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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
百合花朵硕大、花色艳丽、花姿优雅，既是世
界五大鲜切花之一，又适合盆栽及庭园绿化。但是
百合花药大，花粉多，污染性强，人工去除鲜切花
的花药费时费力。同时，百合花多为单瓣，花型单
一。无花粉重瓣是百合育种的一个重要目标。但是
种质资源的匮乏，给通过传统的杂交育种获得无花
粉、重瓣品种带来了困难。分子育种可以通过改变
收稿日期 ：2013-10-18
基金项目 ：国家高技术发展计划（“863”计划）（2006AA10Z187），公益性行业（农业）科研专项（201203071）
作者简介 ： 李云华，女，硕士研究生，研究方向 ：百合种质资源与生物技术 ；E-mail ：liyunhua@cau.edu.cn ；刘青同为本文第一作者
通讯作者 ：刘青林，男，博士，副教授，研究方向 ：园林植物种质资源与遗传育种 ；E-mail ：liuql@cau.edu.cn
LfMADS1 基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化
李云华  刘青  刘青林
（中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193）
摘 要 ： 为了获得无花粉、重瓣百合新种质，以新铁炮百合‘Raizen No.1’的离体小鳞片为受体，探讨了不同水平的抗生素
和抑菌素对小鳞片再生能力的影响 ；利用正交试验对预培养时间、菌液浓度、侵染时间和共培养时间等 4 个因素的不同水平进行
了筛选，优化了遗传转化体系 ；进行了百合花器官特性基因 LfMADS1 的转化，并对转基因植株进行了分子生物学检测。结果表明，
新铁炮百合小鳞片选择培养时抗生素卡那霉素（Kan）浓度为 100 mg/L，抑菌素为羧苄青霉素（Carb）浓度为 500 mg/L。正交试验
结果表明共培养时间是遗传体系中的主要影响因子 ；小鳞片转化的最佳条件是预培养 1 d、侵染 10 min、共培养 5 d、菌液 OD600 值
0.8。PCR 检测的结果，得到 4 株转 LfMADS1 反义基因的新铁炮百合株系，其中 1 株已通过 PCR-Southern 检测。
关键词 ： 小鳞片 农杆菌介导转化 卡那霉素 羧苄青霉素 正交试验
Study on Genetic Transformation of LfMADS1 Gene into Lilium× ×
formosanum ‘Raizen No.1’
Li Yunhua Liu Qing Liu Qinglin
（Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193）
Abstract:  In order to create pollen-free double flowers, the in vitro bulblet scales of Lilium × formosanum‘Raizen No. 1’were
taken as explants, the effects of Kan and Carb on regeneration from bulblet scales were studied at first. Then a orthogonal test were conducted
to screening such factors as pre-culture time, bacterial concentration, infection time and co-culture time, and in this way the transformation
system was optimized. Through this system, LfMADS1 gene was transferred into bulblet scales mediated by Agrobacterium, and the transgenic
plants were molecularly identified. The results indicated that Kan 100 mg/L was optimal to screen adventitious buds of Kan-resistant ；Carb 500
mg/L was able to control growth of Agrobacterium. There are some key points include pre-culture for 1d, immersion of explants into bacterial
suspension（OD600 0. 8）for 10 min, and co-cultivate for 5 d in the optimized transformation system. Four transgenic lines were obtained through
this system identified by PCR, in which the exogenous gene had successfully integrated into genome of one line confirmed by PCR-Southern.
These transformed lilies can be a new germplasm for the breeding of pollen-free or double flower lilies.
