPTG 诱导后的上清 ；7 ：
pET28a-MAF-1-LMZ 加 IPTG 诱导表达后纯化蛋白
图 3 SDS-PAGE 分析 pET28a-MAF-1-LMZ 表达纯化效果
2.7 重组蛋白质MAF-1-LMZ抗真菌活性
以白色念珠菌（ATCC10231）为指示菌，采用
Quantity One 克隆菌落计数法检测重组蛋白质 MAF-
1-LMZ 的 抗 真 菌 活 性。 结 果（ 表 1， 图 4） 显 示，
100 μg/mL 的重组蛋白质 MAF-1-LMZ 具有明显的抗
真菌活性。
表 1 重组蛋白质 MAF-1-LMZ 的抗真菌效果
样品 浓度 /（μg·mL-1） 菌落数 / 个（x-±s）
重组 MAF-1-LZM 100 147±9*
空白对照（ddH2O） 0 2831±79
重组 MAF-1 70 245±12*
注 ：* 与阴性对照相比 P<0.05
3 讨论
抗真菌制剂的活性及选择性是由其与真菌相互
作用的方式决定的。白色念珠菌是临床常见致病菌，
白色念珠菌细胞壁结构复杂，细胞壁厚约 25 μm，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5204
切后连接起来。此方法简便易行，因不需要在基因
序列上引入氨基酸组成的多肽接头序列，从而减少
了蛋白酶的攻击［21-24］。
本研究根据 GenBank 中家蝇抗真菌肽与溶菌酶
基因分别设计特异性引物，以家蝇 3 日龄幼虫提取
总 RNA 后逆转录 cDNA 为模板，分别成功扩增出目
的基因，测序结果证实与 GenBank 获得家蝇抗真菌
肽（登录号 ：HM178948）和家蝇溶菌酶（登录号 ：
XP_005178489.1）序列相符，通过生物信息学分析
显示该基因序列的 ORF 为 969 bp，编码 322 个氨基
酸，理论分子量为 35 468.6 Da，等电点为 8.31。所
构建的重组质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定成功。
SDS-PAGE 结果表明家蝇抗真菌肽 - 溶菌酶在大肠
杆菌 OrigmiB/DE3 中成功表达。重组质粒在大肠杆
菌 OrigmiB/DE3 中经 IPTG 诱导表达，并成功纯化目
的蛋白，15% SDS-PAGE 分析显示纯化蛋白与目的
蛋白分子量大小相符。抗真菌活性检测结果显示，
重组融合蛋白质 MAF-1-LMZ，其浓度在 100 μg/mL
时具有明显的抗真菌活性。说明重组融合蛋白质在
诱导表达过程中没有降解失活，并证实融合蛋白质
具有抗真菌活性，此研究结果与刘文丽等［25］报道
蛋白质保守结构域与抗菌活性相关，以及胡国强等
揭示了构 - 效相关是一致的［26］。这为进一步研究新
型抗菌融合蛋白 MAF-1-LMZ 的生物学活性及产业化
开发奠定了基础。
4 结论
本研究成功构建 pET-28a-MAF-1-LMZ 重组原核
表达载体并表达出融合 MAF-1-LMZ 蛋白，对纯化条
件进行了初探，获得了纯度较高的目的蛋白。实验
显示重组融合蛋白 MAF-1-LMZ 具有抗真菌活性。
参 考 文 献
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A B C
A ：重组 MAF-1（70 μg/mL）；B ：阳性对照 ；C ：阴性对照
图 4 重组蛋白质 MAF-1-LMZ 抗真菌活性检测
约占细胞干重的 25%，是一种坚韧的结构。其化学
组分较特殊，主要由内层的葡聚糖、中间的蛋白质
分子及外层的甘露聚糖组成。细胞壁上还含有少量
类脂和几丁质。葡聚糖是白色念珠菌细胞壁含量最
高的多糖。大量葡聚糖分子聚集，形成了念珠菌细
胞壁的纤维网络结构［12-14］。溶菌酶主要是通过破坏
细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖之间的
β-1，4 糖苷键，使菌体细胞壁出现缺口或被溶解，导
致内容物外流，从而达到抑制菌体生长或杀灭菌体
的作用。抗真菌肽 MAF-1 吸附在白色念珠菌细胞表
面，通过在真菌细胞质膜上形成通道后，进入细胞
逐步在细胞内聚集。抑制真菌生物膜的形成，破坏
菌体细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄、细胞
核碎裂，细胞器结构紊乱［15，16］。另有研究表明，溶
菌酶与抗真菌肽具有协同作用，可能是抗真菌肽破
坏细菌外膜后利于溶菌酶作用于其细胞壁［17，18］。临
床上联合应用抗菌药物治疗真菌感染已成共识，其
理论基础是联合不同药物在体内的协同作用，增强
杀菌作用，减少单药在体内作用的剂量依赖性，减
少药物的毒副作用。本研究在联合用药的理论基础
上，通过基因重组表达，将 MAF-1、LMZ 构建成融
合蛋白，利用融合蛋白协同作用，更好地发挥其生
物学活性。
将目的蛋白在核酸水平上连接，一种连接方法
是根据表达载体上的酶切位点在目的基因两端分别
引入限制性酶切位点，两端各有限制性酶切位点供
目的基因插入连接。另一种连接方法是通过 PCR 合
成，采用低疏水性及低电荷效应的氨基酸组成的多
肽接头序列直接包含在重组目的基因当中，称为
Gene SOEing［19，20］。本研究采用前者，将限制性酶
切位点分别设计在待扩增的引物中，分别扩增获得
目的基因，将待融合的两个扩增产物用限制性酶酶
2015,31(5) 205彭传林等：家蝇抗真菌肽 -溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析
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（责任编辑 马鑫）