Key words:  Bulblet scales Agrobacterium-mediated transformation Kanamycin Carbenicillin Orthogonal test
植物花粉发育及花器官发育相关基因的表达，抑制
花粉的发育或改变花器官发育方向，从而获得无花
粉重瓣百合。百合遗传转化体系以直接再生方式为
主，仅有少数通过胚状体和原生质体获得再生植株
的报道［1，2］。百合遗传转化中采用农杆菌介导法较
多。刘菊华等［3］用携带有几丁质酶基因和 β-1，3
葡聚糖酶基因，以鳞片为受体，通过农杆菌介导法
2014年第3期 87李云华等 ：LfMADS1 基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化
得到了转基因植株。Mercuri 等［4］以花梗和花托为
外植体诱导出了胚性愈伤组织，利用农杆菌介导法
成功导入了 rol A、B、C 基因，并得到了表型改变
的植株。余桂红等建立了东方百合品种‘西伯利
亚’的农杆菌介导受体系统，卡那霉素（Kan）的
筛选浓度小叶块确定为 100 mg/L，而小鳞茎块确定
为 125 mg/L ；羧苄青霉素（Carb）抑菌浓度确定为
300-400 mg/L［5］。Hoshi 等［6］利用携带双元载体农
杆菌 EHA101\ pIG121 转化百合花丝诱导的愈伤组织
得到转化植株，并通过了 GUS 组织化学检测和反义
PCR 检测。王进忠等［7］以叶片诱导的愈伤为受体，
利用农杆菌介导法成功将美洲商陆抗菌蛋白 PAP 转
入到百合中。Benedito 等［8］向百合中导入拟南芥的
SUPERMAN 基 因， 经 Northern 杂 交 证 明 了 报 告 基
因 Pat 和花发育基因 SUPERMAN 都在转基因植株上
有所表达。陈莉等［9］以麝香百合‘White Elegance’
叶片为受体，将 Mn-SOD 基因导入百合中，以直接
再生为主产生抗性植株。Kim 等［10］将花粉创伤后
用农杆菌进行侵染，植物表现正常。李邱华等［11］
以新铁炮百合无菌苗小鳞片为外植体利用农杆菌介
导法成功导入了花药发育相关基因 Zm401，经 PCR
和 PCR-Southern 检测证实，Zm401 已经成功地整合
到转化植株基因组中。刘毅等［12］以百合的鳞片和
小叶块作为农杆菌介导的基因转化的受体材料，所
用头孢霉素（Cef）的浓度以 400 mg/L 最好。潮霉素
（Hyg）筛选鳞茎的亚致死浓度为 14 mg/L，Hyg 筛选
小叶块的亚致死浓度为 18 mg/L。张栋等［13］以麝香
百合‘White-elegance’叶片为受体，通过根癌农杆
菌介导的方法将 DHAR 基因转入百合，对转基因百
合进行 PCR 检测，初步表明 DHAR 基因已整合到
百合基因组中。也有采用基因枪法转化百合的报道，
如 Watad 等［14］通过基因枪法转化百合，得到了的
55 株抗性苗中 19 株有呈 PCR 阳性，但是其中只有
3 株通过 Southern 检测为转基因植株。外源基因转
化常用的还有花粉管通道法［15］。可见，百合遗传转
化中常用的抗生素多选用 Kan 和 Hyg，抑菌素多选
用 Carb 和 Cef，百合遗传转化的受体材料以愈伤组织、
小鳞片、叶片或花粉为受体，外源基因包括花发育、
花药发育、根发育、抗菌抗虫蛋白等基因，多通过
GUS 染色、PCR、Northern 或 Southern 检测，有的还
得到了转基因表型。
目前，人们已从百合中分离出来的基因包括花
粉发育、花发育、花期、叶片发育、花色和延缓衰
老的基因［1，8，16-21］。从百合中克隆得到了两个花发
育基因 LfMADS1 和 LfMADS3，并构建了两基因的正、
反义表达载体，采用农杆菌介导法将两基因的正、
反义载体转化烟草，引起了一系列表型变化，两基
因分别表现出 B 基因的功能和 E 基因的功能，对变
异烟草的自交一代植株进行了 PCR-southern 检测［22］。
本试验对以小鳞片为受体农杆菌介导的百合遗传转
化体系进行优化，建立农杆菌介导的百合遗传转化
体系，为获得 LfMADS1 和 LfMADS3 正、反义基因的
转基因百合，创造新的百合种质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受体和菌株 新铁炮百合‘雷山 1 号’无菌
苗经鳞片离体培养获得，剥取无菌苗中间层小鳞片
作为受体。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）
菌株 LBA4404，含质粒 pBin438，载体中含有携带
CaMV35S 启动子驱动的 LfMADS1，3 基因［22］。
1.1.2 培养基 MS 培养基，各培养基中附加蔗糖
3%，琼脂粉 0.85%，将 pH 调到 5.8，121℃高压灭
菌 20 min。 培 养 条 件 为（25±2）℃、 光 强 1 500-
2 000 Lx、光周期 16 h 光 /8 h 暗。主要培养基配方为，
预培养培养基 MS+6-BA 1.0+NAA 0.5 ；共培养培养基
MS（去掉大量中的 NH4NO3）+ 6-BA 1.0 + NAA 0.5 +
AS 100 μmol/L+MES 10 mmol/L ；筛选培养培养基 MS
+ 6-BA 1.0 + NAA 0.5 + Kan100 mg/L+carb 500 mg/L ；
生根基本培养基为 MS + IBA 1.0+Kan 15 mg/L。农杆
菌培养基为 LB 固体培养基（多聚胰化蛋白胨 10 g/L，
酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 15 g/L）和 LB
液体培养基（多聚胰化蛋白胨 10 g/L，酵母提取物
5 g/L，NaCl 10 g/L）。培养基 pH 值均调至 7.0，在
120℃下高压灭菌 25 min。灭菌后加入 Rif 25 mg/L，
Kan 50 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 抗生素浓度选择 在 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA
0.5 mg/L 的培养基中添加抗生素 Kan（0、25、50、
75、100、125 和 150 mg/L）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期88
1.2.2 抑菌素浓度选择 抑菌素 Carb、Cef，其浓度
均设为 0、200、300、400、500 和 600 进行抗敏感
性试验。样本数 50，3 次重复。每 3 周转接 1 次，
观察并记录受体形态及不定芽诱导情况。
1.2.3 正交试验 采用 L25（5
4）正交设计，通过方
差分析和极差分析，研究预培养、侵染时间、共培
养、菌液 OD600 值 4 个因素对百合遗传转化的影响
（表 1）。
表 1 正交试验表头设计
水平 预培养（A）
（d）
侵染时间（B）
（min）
共培养（C）
（d）
菌液 OD600 值
（D）
1 0 5 1 0.2
2 1 10 3 0.4
3 3 15 5 0.6
4 5 20 7 0.8
5 7 25 9 1.0
1.2.4 转基因植株的 PCR 检测 采用小量碱法提取
质粒 DNA，CTAB 法提取百合 DNA。将提取的百合
DNA 作为 PCR 的模板。以 LFMADS1 反义植物表达
载体的引物（GCGTCGACTAGACTAGCTGAAACAAC）
下 游（CGGGATCCAGATTCAGCATAAAACCAC） 进
行 PCR 扩增，同时设质粒阳性、未转基因植株作为
对照。25.0 μL PCR 反应体系包含模板 DNA2.0 μL，2
种引物各 1.0 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0
μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 mmol/L 10×PCR buffer 2.5
mmol/L。PCR 扩增程序为 94℃ 变性 4 min，然后依
次在 94℃变性 30 s、50℃退火 30 s、72℃ 延伸 30 s
的条件下循环 30 次，最后在 72℃延伸 10 min。PCR
依次加入反应物，混匀后以 20 μL 矿物油覆盖。
1.2.5 转基因植株的 PCR-Southern 检测 50 μL 的
探针体系包括 DNA Ploymerase1 μL，［α-32P］dCTP3
μL，Nuclease-Free BSA2 μL，denatured DNA template
0.5 μL，dNTP（无 dCTP）2 μL，Labeling 5×Buffer10
μL。［α-32P］dCTP、DNA Ploymerase 在同位素室加入。
2 结果
2.1 抗生素和抑菌素浓度对百合小鳞片再生能力
的影响
将外植体接种于添加不同浓度 Kan 的再生培养
基中，接种 20 d 后观察抗生素对不定芽再生及外植
体生长的影响。随着抗生素浓度的增加，不定芽的
再生率降低（表 2）。当 Kan 的浓度大于 75 mg/L 时，
不定芽的诱导率急剧下降 ；Kan 为 100、125 mg/L
时，诱导率为 5.3%、0，并且 Kan 为 125 mg/L 时，
外植体切口处褐化严重（图 1），因此，选 Kan 为
100 mg/L 作为筛选抗生素的浓度。在抗性芽生根过
程中加入 Kan 会抑制根的发生，根发生量少，且随
着培养时间增加根逐渐变黑，因此在移栽前可以去
掉 Kan。
表 2 新铁炮百合小鳞片对抗生素 Kan 的敏感性
浓度（mg/L） 接种数 分化数 平均诱导率（%）
0 150 150 100a
25 150 136 90.7b
50 150 116 77.3c
75 150 49 32.7d
100 150 8 5.3e
125 150 0 0f
150 150 0 0f
不同字母表示具有显著性差异（P<0.05）
将外植体接种于添加不同浓度 Carb 和 Cef 的再
生培养基中，20 d 后观察抑菌素对不定芽再生及外
植体生长的影响。结果（表 3）表明，Carb 对于不
定芽的诱导率没有影响，当浓度达到 600 mg/L 时，
不定芽的诱导率仍达 90.0%。Carb 对于不定芽的生
长有促进作用，生长状态优于对照，不定芽的基部
还产生了丰富的根（图 2）。而 Cef 对不定芽的诱导
有一定的抑制作用，Cef 的浓度高于 300 mg/L 时，
不定芽的诱导率下降（表 3），并伴随褐化现象的产
生（图 3）。由此可见，Carb 对不定芽诱导及生长的
CK 25 50 75 100 125 150
图 1 Kan 浓度（mg/L）对新铁炮百合不定芽诱导的影响
2014年第3期 89李云华等 ：LfMADS1 基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化
影响远远小于 Cef，百合遗传转化中应选择 Carb 为
抑菌素，浓度为 500 mg/L。
表 3 新铁炮百合小鳞片对抑菌素 Carb、Cef 的敏感性
种类 浓度（mg/L） 接种数 分化数 平均诱导率（%）
Carb 0 150 150 100a
200 150 150 100a
300 150 150 100a
400 150 147 98.0b
500 150 150 100a
600 150 135 90.0c
Cef 0 150 150 100a
200 150 150 100a
300 150 146 97.3b
400 150 134 89.3c
500 150 124 82.7d
600 150 116 77.3e
不同字母表示具有显著性差异（P<0.05）
2.2 影响农杆菌生长的因素
农 杆 菌 培 养 2 d 后，pH7.0 和 添 加 10 mmol/L
MES［2-（N-吗啉）乙磺酸］的 pH 5.8 的 LB 固体培
养基上农杆菌生长量大（图 4-A，图 4-C），而 pH5.8
的 LB 固体培养基上农杆菌的生长量远小于前两者
（图 4-B）。可见，pH 值和 MES 对农杆菌的生长均有
影响。
受体与农杆菌共培养 3 d 后，在无任何处理的
培养基上，百合小鳞片周围无菌斑（图 5-A）；去除
MS 大量中 NH4NO3 后，小鳞片周围有农杆菌生长，
但菌斑不明显（图 5-B）；去除 NH4NO3 并添加附加
物 MES，小鳞片周围农杆菌生长量大，菌斑明显（图
5-C）。可见，去除共培养基中的 NH4NO3 并添加附
加物 MES 有利于农杆菌的生长。
图 2 Carb 浓度（mg/L）对新铁炮百合不定芽诱导的影响
图 3 Cef 浓度（mg/L）对新铁炮百合不定芽诱导的影响
CK 200 300 400 500 600
CK 200 300 400 500 600
A B C
A ：pH 7.0 ；B ：pH 5.8 ；C ：pH 5.8，添加 MES10 mg/L
图 4 MES 对农杆菌生长的影响
A B C
A ：M S + 6 - B A 1 . 0 + N A A 1 . 0 + A S 1 0 0 μm o l / L ；B ：M S （ n o N H 4N O 3）
+6-BA1.0+NAA1.0+AS100 μmol/L ；C ：MS（no NH4NO3）+6-BA1.0+NAA1.0+
AS 100 μmol/L +MES 10 mmol/L
图 5 共培养阶段不同培养基对农杆菌生长的影响2.3 影响转基因百合抗性芽分化、生根的因素
在影响百合抗性芽诱导的 4 个因子中，其效应
的大小依次是共培养时间（FC=5.335 2）> 预培养时
间（FA=1.961 4）> 侵染时间（FB=1.359 1）> 菌液浓
度（FD=1.1229）。共培养时间对百合抗性芽诱导率
的影响与其他 3 个因子存在显著性差异（P=0.021 6<
0.05），可见影响百合抗性芽诱导率的主要因子为共
培养时间。在共培养时间的 5 个水平中，共培养时
间为 5 d 时与其他水平存在极显著差异（P= 0.0058<
0.01）（表 4）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期90
表 4 新铁炮百合遗传转化条件筛选 L25（5
4）试验结果
处理 A B C D 接种数 抗性分化数 抗性分化率（%） 平均抗性小苗数 生根率（%）
1 1（0） 1（5） 1（1） 1（0.2） 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
2 1 2（10） 2（3） 2（0.4） 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
3 1 3（15） 3（5） 3（0.6） 300 4 1.33ABab 2.00（8）ab 0.67（2）abc
4 1 4（20） 4（7） 4（0.8） 300 2 0.67ABb 1.50（3）ab 0.33（1）bc
5 1 5（25） 5（9） 5（1.0） 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
6 2（1） 1 2 3 300 2 0.67ABb 2.00（4）ab 0.00c
7 2 2 3 4 300 8 2.67Aa 1.75（14）ab 1.33（4）a
8 2 3 4 5 300 4 1.33ABab 1.50（6）ab 0.67（2）abc
9 2 4 5 1 300 2 0.67ABb 1.00（2）ab 0.00c
10 2 5 1 2 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
11 3（3） 1 3 5 300 1 0.33ABb 2.00（2）ab 0.00c
12 3 2 4 1 300 2 1.67ABab 1.20（6）ab 1.00（3）ab
13 3 3 5 2 300 1 0.33ABb 2.00（2）ab 0.00c
14 3 4 1 3 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
15 3 5 2 4 300 2 0.67ABb 2.50（5）a 0.33（1）bc
16 4（5） 1 4 2 300 1 0.33ABb 2.00（2）ab 0.00c
17 4 2 5 3 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
18 4 3 1 4 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
19 4 4 2 5 300 3 1.00ABb 1.67（5）ab 0.00c
20 4 5 3 1 300 3 1.00ABb 2.33（7）a 1.00（3）ab
21 5（7） 1 5 4 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
22 5 2 1 5 300 0 0.00Bb 0.00b 0.00c
23 5 3 2 1 300 2 0.67ABb 1.50（3）ab 0.67（2）abc
24 5 4 3 2 300 2 0.67ABb 2.00（4）ab 0.67（2）abc
25 5 5 4 3 300 1 0.33ABab 2.00（2）ab 0.00c
总 7500 40 75 20
抗 性
芽 诱
导 率
K1 0.40 0.26 0.00Bc 0.78
K2 1.06 0.87 0.59ABabc 0.28
K3 0.61 0.73 1.19Aa 0.47
K4 0.47 0.59 0.86ABbc 0.8
K5 0.32 0.40 0.2ABbc 0.53
极差 R 0.74 0.61 1.19 0.53
RC（1.19）>RA（0.74）>RD0.53>RB0.61
共培养时间 > 预培养时间 > 侵染时间 > 菌液 OD600 值
抗 性
芽 分
化 系
数
K1 0.68 1.20 0 Cb 1.22
K2 1.27 0.59 1.53ABa 1.2
K3 1.54 1.42 2.03Aa 1.2
K4 1.21 1.21 1.64ABa 1.13
K5 1.10 1.38 0.6BCb 1.05
极差 R 0.86 0.83 2.03 0.16
RC（2.03）>RA0.86>RB0.83>RD0.16
共培养时间 > 预培养时间 > 侵染时间 > 菌液 OD600 值
抗性
植株
生根
率
K1 0.20 0.00b 0.00B 0.53
K2 0.40 0.47a 0.20AB 0.13
K3 0.27 0.40 0.73A 0.13
K4 0.20 0.20ab 0.40AB 0.40
K5 0.27 0.27ab 0.00B 0.13
RC0.73>RB0.46>RD0.40>RA0.20
共培养时间 > 侵染时间 > 菌液 OD600 值 > 预培养时间
2014年第3期 91李云华等 ：LfMADS1 基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化
在影响百合抗性芽分化系数的 4 个因子中，其
效应的大小依次是共培养时间（FC=8.796 6）> 侵染
时 间（FB=1.405 2）> 预 培 养 时 间（FA=1.242 9）>
菌液浓度（FD=0.059 1），共培养时间对百合抗性芽
分化系数的影响与其他 3 个因子存在极显著性差异
（P=0.005 0<0.01）。共培养时间为 5 d 时，与其他水
平存在极显著性差异（P=0.001 5<0.01）（表 4）。
在影响百合抗性植株生根率的 4 个因子中，其
效应的大小依次是共培养时间（FC=6.599 0）> 菌液
浓度（FD=2.471 4）> 侵染时间（FB=2.320 5）> 预培
养时间（FA=0.462 3），方差分析表明，共培养时间
对百合抗性植株生根率影响与其他 3 个因子存在显
著性差异（P=0.011 9<0.05），为主要影响因子。在
共培养时间的 5 个水平中，共培养时间为 5 d 时与
其他水平存在极显著差异（P=0.004 0<0.01）。在侵
染时间的 5 个水平中，侵染时间为 10 min 时与其他
水平存在着显著差异（P=0.034 8<0.05）（表 4）。虽
然影响百合抗性植株生根率的主要因子为共培养时
间，但同时也要注意侵染时间的选择，当侵染时间
为超过 20 min 时，虽然有抗性芽的产生但大部在生
根的时候死亡。
通过正交试验表明，对新铁炮百合遗传转化
影响最大的因子是共培养时间，遗传转化最佳条件
是预培养 1 d、侵染时间 10 min、共培养 5 d、菌液
OD600 值 0.8。本试验共获得 73 个抗性芽，获得 20
株生根的抗性植株（图 6）。
3 讨论
良好的受体系统是进行转化的前提和基础。百
合愈伤组织及胚状体是良好的受体但是其诱导受基
因型影响很大 ；而百合小鳞片直接再生不定芽较容
易，是建立百合遗传转化系统时最常用的一种再生
方式。本试验采用以百合离体小鳞片为受体，再生
频率高且取材容易，不受季节限制。目前以百合小
鳞片为受体，转基因成功的案例很多［11，23，24］。建
议建立百合胚性愈伤组织受体系统。胚性愈伤组织
起源于单细胞，能够避免嵌合体的出现，是理想的
基因转化受体。
抗生素对农杆菌具有杀伤或抑制作用，也会抑
制植物细胞的生长与分化。本试验比较了不同浓度
的 Kan 对新铁炮百合‘雷山一号’小鳞片再生的影响。
小鳞片在 100 mg/L 的 Kan 抑制下，不定芽的诱导率
为 5.3%，达到 125 mg/L 时，小鳞片伤口褐化无不定
芽的产生。因此，抗生素 Kan 的筛选浓度选择为 100
mg/L。由于百合基因型的不同，同样以小鳞片为受
体，但 Kan 的筛选浓度范围宽（50-150 mg/L），差
异大［11，24，25］。建议在今后的试验中，在起始筛选
时使用较低浓度的 Kan，当小鳞片分化出不定芽后，
再逐渐提高 Kan 的浓度进行筛选。
抑菌素能有效抑制农杆菌的生长，但不能影响
受体的分化、不定芽的生长。羧苄青霉素 Carb 对百
合离体叶片的再生几乎无毒害作用，适应的浓度范
围较宽，可以作为百合基因转化再生系统的抑菌抗
生素［26，27］。在本试验中发现 Carb 对小鳞片诱导不
定芽和不定根的形成有促进作用，而 Cef 对小鳞片
分化有抑制作用，且受体易褐化这与余桂红等［5］的
报道有所不同。
共培养基的改良（去除 NH4NO3）及附加物（MES）
A B C
A ：抗性芽 ；B ：非抗性芽 ；C ：生根的抗性植株
图 6 新铁炮百合抗性植株的筛选
2.4 转基因百合的分子检测
将获得的 20 株抗性植株提取基因组 DNA，进
行 PCR 检 测。 其 中 有 4 个 株 系 扩 增 出 了 与 阳 性
对 照 相 同 的 500 bp 大 小 的 条 带（ 图 7）。 经 PCR-
Southern 杂交进一步检测，只有 1 个株系将外源基
因 LfMADS1 反义基因整合到‘雷山 1 号’的基因组中。
M   1 2 3 4   1 2 3 4
500
bp
M ：DNA Marker ；+ ：质粒 ；- ：非转基因植株 ；1-4 ：转基因植株
图 7 新铁炮百合转 LfMADS1 反义基因抗性植株 PCR，
PCR-Southern 检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期92
的添加，有利于农杆菌的生长。较高的氨离子浓度
抑制农杆菌的生长，去除 MS 大量中的 NH4NO3 促进
了农杆菌的生长［6］。pH 值对于农杆菌的生长影响很
大，添加 MES 可以稳定培养基 pH 值，有利于农杆
菌的生长。本试验中去除大量元素中的硝酸铵并添
加 10 mmol/L MES，共培养 3 d 后，农杆菌生长旺盛，
这与 Ogaki 等［20］的报道是一致的。建议将共培养时
间缩短为 3 d，以防止农杆菌生长过盛，抑制小鳞片
的分化和对以后筛选过程中抑菌带来麻烦。
为了确定影响转化效率的关键因素及最佳转化
条件，采用了正交设计试验方法对预培养时间、侵
染时间、共培养时间和菌液浓度等影响转化的 4 种
因子进行了研究。试验表明，4 个因子对于抗性芽
诱导率、分化系数及生根率的效应是不同的，但起
主导作用的都是共培养时间。共培养阶段 Ti 质粒上
一系列的信号活化，对于转化十分重要，在植物的
遗传转化中，共培养时间至少为 16 h。以百合小鳞
片为受体，共培养时间选择在 2-7 d 之间，主要取
决于菌的生长［11，24，27，28］。对于抗性芽的诱导和分
化预培养时间和侵染时间也很重要。随着预培养时
间的延长，不定芽的诱导率和分化系数也在提高，
但是在筛选过程中大部分不定芽白化为假阳性芽，
预培养时间一般控制在 2-5 d。侵染时间不宜过长，
在 20 min 以内为宜，否则在筛选培养过程中，农杆
菌生长不好抑制，抗性芽生根率也会降低，这与储
俊等的报道一致［29］。
4 结论
本试验以新铁炮百合‘雷山一号’的小鳞片为
受体建立了遗传转化体系。确定了遗传转化过程中
选择抗生素 Kan 浓度为 100 mg/L，抑菌素为 Carb，
浓度为 500 mg/L。新铁炮百合‘Raizen No.1’遗传
化最佳条件是预培养 1 d、侵染时间 10 min、共培养
5 d、菌液 OD600 值 0.8。
在共培养时去除大量元素中的 NH4NO3 并添加
MES，对农杆菌的生长有一定的促进作用，并得了
转基因植株，在改良的共培养基上共培养 3 d 后菌
斑明显。
起始筛选时 Kan 的浓度选得较高，是造成转化
率低的重要因素。虽然在筛选 Kan 浓度时，Kan 浓
度达到 100 mg/L，小鳞片的诱导率仍为 5.3%，但是
小鳞片被农杆菌侵染后，小鳞片诱导不定芽周期变
长，诱导率也变低，Kan 与农杆菌都对小鳞片的分
化都起到了抑制作用。
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（责任编辑 狄艳红）